專利名稱：一種塊菌酒及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，具體涉及含有塊菌菌絲體粉或塊菌菌絲體液的保健品及其制備方法。
背景技術：
塊菌(Truffle)，也稱松露，具有獨特的香味、口感和營養(yǎng)價值，人類食用塊菌已有上千年的歷史。塊菌富含17種氨基酸、8種維生素、適量的蛋白質、以及雄性酮、留醇、鞘脂、脂肪酸、氨基酸及微量元素等50余種生理活性成分。并且含有人體自身不能合成的8種氨基酸、鋅、錳、鐵、鈣、磷、硒等必需營養(yǎng)素，具有增強免疫力、抗衰老、益胃、清神、止血、療痔等藥用價值，具有抗癌活性，對癌細胞有一定的抑制作用，可以激發(fā)腦細胞活力。塊菌泡制的保健酒香味獨特、口感好，綠色保健和藥理作用明顯，具有壯陽、補腎，降低血清低密度脂蛋白、膽固醇，升高高密度脂蛋白、防止動脈粥樣硬化及抗腫瘤等顯著功效。·文獻報道連續(xù)通過10天給藥接種有S-180肉瘤、EAC肉瘤液的小鼠，發(fā)現(xiàn)25mg/kg、50mg/kg的快菌多糖能明顯的抑制小鼠S-180肉瘤及EAC肉瘤的生長。同時通過連續(xù)給藥發(fā)現(xiàn)塊菌多糖對小鼠脾臟的重量、外周血中的白細胞數(shù)及T淋巴細胞百分率具有明顯的增加作用；能夠促進T淋巴細胞轉化，提高小鼠血清中IgG水平等。實驗結果表明，塊菌多糖作為一種新的真菌多糖，毒性低、水溶性好、抑制腫瘤作用明顯。塊菌多糖可以直接從塊菌子實體中提取，亦可通過塊菌液體深層發(fā)酵的方法獲得，但前者不適于工業(yè)化大生產，原因在于I、塊菌作為一種生長于地下的藥食兩用真菌，在自然界中要求生長于堿性土壤、氣候溫和的環(huán)境，同時與橡樹等樹種的根系共生，苛刻的生長條件直接導致了天然產量的供不應求；2、為彌補塊菌天然產卵量的不足，曾有不少學者進行了半人工模擬培養(yǎng)的研究，但從接種到收獲一般需要7-9年時間，周期較長，需要耗費大量的人力和物力；3、由于塊菌生長于地下，人工發(fā)現(xiàn)的難度較大，采集過程中易受到損傷，同時塊菌生長于自然界受環(huán)境變化的影響較大，品質較難保證；4、目前市場上銷售的新鮮塊菌價格昂貴，因此若直接以塊菌子實體作為塊菌多糖的生產原料則無法回避受原料價格及數(shù)量的限制。目前，中國專利200610166503、中國專利申請200810172343公開了生產塊菌活性
菌絲體和塊菌多糖的方法，均通過斜面培養(yǎng)，一級液體種子培養(yǎng)、二級液體種子培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵的過程獲得塊菌活性菌絲體和塊菌多糖。

發(fā)明內容
經過大量的試驗，我們驚奇的發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中增加固態(tài)發(fā)酵能過有效的提高塊菌多糖的含量。本發(fā)明發(fā)酵方法所得的產物用濃硫酸-苯酚法測定塊菌多糖的含量，測定結果表明，本發(fā)明的方法相比于現(xiàn)有的分批培養(yǎng)，培養(yǎng)產物中黑孢塊菌菌絲體比分批培養(yǎng)提高了 20%，尤其是塊菌胞外多糖產量比分批培養(yǎng)法提高了 50%，塊菌細胞培養(yǎng)中塊菌胞內多糖比分批培養(yǎng)法增加了 24. 8 %。同時，我們還發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加適當重量比的榛葉汁，可明顯提高塊菌菌絲體的產量，培養(yǎng)產物中黑孢塊菌菌絲體比分批培養(yǎng)提高了 69. 2%，尤其是塊菌胞外多糖產量比分批培養(yǎng)法提高了 150%，塊菌細胞培養(yǎng)中塊菌胞內多糖比分批培養(yǎng)法增加了 57.3%。本發(fā)明的目的是提供一種塊菌酒及其制備方法。本發(fā)明的目的是提供一種塊菌菌絲體粉或塊菌菌絲體液的制備方法。本發(fā)明的目的是提供一種適于培養(yǎng)塊菌的固態(tài)發(fā)酵法。本發(fā)明的目的是提供一種適于培養(yǎng)塊菌的營養(yǎng)水的配方。 