專利名稱：星形孢菌素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化合物合成的技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及一種利用發(fā)酵方法制備星形孢菌素的制備方法。
背景技術(shù)：
農(nóng)藥是解決世界糧食問(wèn)題，保證農(nóng)作·物穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)不可缺少的重要物資，同時(shí)也是一個(gè)能獲得巨大經(jīng)濟(jì)利益和社會(huì)效益的產(chǎn)業(yè)。然而，化學(xué)農(nóng)藥殘留所引起的環(huán)境污染、人畜中毒、病蟲(chóng)抗藥性增強(qiáng)等問(wèn)題日趨嚴(yán)重，大力研究、開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)和應(yīng)用生物農(nóng)藥，已成為全球農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新趨勢(shì)。目前世界各國(guó)正在采取實(shí)際步驟減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，如美國(guó)環(huán)保局曾宣布撤銷91種化學(xué)農(nóng)藥的登記；歐盟制定了減少一半化學(xué)農(nóng)藥使用量的五年和十年計(jì)劃。我國(guó)也將發(fā)展生物農(nóng)藥和綠色食品列入《中國(guó)21世紀(jì)議程》。因此，創(chuàng)制和開(kāi)發(fā)擁有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、高效、安全的生物農(nóng)藥是實(shí)現(xiàn)我國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的迫切需要。星形孢菌素由Omura等(1977)首次從S. staurosporeus代謝產(chǎn)物中分離，是一類口引哚生物堿類抗生素。隨后，S. actuosus、S. roseoflavus等從鏈霉菌中分離獲得。研究證明，星形孢菌素是一類非特異性蛋白激酶C抑制劑，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有抗腫瘤活性。目前，國(guó)外研究多集中于其生物活性及抗腫瘤、抗癌的機(jī)理。盡管Staurosporine是一種典型的三磷酸腺苷競(jìng)爭(zhēng)性激酶抑制劑，但由于其非特異性而限制了在臨床上的應(yīng)用，目前，已明確了該化合物的生物合成途徑，由于其結(jié)構(gòu)合成的復(fù)雜性和重要的生理活性而引起了眾多有機(jī)合成化學(xué)家的興趣，將其作為先導(dǎo)化合物開(kāi)發(fā)潛在的抗癌抗腫瘤潛在藥物將成為今后研究的重點(diǎn)。在植物病害防治研究方面，S. roseoflavus strain LS-A24產(chǎn)生的星形孢菌素對(duì)多種細(xì)菌和植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑制作用，且對(duì)辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)引起的辣椒疫病具有良好的防治作用。鏈霉菌是放線菌中產(chǎn)生抗生素種類最多的屬，目前，大約發(fā)現(xiàn)了 550種鏈霉菌，而且仍然有新的種在不斷被發(fā)現(xiàn)。在已發(fā)現(xiàn)的鏈霉菌中，只有少數(shù)種是植物病原菌，其中，瘡痂鏈霉菌是引起馬鈴薯瘡痂病的主要病原菌之一。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)馬鈴薯病原菌的研究主要集中在多樣性、致病性、毒素及其遺傳多樣性等方面，近年來(lái)國(guó)外已有報(bào)道將其作為有益菌株進(jìn)行開(kāi)發(fā)研究。在國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)將鏈霉菌作為生防菌株進(jìn)行研究的相關(guān)報(bào)道，因此，將該菌作為生防菌株進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化和代謝產(chǎn)物的分離純化等方面的研究具有重大的意義。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種星形孢菌素的制備方法。由瘡痂鏈霉菌許呂亞種產(chǎn)生的星形孢菌素對(duì)多種植物病原真菌具有很強(qiáng)的拮抗作用，對(duì)TMV也有較強(qiáng)的體外鈍化作用，具備作為農(nóng)用抗生素的開(kāi)發(fā)潛力。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案一種星形孢菌素的制備方法，所述的星形孢菌素的分子式為C28H26N4O3,結(jié)構(gòu)式為
權(quán)利要求
1.一種星形孢菌素的制備方法，所述的星形孢菌素的分子式為C28H26N4O3,結(jié)構(gòu)式為
