專利名稱：一種篩選輔酶依賴型氧化還原酶的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種氧化還原酶，尤其是涉及一種篩選煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(輔酶
I)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(輔酶II)依賴型氧化還原酶的方法。
背景技術：
酶作為生物催化劑在工業(yè)上有著悠久的應用歷史。因酶在催化反應中具有選擇性高、條件溫和等優(yōu)點，使酶在有機合成等領域有很高的應用價值。如利用酶催化反應合成手性化合物，符合綠色化學的發(fā)展方向，具有廣闊的應用前景。目前已知的酶有5536種，其中氧化還原酶有1513種，占27. 3%(至2012年3月11日)。當氧化還原酶催化底物發(fā)生反應時需要電子供體或受體。生物體內眾多的氧化還原酶在反應時，需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (也稱輔酶I，簡寫為NAD (H))或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(也稱輔酶II，簡寫為NADP (H))以及黃素腺嘌呤二核苷酸或黃素單核苷酸等輔酶的參與。其中又以輔酶NAD(H)和NADP(H)依賴型氧化還原酶所占比例最大。近年來，以氧化還原酶為基礎的臨床診斷、生物感應器、再生輔酶系統(tǒng)、手性化合物的生物合成以及污染物生物降解等技術都取得了令人矚目的進展。氧化還原酶被用于不對稱合成功能性類固醇、手性藥物制劑、合成或修飾聚合物、氧化羥基及構建生物感應器等各個方面。其中NAD(H)和NADP(H)依賴型氧化還原酶在手性合成中有著重要的作用。如脫氫酶催化醛、酮、羰基以及烯烴碳碳雙鍵的還原，使許多潛手性物質轉化為手性產品應用于醫(yī)藥、食品、精細化工等領域。同時在催化還原硝基化合物、啤酒生產過程、農業(yè)廢棄物等方面中研究氧化還原酶活性，給實際生產生活也帶來巨大效益。目前，篩選生物催化劑的手段主要包括從大量酶源中高通量篩選生物催化劑及宏基因組途徑。對于氧化還原酶的篩選，已有報道([l]Gilles Ravot, DenisWahler,Olivier Favre-Bulle, et al. High Throughput Discovery of AlcoholDehydrogenases for Industrial Biocatalysis[J]. Advanced Synthesis andCatalysis, 2003，345(6-7) :691-694)利用宏基因組手段高通量挖掘乙醇脫氫酶。雖然分子克隆技術已足以完成宏基因組文庫的構建及篩選，但是宏基因組在宿主細胞中不表達或表達量低、活性克隆子的頻率極低等制約了它的實用性。相比較而言，從大量酶源中高通量篩選氧化還原酶是一條切實可行的發(fā)掘有實際應用價值的生物催化劑之路。在以往的生物催化劑高通量檢測方法建立研究中，基本都是只著眼于某一種特定酶的高產菌株的高效篩選。而在每個細胞中往往含有上成千上萬種酶，僅氧化還原酶就成百上千，這樣導致在篩選過程中無法充分挖掘所考察菌株的實際應用價值，在人力、資源及時間成本上都造成了極大的浪費。因此發(fā)掘氧化還原酶寶庫需要新的技術策略，迫切需要尋找一種簡便、高效、經濟的高通量技術與方法來篩選有重要工業(yè)應用價值的NAD(H)和NADP (H)依賴型氧化還原酶
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種效率較高、可增大發(fā)現(xiàn)有實際應用價值酶的概率，以克服現(xiàn)有的篩選手段實用性不高、資源浪費較大、效率較低等缺陷的篩選輔酶依賴型氧化還原酶的方法，所述輔酶依賴型氧化還原酶包括煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(輔酶I，記為NAD (H))和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(輔酶II，記為NADP (H))依賴型氧化還原酶。本發(fā)明包括以下步驟I)建立NAD⑶和NADP⑶依賴型氧化還原酶庫；2)對步驟I)中所述氧化還原酶，依據(jù)其反應條件進行分類；3)對步驟2)中的每一類氧化還原酶通過實驗統(tǒng)一其反應條件，建立對應的氧化還原酶系的檢測平臺；4)建立菌株庫；5)利用檢測平臺對菌株庫進行高通量酶活檢測，篩選得NAD⑶和NADP⑶依賴型氧化還原酶。