具體而言，本發(fā)明提供了 一種塊菌酒，其原料包含5-95重量份的塊菌菌絲體，95-5重量份的谷物。所述的塊菌菌絲體的制備方法包括以下步驟I、液體菌種培養(yǎng)I)斜面菌種培養(yǎng)將野生未成熟的新鮮塊菌子實體，去掉表面泥沙，用解剖刀取中間部位2-3mm的菌肉組織塊接種到斜面培養(yǎng)基中，放入20-35°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2_30天，得斜面菌種；所述的斜面培養(yǎng)基配方為將馬鈴薯200g去皮，切片，煮沸15-20分鐘過濾得濾液；將100-300g榛葉放入IOOOml水中煮沸約10-15分鐘過濾得濾液，合并上述二種濾液，再加入蔗糖10-30g，瓊脂10-30g，用蒸餾水定容至1000ml，調pH值為6_9 ；2) 一級液體種子培養(yǎng)將步驟I)中培養(yǎng)的斜面菌種活化后切成2_4mm的碎菌塊轉接入裝有一級液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中進行一級液體種子培養(yǎng)，在培養(yǎng)溫度為15-40°C，轉速為50-300轉/分鐘的旋轉式或往復式搖瓶機上振蕩培養(yǎng)2-15天，得含有菌種的一級液體種子；所述的一級液體種子培養(yǎng)基(g/L)的配方為榛葉汁300-900，蔗糖1-300，蛋白胨1-100，酵母膏1-20，硫酸鎂1-10，磷酸二氫鉀1-10，pH值為6-9 ；3) 二級液體種子培養(yǎng)將步驟2)中培養(yǎng)的一級液體種子按照5-50%體積比的接種量轉接入裝有二級液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中進行二級液體種子培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為15-40°C，轉速為50-300轉/分鐘的旋轉式或往復式搖瓶機上振蕩培養(yǎng)2-15天，得含有菌種的二級液體種子；所述的二級液體種子培養(yǎng)基(g/L)的配方為榛葉汁300-900，蔗糖1-300，蛋白胨1-100，酵母膏1-20，硫酸鎂1-10，磷酸二氫鉀1-10，pH值為6-9 ；II、固態(tài)發(fā)酵法生產塊菌菌絲體發(fā)酵粉I)配置營養(yǎng)水將蔗糖10_50g，酵母膏0_20g，蛋白胨0_20g，磷酸二氫鉀0_10g，硫酸鎂O-IOg溶于700-900ml水中，定容至1000ml，調節(jié)pH至6_9 ；2)配置固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量比為(0. 8-2) I將谷物加入到營養(yǎng)水中；3)固態(tài)發(fā)酵按照固體發(fā)酵培養(yǎng)基干重的1-50%體積/重量,將二級液體種子接種于步驟2)所得的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上，于20-40°C發(fā)酵培養(yǎng)2-60天，料層厚度為1-lOcm，培養(yǎng)物表面的菌絲體由白轉為黃褐色時，發(fā)酵培養(yǎng)結束；4)干燥，粉碎，過篩，滅菌即得塊菌菌絲體發(fā)酵粉。所述的塊菌菌絲體的制備方法還包括III、液態(tài)深層發(fā)酵法生產塊菌菌絲體粉或塊菌菌絲體液；
I)配置液體培養(yǎng)基將100-300g鮮榛葉放入IOOOml水中煮20-40分鐘后過濾，取濾液，加入50-200g的蔗糖，IO-IOOg的蛋白胨，5-50g的酵母膏，l_40g的硫酸鎂，l_40g的磷酸二氫鉀，用水定容至1000ml，調pH值為6-9，消毒滅菌即得；2)發(fā)酵條件為按照5-50%體積比的接種量將I中所得的二級液體種子接種于I)所得的液體培養(yǎng)基上，裝液量為容積的60-80%，在20-40°C，通氣速率為30-60升/分鐘，攪拌轉速為200-800轉/分鐘的條件下培養(yǎng)2-30天，得塊菌菌絲體液；3)將步驟2)所得塊菌菌絲體液離心，過濾，干燥，粉碎，過篩，滅菌，即得塊菌菌絲體粉。