專利名稱：一種豬流行性腹瀉病毒m基因全序列的擴增方法
技術領域：
本發(fā)明涉及豬流行性腹瀉病毒技術領域，具體地，涉及ー種豬流行性腹瀉病毒M基因全序列的擴增方法。
背景技術：
毛雅元等(2010年)設計了 2對引物，用套式PCR檢測在VERO細胞上不同培養(yǎng)代次的豬流行性腹瀉病毒的M基因，其擴增的片段僅有412bp，不能擴增不同培養(yǎng)代次的豬流行性腹瀉病毒的M基因全部序列(681bp)。

發(fā)明內容
為此，本發(fā)明提供了 ー種豬流行性腹瀉病毒M基因全序列的擴增方法，該方法能 夠擴增豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的M基因全長，特別是在ST、VER0細胞上培養(yǎng)的不同代次的PEDV種毒的M基因全長。通過該方法可以捕捉到豬流行性腹瀉病毒在細胞培養(yǎng)傳代過程中M全基因的序列變化，從而通過M基因的遺傳變異分析了解其與PEDV毒力或者免疫效力的相關性。該方法擴增的目的片段長761bp，包含681bp的豬流行性腹瀉病毒的M基因。本發(fā)明的技術方案如下ー種豬流行性腹瀉病毒M基因全序列的擴增方法，包括如下具體步驟I、提取病毒RNA:取原病料即豬的水樣糞便，經12000rpm離心5分鐘后取上清液或者不同代次病毒的細胞培養(yǎng)液-20°C反復凍融2-3次，然后采用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNAextraction kit Ver. 4. 0 (DV819A)提取病毒 RNA;2、RT-PCR 擴增依據GENEBANK公開的豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的M基因序列設計RT-PCR引物，引物序列為PEDVffF:5-TAAGCATTACTTTCGTCC-3PEDVffR:5-AACTGACAGAAGCCATAA-3以步驟I所得的病毒RNA為模板，用上述RT-PCR引物采用TaKaRa PrimeScriptone step RT-PCR Kit Ver. 2 (DRR055A)擴增豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的M基因，目的片段長867bp ；3、套式PCR擴增依據GENEBANK公開的豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的M基因序列設計PCR引物，弓丨物序列為PEDVNF:5-TTACATGCGAATTGACCC-3PEDVNR:5-AGCTGACAGAAGCCATAA-3以RT-PCR 產物為模板，用上述引物采用 TaKaRa Premix Taq Version2. O (D334S)擴增豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的M基因片段；
4、PCR產物的克隆及測序分析(I)用 TransGen Biotech EasyPure PCR Purification Kit (目錄號 EP101)對套式PCR產物進行純化；(2)將純化的PCR產物連接到pMD18-T Simple Vector上，篩選陽性克隆，將陽性克隆進行測序鑒定。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明所述豬流行性腹瀉病毒M基因全序列的擴增方法，該方法能夠擴增豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的M基因全長，特別是在ST、VER0細胞上培養(yǎng)的不同代次的PEDV種毒的M基因全長。通過該方法可以捕捉到豬流行性腹瀉病毒在細胞培養(yǎng)傳代過程中M全基因的序列變化，從而通過M基因的遺傳變異分析了解其與PEDV毒力或者免疫效カ的相關性。該方法擴增的目的片段長761bp，包含681bp的豬流行性腹瀉病毒的M基因。


圖I、將原病料、病毒在ST、vero細胞上培養(yǎng)的第5代、第10代、第15代毒的RNA分別用外圍引物(PEDVWF/PEDVWR)擴增的RT-PCR產物以及其RT-PCR產物再用內部引物(PEDVNF/PEDVNR)擴增的套式PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，M DL2000 ；1 :原病料RNA RT-PCR產物，目的片段為867bp ；2~4 :分別為病毒在ST細胞上培養(yǎng)第5代、第10代、第15代毒的RNA RT-PCR結果；5_7 :分別為病毒在Vero細胞上培養(yǎng)第5代、第10代、第15代毒的RNART-PCR結果；8 :原病料套式PCR產物，目的片段為761bp ；9-11 :分別為病毒在ST細胞上培養(yǎng)第5代、第10代、第15代毒的套式PCR產物，片段為761bp ；12-14 :分別為病毒在VeiO細胞上培養(yǎng)第5代、第10代、第15代毒的套式PCR產物，片段為761bp。說明此方法能擴增出豬流行性腹瀉病毒在ST、Vero細胞上培養(yǎng)的F5、F10、F15代毒的M基因全長；