在步驟I)中，所述NAD(H)和NADP(H)依賴型氧化還原酶庫中的氧化還原酶可運用于臨床診斷、生物感應器、再生輔酶系統(tǒng)、手性化合物的生物合成以及污染物生物降解等工業(yè)應用領域或可運用于代謝過程研究等生物科學研究領域。在步驟2)中，所述反應條件包括反應溫度、反應緩沖液、激活因子等。在步驟3)中，所述反應條件包括反應溫度、反應緩沖液、激活因子等，所述反應溫度的統(tǒng)一可采用以下方法分別在不同測定溫度下，考察多種酶的酶活情況，從而統(tǒng)一各酶的反應溫度，所述不同測定溫度的范圍可為0 100°C ;所述反應緩沖液的統(tǒng)一可采用以下方法考察各種緩沖液對多種酶檢測的影響，從而統(tǒng)一各酶的反應緩沖液，所述緩沖液的pH范圍為I 12，緩沖液的種類包括磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液等；所述激活因子的統(tǒng)一可采用以下方法通過考察各種金屬離子在不同濃度下對各種酶檢測的影響，從而統(tǒng)一各酶的激活因子，所述金屬離子可為鈣、錳、鋅、鎂、鉀、鈉、鐵、鋁、鍶、鋇、銅、鉛、錫、鈷、鎳等；所述建立對應的氧化還原酶系的檢測平臺的方法可為配制每個氧化還原酶系檢測平臺的反應母液，反應母液包含經統(tǒng)一后反應所需的緩沖液和激活因子。在步驟4)中，所述菌株庫中的菌株為分離自重金屬污染的菌株，難降解有機物污染等特殊生態(tài)環(huán)境的菌株，分離自深海、冰川、火山口等極端環(huán)境的菌株，具高活力氧化還原酶潛力的菌株等。在步驟5)中，所述高通量酶活檢測的具體方法如下(I)向微孔板中加入反應母液，所述微孔板包括12、48、96、384孔等；(2)分別向各微孔加入所測定各酶系的特異性底物；(3)加入檢測樣品啟動反應；(4)使用酶標儀在340nm下利用初速度法檢測樣品中一類氧化還原酶的酶活力，酶活定義為在規(guī)定條件下，每分鐘催化生成或者消耗Iumol NAD (P) H所耗酶量為I個酶活力單位。初速度法中所涉及酶活的計算公式為酶活力單位(U/mL) = (VT X A A X K) / ( e X Vs X L)其中Vt :反應液總體積；VS :樣品體積；AA :每分鐘吸光度變化值；K :樣品稀釋倍數(shù);e :摩爾吸光系數(shù)(e =6. 22L/mmol/cm) ；L :光程。
由于NAD(H)和NADP(H)依賴型氧化還原酶的酶活檢測皆可基于同種酶活檢測原理，即通過觀察由NAD (P)H的生成或消耗而導致的340nm處吸光度的變化來監(jiān)測酶動力學，因此NAD (H)和NADP (H)依賴型氧化還原酶這一類酶的檢測皆可通過初速度法實現(xiàn)，這樣就消除了不同酶之間檢測方式、儀器要求以及結果處理的差異性。在此基礎上，通過統(tǒng)一多種酶的反應條件(溫度、緩沖液及激活因子)，建立多酶體系高通量檢測平臺。運用所建立平臺可對大量菌株同時進行多種氧化還原酶酶系的檢測，從而篩選得生產高活力氧化還原酶菌株。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的積極效果在于I)本發(fā)明可高通量檢測NAD⑶和NADP⑶依賴型氧化還原酶。2)根據(jù)反應條件的差異，將所考察NAD(H)和NADP(H)依賴型氧化還原酶進行分類，并就其中每一類建立對應的高通量檢測平臺，該平臺可運用于以獲得具工業(yè)應用價值氧化還原酶為目的的篩選工作，也可運用于以研究生物體內動態(tài)代謝過程為目的的科學研究工作。 3)采用微孔板(12、48、96、384孔等)高通量檢測NAD(H)和NADP(H)依賴型氧化還原酶的酶活，在傳統(tǒng)NAD (H)和NADP (H)依賴型氧化還原酶的酶活檢測基礎上，利用平臺可以簡便快速地對大量菌株同時進行多種酶的酶活檢測，有利于最大限度地同時挖掘所考察菌株的應用潛力。4)在代謝研究中，該高通量檢測平臺能有效簡化代謝關鍵氧化還原酶檢測時的操作，提高檢測效率，減少人力、物力及時間成本的投入。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明的保護范圍并不限于此。實施例I :篩選海洋菌株中心碳代謝途徑中關鍵NAD (H)和NADP (H)依賴型氧化還原酶I)建立中心碳代謝關鍵氧化還原酶系(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6TOH)、丙酮酸脫氫酶(roH)、2-酮戊二酸脫氫酶(2-KGDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、蘋果酸酶(ME)以及異檸檬酸脫氫酶(IDH))的檢測平臺。①反應溫度統(tǒng)一為35°C。②反應緩沖液統(tǒng)一為60mM Tris-Hcl (pH 7. 6)緩沖液。③激活因子統(tǒng)一為Mg2+ (IOmM)0④將由步驟②和③實驗所得統(tǒng)一緩沖液及激活因子配置成母液。2)選取來自海洋特殊環(huán)境的14株菌株，14株海洋菌均由國家海洋局第三海洋研究所饋贈，菌株具體信息如表I所示。表I