一種塊菌酒的制備方法將重量比為I : (0. 1-2)的谷物和塊菌菌絲體粉或塊菌菌絲體液作為原料，接入2-8%重量比的甜酒曲和1-5%重量比的活化酵母液后，在20-40°C下發(fā)酵2-10天，然后在15-30°C靜置發(fā)酵20-50天，按照黃酒的釀造工藝，制成塊菌 黃酒。一種塊菌酒的制備方法將權利要求2所得的塊菌菌絲體發(fā)酵粉用超聲波破碎，120°C蒸煮1-3小時，放至室溫；每IOOg塊菌菌絲體發(fā)酵粉添加50-150mL的酵母-糖化酶-醋酸預混液；20-4(TC恒溫發(fā)酵10-30天，然后用紗布過濾，濾液4-8°C發(fā)酵20-80天，取上清，微孔濾膜除菌，密封，低溫貯存，即得；所述的酵母-糖化酶-醋酸預混液包含體積分數(shù)為3-8%冰醋酸，酵母5-15g/100mL，糖化酶10_20g/100mL。所述的塊菌屬菌株選自中國塊菌、印度塊菌、黑孢塊菌、白塊菌或夏塊菌中的一種或幾種。所述的谷物為大米、小米、玉米、紫米，紅米，黑米，小麥、大麥、青稞、蕎麥或高粱的一種或幾種。菌種活化是指將保藏狀態(tài)的菌種放入適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng),逐級擴大培養(yǎng),獲得活力旺盛的、接種數(shù)量足夠的培養(yǎng)物。菌種發(fā)酵有一般需要2-3代的復壯過程，因為保存時的條件往往和培養(yǎng)時的條件不相同，所以要活化，讓菌種逐漸適應培養(yǎng)環(huán)境。所述的黃酒是指以糧食為原料的釀造酒，不包括蒸餾的燒酒。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點和積極效果I、可明顯提高塊菌菌絲體的產量，比分批培養(yǎng)法提高了 69%。2、可明顯提高塊菌胞外多糖產量，比分批培養(yǎng)法提高了 150% ；3、可明顯提高塊菌胞內多糖，比分批培養(yǎng)法提高了 57% ；4、本發(fā)明所述的制備方法簡單易行，適合工業(yè)生產。
具體實施例方式以下通過具體實施方式
的描述對本發(fā)明作進一步說明，但這并非是對本發(fā)明的限制，本領域技術人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內。中國塊菌、印度塊菌、黑孢塊菌、白塊菌、夏塊菌均購自昆明匯珍園塊菌有限公司。試驗例I對比例(分批培養(yǎng)法)I、液體菌種培養(yǎng)
I)斜面菌種培養(yǎng)將野生未成熟的新鮮黑孢塊菌子實體，去掉表面泥沙，用解剖刀取中間部位2-3mm的菌肉組織塊接種到斜面培養(yǎng)基中，放入25°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)10天，得斜面菌種；所述的斜面培養(yǎng)基配方為將馬鈴薯200g去皮，切片，煮沸17分鐘過濾得濾液；再加入蔗糖15g，瓊脂15g，用蒸餾水定容至1000ml，調pH值為7 ;2) 一級液體種子培養(yǎng)將步驟I)中培養(yǎng)的斜面菌種活化后切成2-4mm的碎菌塊轉接入裝有一級液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中進行一級液體種子培養(yǎng)，在培養(yǎng)溫度為20°C，轉速為100轉/分鐘的往復式搖瓶機上振蕩培養(yǎng)5天，得含有菌種的一級液體種子；所述的一級液體種子培養(yǎng)基(g/L)的配方為蔗糖50，蛋白胨10，酵母膏5，硫酸鎂3，磷酸二氫鉀7，PH值為7 ;3) 二級液體種子培養(yǎng)將步驟2)中培養(yǎng)的一級液體種子按照10%體積比的接種量轉接入裝有二級液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中進行二級液體種子培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20°C，轉速為150轉/分鐘的旋轉式或往復式搖瓶機上振蕩培養(yǎng)5天，得含有菌種的二級液體種子； 