圖2-1，2-2為Vero F15M序列用DNAstar軟件進行序列比對的結果。
具體實施例方式以下將結合具體實施例對本發(fā)明所述豬流行性腹瀉病毒M基因全序列的擴增方法進ー步說明。ー種豬流行性腹瀉病毒M基因全序列的擴增方法，包括如下具體步驟I、提取病毒RNA:取原病料即豬的水樣糞便，經12000rpm離心5分鐘后取上清液或者不同代次病毒的細胞培養(yǎng)液-20°C反復凍融2-3次，然后采用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNAextraction kit Ver. 4· 0 (DV819A)提取病毒 RNA;用 TaKaRa miniBEST viral RNA/DNAextraction kit Ver. 4. 0 (DV819A)提取病毒 RNA 的方法如下①取200 μ I病料處理液或凍融的細胞培養(yǎng)液放入I. 5ml離心管中，加入200 μ I的Solution A,劇烈振蕩混勻后，室溫放置5分鐘；②加入75 μ I的Solution B,混合均勻后，12000rpm離心5分鐘;③將上清轉移到新的Collection Tube (2ml,試劑盒中提供)中，加250μ1異丙醇(1%冰こ酸)，上下顛倒混勻；④將試劑盒中的Spin column安置于另一新的Collection Tube (2ml,試劑盒中提供)上，將③中的上清液轉移至Spin column中，12000rpm離心I分鐘,棄濾液；⑤將500 μ I的Rinse A加入至Spin column中，室溫靜置I分鐘，12000rpm離心I分鐘，棄濾液；⑥將800 μ I的Rinse B加入至Spin column中,12000rpm離心I分鐘,棄濾液。⑦再次進行12000rpm離心I分鐘；⑧將Spin column安置于新的I. 5ml離心管上,在Spin column膜的中央處加入50 μ I的滅菌蒸餾水或者Elution Buffer,室溫靜置I分鐘；⑨12000rpm離心I分鐘洗脫病毒RNA;提取的病毒RNA立即用于后續(xù)試驗或-20°C保存。
2、RT-PCR 擴增依據GENEBANK公開的豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的M基因序列設計RT-PCR引物，引物序列為PEDVffF:5-TAAGCATTACTTTCGTCC-3PEDVffR:5-AACTGACAGAAGCCATAA-3以步驟I所得的病毒RNA為模板，用上述RT-PCR引物采用TaKaRa PrimeScriptone step RT-PCR Kit Ver. 2 (DRR055A)擴增豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的M基因。RT-PCR反應體系為
PrimeScript one step enzyme MixI u!
2 x I step buffer12.5μ1
PEDVWF (IΟμΜ)2μΙ
PEDVWR (IΟμΜ)2ui
RNA樣品3μ1
RNase Free d.H204.5μΙRT-PCR反應程序為
50 C30min;
94 C2min;
94 C30s 〕
51-55 tC30s [ 30 cycles
72'Olmirt -
721C7min;
16で保存。用瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR擴增產物，結果如圖I所示。
3、套式PCR擴增依據GENEBANK公開的豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的M基因序列設計PCR引物，弓丨物序列為PEDVNF:5-TTACATGCGAATTGACCC-3PEDVNR:5-AGCTGACAGAAGCCATAA-3以RT-PCR 產物為模板，用上述引物采用 TaKaRa Premix Taq Version2. O (D334S)擴增豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的M基因片段。PCR反應體系為
Premix Taq12.5μ1 RT-PCR 產物1.5μΙ PEDVNF (IΟμΜ)2μ
PEDVNR (I ΟμΜ)2μ1
滅菌蒸餾水7μ1PCR反應程序為
權利要求
1. 一種豬流行性腹瀉病毒M基因全序列的擴增方法，其特征在于，包括如下具體步驟 1、提取病毒RNA: 取原病料，即豬的水樣糞便，經12000rpm離心5分鐘后取上清液或者不同代次病毒的細胞培養(yǎng)液，-20 °C反復凍融2-3次，然后采用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNAextraction kit Ver. 4. 