權利要求
1.一種篩選輔酶依賴型氧化還原酶的方法，其特征在于包括以下步驟 1)建立NAD(H)和NADP (H)依賴型氧化還原酶庫； 2)對步驟I)中所述氧化還原酶，依據(jù)其反應條件進行分類； 3)對步驟2)中的每一類氧化還原酶通過實驗統(tǒng)一其反應條件，建立對應的氧化還原酶系的檢測平臺； 4)建立菌株庫； 5)利用檢測平臺對菌株庫進行高通量酶活檢測，篩選得NAD(H)和NADP (H)依賴型氧化還原酶。
2.如權利要求I所述的一種篩選輔酶依賴型氧化還原酶的方法，其特征在于在步驟2)和步驟3)中，所述反應條件包括反應溫度、反應緩沖液、激活因子。
3.如權利要求I所述的一種篩選輔酶依賴型氧化還原酶的方法，其特征在于在步驟3)中，所述反應溫度的統(tǒng)一采用以下方法分別在不同測定溫度下，考察多種酶的酶活情況，從而統(tǒng)一各酶的反應溫度，所述不同測定溫度的范圍為O 100°C。
4.如權利要求I所述的一種篩選輔酶依賴型氧化還原酶的方法，其特征在于在步驟3)中，所述反應緩沖液的統(tǒng)一采用以下方法考察各種緩沖液對多種酶檢測的影響，從而統(tǒng)一各酶的反應緩沖液，所述緩沖液的PH范圍為I 12，緩沖液的種類包括磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。
5.如權利要求I所述的一種篩選輔酶依賴型氧化還原酶的方法，其特征在于在步驟3)中，所述激活因子的統(tǒng)一采用以下方法通過考察各種金屬離子在不同濃度下對各種酶檢測的影響，從而統(tǒng)一各酶的激活因子，所述金屬離子為鈣、錳、鋅、鎂、鉀、鈉、鐵、鋁、鍶、鋇、銅、鉛、錫、鈷、鎳。
6.如權利要求I所述的一種篩選輔酶依賴型氧化還原酶的方法，其特征在于在步驟3)中，所述建立對應的氧化還原酶系的檢測平臺的方法為配制每個氧化還原酶系檢測平臺的反應母液，反應母液包含經統(tǒng)一后反應所需的緩沖液和激活因子。
7.如權利要求I所述的一種篩選輔酶依賴型氧化還原酶的方法，其特征在于在步驟4)中，所述菌株庫中的菌株為分離自重金屬污染的菌株，難降解有機物污染特殊生態(tài)環(huán)境的菌株，分離自深海、冰川、火山口極端環(huán)境的菌株，具高活力氧化還原酶潛力的菌株。
8.如權利要求I所述的一種篩選輔酶依賴型氧化還原酶的方法，其特征在于在步驟5)中，所述高通量酶活檢測的具體方法如下 (1)向微孔板中加入反應母液，所述微孔板包括12、48、96、384孔； (2)分別向各微孔加入所測定各酶系的特異性底物； (3)加入檢測樣品啟動反應； (4)使用酶標儀在340nm下利用初速度法檢測樣品中一類氧化還原酶的酶活力，酶活定義為在規(guī)定條件下，每分鐘催化生成或者消耗Iumol NAD (P) H所耗酶量為I個酶活力單位，初速度法中所涉及酶活的計算公式為 酶活力單位(U/mL) = (BTX AAXK)/( e XVsXL) 其中Vt :反應液總體積；VS :樣品體積；AA :每分鐘吸光度變化值；K :樣品稀釋倍數(shù)；e :摩爾吸光系數(shù)(e =6. 22L/mmol/cm) ；L :光程。
全文摘要
一種篩選輔酶依賴型氧化還原酶的方法，涉及一種氧化還原酶。提供一種效率較高、可增大發(fā)現(xiàn)有實際應用價值酶的概率，以克服現(xiàn)有的篩選手段實用性不高、資源浪費較大、效率較低等缺陷的篩選輔酶依賴型氧化還原酶的方法，所述輔酶依賴型氧化還原酶包括煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸依賴型氧化還原酶。建立NAD(H)和NADP(H)依賴型氧化還原酶庫；對所述氧化還原酶，依據(jù)其反應條件進行分類；對每一類氧化還原酶通過實驗統(tǒng)一其反應條件，建立對應的氧化還原酶系的檢測平臺；建立菌株庫；利用檢測平臺對菌株庫進行高通量酶活檢測，篩選得NAD(H)和NADP(H)依賴型氧化還原酶。
文檔編號C12Q1/26GK102703574SQ201210190270
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月8日 優(yōu)先權日2012年6月8日
發(fā)明者周小芬, 方柏山, 溫衛(wèi)衛(wèi), 王世珍 申請人:廈門大學