所述的二級液體種子培養(yǎng)基(g/L)的配方為蔗糖100，蛋白胨30，酵母膏10，硫酸鎂5，磷酸二氫鉀4, pH值為7 ；II、液態(tài)深層發(fā)酵法生產塊菌菌絲體液；I)配置液體培養(yǎng)基取IOOg的鹿糖，30g的蛋白胨，15g的酵母膏，IOg的硫酸鎂，5g的磷酸二氫鉀，用蒸餾水定容至1000ml，調pH值為7，分裝試管后消毒滅菌即得；2)接種、培養(yǎng)按照10%重量比將II中所得的塊菌菌絲體發(fā)酵粉接種于I)所得的液體培養(yǎng)基上，在25 °C，通氣速率為35升/分鐘，轉速為250轉/分鐘的往復式搖瓶機上振蕩培養(yǎng)13天,得塊菌菌絲體液。2)發(fā)酵條件為按照10%體積比的接種量將I中所得的二級液體種子接種于I)所得的液體培養(yǎng)基上，裝液量為容積的70%，在30°C，通氣速率為50升/分鐘，攪拌轉速為600轉/分鐘的條件下培養(yǎng)15天，得塊菌菌絲體液。塊菌多糖含量的檢測方法細胞在60°C烘干后稱重，烘干的細胞按照文獻(Tang, Y. J.，Zhu，L. L.，Li. D. S.，Mi，Z. Y，Li，H. M. Significance ofinoculation density and carbon source on the mycelia growth andTuberpolysaccharides production by submerged fermentation of Chinese truffleTubersinense. Process Biochemistry 2008,43 :576-586.)的方法破碎處理后，用濃硫酸-苯酚法測定塊菌多糖的含量。對對比例、實施例I、實施例3進行如下分析測定A、胞外多糖產量的測定在30 y m孔徑濾膜過濾下得細胞干重；發(fā)酵液中加入四倍體積的無水乙醇，混合過夜，在13000rpm離心沉淀得到胞外塊菌多糖。經lmol/L氫氧化鈉溶解，采用濃硫酸-苯酚法測定胞外多糖產量。B、胞內多糖產量的測定菌絲體IOOmg,加入lmol/L氫氧化鈉溶解，采用濃硫酸-苯酚法測定胞內多糖產量，計算胞內多糖產量(胞內多糖含量乘以細胞干重)。表I不同培養(yǎng)方法對塊菌菌絲體及多糖產量的影響
權利要求
1.一種塊菌酒，其特征在于其原料包含5-95重量份的塊菌菌絲體，95-5重量份的谷物。
2.根據(jù)權利要求I所述的塊菌酒，其中所述的塊菌菌絲體的制備方法包括以下步驟 I、液體菌種培養(yǎng) 1)斜面菌種培養(yǎng)將野生未成熟的新鮮塊菌子實體，去掉表面泥沙，用解剖刀取中間部位2-3mm的菌肉組織塊接種到斜面培養(yǎng)基中，放入20-35°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2_30天，得斜面菌種；所述的斜面培養(yǎng)基配方為將馬鈴薯去皮，切片，煮沸15-20分鐘過濾得濾液；將榛葉放入水中煮沸約10-15分鐘過濾得濾液，合并上述二種濾液，再加入蔗糖，瓊脂，用蒸餾水定容，調pH值為6-9 ； 2)一級液體種子培養(yǎng)將步驟I)中培養(yǎng)的斜面菌種活化后切成2-4mm的碎菌塊轉接入裝有一級液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中進行一級液體種子培養(yǎng)，在培養(yǎng)溫度為15-40°C,轉速為50-300轉/分鐘的旋轉式或往復式搖瓶機上振蕩培養(yǎng)2-15天，得含有菌種的一級液體種子；所述的一級液體種子培養(yǎng)基的配方為榛葉汁300-900g/L，蔗糖l_300g/L，蛋白胨l-100g/L，酵母膏 l_20g/L，硫酸鎂 l-10g/L，磷酸二氫鉀 l-10g/L，pH 值為 6-9 ； 