0 (DV819A)提取病毒 RNA; 2、RT-PCR擴增 依據GENEBANK公開的豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的M基因序列設計RT-PCR引物，引物序列為PEDVffF:5-TAAGCATTACTTTCGTCC-3PEDVffR:5-AACTGACAGAAGCCATAA-3 以步驟I所得的病毒RNA為模板，用上述RT-PCR引物采用TaKaRa PrimeScript onestep RT-PCR Kit Ver. 2 (DRR055A)擴增豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的M基因； 3、套式PCR擴增 依據GENEBANK公開的豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的M基因序列設計PCR引物，引物序列為PEDVNF:5-TTACATGCGAATTGACCC-3PEDVNR:5-AGCTGACAGAAGCCATAA-3 以RT-PCR產物為模板，用上述引物采用TaKaRa Premix Taq Version2. O (D334S)擴增豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的M基因片段； 4、PCR產物的克隆及測序分析 (1)用TransGen Biotech EasyPure PCR Purification Kit (目錄號 EP101)對套式PCR產物進行純化； (2)將純化的PCR產物連接到pMD18-TSimple Vector載體上，篩選陽性克隆，將陽性克隆進行測序鑒定。
2.如權利要求I所述的豬流行性腹瀉病毒M基因全序列的擴增方法，其特征在于，用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver. 4· 0 (DV819A)提取病毒 RNA 的方法如下 ①取200μ I病料處理液或凍融的細胞培養(yǎng)液放入I. 5ml離心管中，加入200 μ I的Solution A,劇烈振蕩混勻后,室溫放置5分鐘； ②加入75μ I的Solution B,混合均勻后，12000rpm離心5分鐘; ③將上清轉移到新的CollectionTube (2ml，試劑盒中提供)中，加250 μ I異丙醇(1%冰乙酸)，上下顛倒混勻； ④將試劑盒中的Spincolumn安置于另一新的Collection Tube (2ml,試劑盒中提供)上，將③中的上清液轉移至Spin column中，12000rpm離心I分鐘,棄濾液； ⑤將500μ I的Rinse A加入至Spin column中，室溫靜置I分鐘，12000rpm離心I分鐘，棄濾液； ⑥將800μ I的Rinse B加入至Spin column中,12000rpm離心I分鐘,棄濾液。
⑦再次進行12000rpm離心I分鐘； ⑧將Spincolumn安置于新的I. 5ml離心管上,在Spin column膜的中央處加入50 μ I的滅菌蒸餾水或者Elution Buffer,室溫靜置I分鐘； ⑨12000rpm離心I分鐘洗脫病毒RNA;提取的病毒RNA立即用于后續(xù)試驗或_20°C保存。
3.如權利要求I所述的豬流行性腹瀉病毒M基因全序列的擴增方法，其特征在于，采用 TransGen Biotech EasyPure PCR Purification Kit (目錄號 EP101)進行 PCR 產物純化的方法如下 ①取50-100μ I的PCR產物，加入5倍體積的溶液ΒΒ，混勻后加入吸附柱中，靜置I分鐘IOOOOrpm離心I分鐘,棄去流出液。
②加入650μ I溶液WB，IOOOOrpm離心I分鐘，棄去流出液。
③IOOOOrpm離心1-2分鐘，去除殘留的WB。
④將吸附柱放于一新的1.5ml離心管中，在柱的中央加入30-50μ IEB或滅菌蒸餾水(65-70°C預熱EB或滅菌蒸餾水)。室溫靜置I分鐘，IOOOOrpm離心I分鐘，洗脫DNA。洗脫的DNA立即用于后續(xù)試驗或_20°C保存。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種豬流行性腹瀉病毒M基因全序列的擴增方法，包括如下具體步驟1、提取豬流行性腹瀉病毒RNA；2、依據豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的M基因序列設計RT-PCR引物，并擴增豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的M基因；3、依據豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的M基因序列設計套式PCR引物，以RT-PCR產物為模板，擴增M基因全部片段；4、PCR產物的克隆及測序分析將套式PCR產物進行純化并連接到pMD18-TSimpleVector上，篩選陽性克隆，將陽性克隆進行測序鑒定。該方法能夠擴增豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的M基因全長，通過該方法可以捕捉到豬流行性腹瀉病毒在細胞培養(yǎng)傳代過程中M全基因的序列變化，從而通過M基因的遺傳變異分析了解其與PEDV毒力或者免疫效力的相關性。
文檔編號C12N15/50GK102851301SQ20121017371
公開日2013年1月2日 申請日期2012年7月6日 優(yōu)先權日2012年7月6日
發(fā)明者何玲, 唐滿華, 陳瑞愛, 梁珪益 申請人:廣東大華農動物保健品股份有限公司, 肇慶大華農生物藥品有限公司