2.權(quán)利要求I所述的星形孢菌素的制備方法，其特征在于發(fā)酵所述瘡痂鏈霉菌許呂亞種CGMCC No. 5213的培養(yǎng)基的組成為可溶性淀粉2wt %，黃豆餅粉4wt %，MgSO4O.075wt%, K2HPO4 O. IwtFeSO4 · 7H20 O. 001wt%，余量為水。
3.權(quán)利要求2所述的星形孢菌素的制備方法，其特征在于發(fā)酵所述瘡痂鏈霉菌許呂亞種CGMCC No. 5213的發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度28°C、轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵時(shí)間5d。
4.權(quán)利要求3所述的星形孢菌素的制備方法，其特征在于發(fā)酵所述瘡痂鏈霉菌許呂亞種CGMCC No. 5213的最佳發(fā)酵條件為初始pH 7.0,發(fā)酵溫度28°C，種子液種齡48h，接種量6wt%,轉(zhuǎn)速200r/min,發(fā)酵時(shí)間5d。
5.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的星形孢菌素的制備方法，其特征在于還包括分離純化步驟，并且其分離純化步驟發(fā)酵液經(jīng)無(wú)水乙醇預(yù)處理后，采用乙酸乙酯萃取，萃取液通過(guò)硅膠柱層析和硅膠薄層層析，層析液再經(jīng)高效液相。
6.權(quán)利要求5所述的星形孢菌素的制備方法，其特征在于所述的乙酸乙酯萃取步驟是指將3倍體積的乙酸乙酯加入到濃縮10倍的預(yù)處理發(fā)酵液中，然后動(dòng)態(tài)萃取2h，靜止30min，收集有機(jī)相，反復(fù)萃取3次，合并有機(jī)相，減壓蒸干得乙酸乙酯相，再用體積比為II的氯仿和甲醇混合溶液溶解有機(jī)相得到所述萃取液。
7.權(quán)利要求6所述的星形孢菌素的制備方法，其特征在于所述的硅膠柱層析步驟包括取柱層用硅膠，用無(wú)離子水浸泡3h，抽干；再用濃HCl洗滌除去殘留的鐵和鋁，然后用無(wú)離子水洗至中性，抽干，用無(wú)水乙醇浸泡過(guò)夜，抽干；120°C干燥至恒重；然后，采用石油醚-氯仿-甲醇梯度洗脫，先用石油醚洗脫，然后逐漸增大氯仿的比例，最后增大到用甲醇把所有斑點(diǎn)洗脫下來(lái)，洗脫速度I. OmL/min，按洗脫梯度分管收集；以紫外吸收法和濾紙片法測(cè)定洗脫液抑菌活性；合并活性組分，減壓濃縮，即得粗提品。
8.權(quán)利要求7所述的星形孢菌素的制備方法，其特征在于所述的硅膠薄層層析步驟包括薄板的制備稱取薄層層析用硅膠30g，羥甲基纖維素鈉O. 3g，加無(wú)離子水IOOmL,研磨均勻后，按照每塊板約3g硅膠的量，均勻鋪板，室溫下自然風(fēng)干，使用前置于烘箱中120°C活化30min，其中板的大小為5CmX20Cm;展層劑為氯仿和甲醇，氯仿和甲醇的體積比為10 1 ;將上述所得的粗提品溶于體積比為I : I氯仿和甲醇的溶液樣品，沿橫線均勻點(diǎn)在薄板上，橫線距薄板底端的距離為I. 5cm，點(diǎn)樣量約50 μ L，上行展層；展層完畢后，將薄板取出，自然風(fēng)干，置于紫外光照箱中觀察、照相，用鉛筆在薄板上標(biāo)出所顯示的帶譜，利用生物活性測(cè)定找到活性帶譜；用無(wú)菌水將指示菌棗青霉病菌制成孢子懸液，待熔化的PDA培養(yǎng)基放置至45°C左右時(shí)混入其中，定量倒入平板，凝固后，將展層完畢后并經(jīng)紫外線滅菌薄板輕輕反扣在平板上，輕輕壓平，靜置45min，取下毒板，置25°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，觀察活性組分的出現(xiàn)情況并測(cè)定Rf值。
9.權(quán)利要求8所述的星形孢菌素的制備方法，其特征在于所述的高效液相色譜純化步驟包括取硅膠薄層樣品充分溶于甲醇中，用O. 45μπι微孔過(guò)濾器過(guò)濾，自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣，每次進(jìn)樣量為I. 5mL ;以100%甲醇為流動(dòng)相，3. 5mL/min的泵流速進(jìn)行循環(huán)分離，利用UV檢測(cè)器在波長(zhǎng)291nm處檢測(cè)所對(duì)應(yīng)的洗脫液并進(jìn)行活性檢測(cè)，將所得樣品真空濃縮干燥得到星形孢菌素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種星形孢菌素的制備方法，所述的星形孢菌素的分子式為C28H26N4O3，其是通過(guò)發(fā)酵瘡痂鏈霉菌許呂亞種CGMCC No.5213制備得到的。本發(fā)明利用瘡痂鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)星形孢菌素，為星形孢菌素的生產(chǎn)提供了新的途徑。由瘡痂鏈霉菌許呂亞種產(chǎn)生的星形孢菌素對(duì)多種植物病原真菌具有很強(qiáng)的拮抗作用，對(duì)TMV也有較強(qiáng)的體外鈍化作用，具備作為農(nóng)用抗生素的開(kāi)發(fā)潛力。
文檔編號(hào)C12R1/465GK102925511SQ201210201598
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月19日
發(fā)明者文才藝 申請(qǐng)人:文才藝