3)二級液體種子培養(yǎng)將步驟2)中培養(yǎng)的一級液體種子按照5-50%體積比的接種量轉接入裝有二級液體種子培養(yǎng)基的搖瓶中進行二級液體種子培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為15-40°C，轉速為50-300轉/分鐘的旋轉式或往復式搖瓶機上振蕩培養(yǎng)2-15天，得含有菌種的二級液體種子；所述的二級液體種子培養(yǎng)基的配方為榛葉汁300-900g/L，蔗糖l_300g/L，蛋白胨l-100g/L，酵母膏 l_20g/L，硫酸鎂 l-10g/L，磷酸二氫鉀 l-10g/L，pH 值為 6-9 ； II、固態(tài)發(fā)酵法生產塊菌菌絲體發(fā)酵粉 1)配置營養(yǎng)水將蔗糖10-50g，酵母膏0-20g，蛋白胨0-20g，磷酸二氫鉀0-10g，硫酸鎂O-IOg溶于700-900ml水中，定容至IOOOml，調節(jié)pH至6-9 ； 2)配置固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量比為0.8-2 I將谷物加入到營養(yǎng)水中； 3)固態(tài)發(fā)酵按照固體發(fā)酵培養(yǎng)基干重的1-50%體積/重量，將二級液體種子接種于步驟2)所得的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基上，于20-40°C發(fā)酵培養(yǎng)2-60天，料層厚度為1-lOcm，培養(yǎng)物表面的菌絲體由白轉為黃褐色時，發(fā)酵培養(yǎng)結束； 4)干燥，粉碎，過篩，滅菌即得塊菌菌絲體發(fā)酵粉。
3.根據(jù)權利要求2所述的塊菌菌絲體的制備方法，其中所述的制備步驟還包括 液態(tài)深層發(fā)酵法生產塊菌菌絲體粉或塊菌菌絲體液； 1)配置液體培養(yǎng)基將鮮榛葉放入水中煮20-40分鐘后過濾，取濾液，加入蔗糖、蛋白胨、酵母膏、硫酸鎂、磷酸二氫鉀，用水定容，調PH值為6-9，消毒滅菌即得； 2)發(fā)酵條件為按照5-50%體積比的接種量將I中所得的二級液體種子接種于I)所得的液體培養(yǎng)基上，裝液量為容積的60-80%，在20-40°C，通氣速率為30-60升/分鐘，攪拌轉速為200-800轉/分鐘的條件下培養(yǎng)2-30天，得塊菌菌絲體液； 3)將步驟2)所得塊菌菌絲體液離心，過濾，干燥，粉碎，過篩，滅菌，即得塊菌菌絲體粉。
4.根據(jù)權利要求I所述的一種塊菌酒，采用以下制備方法 制備方法一將重量比為I : 0. 1-2的谷物和塊菌菌絲體粉或塊菌菌絲體液作為原料，接入2-8%重量比的甜酒曲和1-5%重量比的活化酵母液后，在20-40°C下發(fā)酵2-10天，然后在15-30°C靜置發(fā)酵20-50天，按照黃酒的釀造工藝，制成塊菌黃酒；或 制備方法二 將權利要求2所得的塊菌菌絲體發(fā)酵粉用超聲波破碎，120°C蒸煮1-3小時，放至室溫；每IOOg塊菌菌絲體發(fā)酵粉添加50-150mL的酵母-糖化酶-醋酸預混液；20-40°C恒溫發(fā)酵10-30天，然后用紗布過濾，濾液4-8°C發(fā)酵20-80天，取上清，微孔濾膜除菌，密封，低溫貯存，即得；所述的酵母-糖化酶-醋酸預混液包含體積分數(shù)為3-8%冰醋酸，酵母 5-15g/100mL，糖化酶 10-20g/100mL。
5.根據(jù)權利要求I所述的一種塊菌酒，其特征在于所述的塊菌屬菌株選自中國塊菌、印度塊菌、黑孢塊菌、白塊菌或夏塊菌中的一種或幾種。
6.根據(jù)權利要求I所述的一種塊菌酒，其中所述的谷物為大米、小米、玉米、紫米，紅米，黑米，小麥、大麥、青稞、蕎麥或高粱的一種或幾種。
全文摘要
本發(fā)明屬于食品或醫(yī)藥技術技術領域，本發(fā)明提供了一種塊菌酒及其制備方法。本發(fā)明所述制備方法可使塊菌菌絲體提高69％；塊菌胞外多糖產量提高150％；菌胞內多糖提高57％；本發(fā)明所述的制備方法簡單易行，適合工業(yè)生產。
文檔編號C12N1/14GK102676342SQ20121017650
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月1日 優(yōu)先權日2012年6月1日
發(fā)明者郭景龍 申請人:郭景龍