專利名稱：一種生物催化合成β-丙氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物催化合成β -丙氨酸的方法，屬酶工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
β-丙氨酸(英文名beta-Alanine)又名β -氨基丙酸，它是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，是自然界中唯一的β型氨基酸，1972年由Ross和Monroe在尿嘧啶的降解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)。β-丙氨酸是一種重要的生化原料，在醫(yī)藥、飼料和食品領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域和市場(chǎng)前景。目前，β_丙氨酸的主要應(yīng)用于合成泛酸和泛酸鈣，泛酸又被稱作維生素B5，是多種代謝所必需的輔酶A的組成部分。根據(jù)目前文獻(xiàn)報(bào)道β -丙氨酸的合成方法主要有以下幾種 I、化學(xué)合成法
(I)丙烯酸法(US 2376334 Α, 1945. 05. 22 ；US 3105092 A, 1963. 09. 24 ；US 3846489 A,1974. 11.05):丙烯酸、丙烯酸酯或丙烯酸鹽與氨水，在較高的溫度和壓力下發(fā)生氨化反應(yīng)，得到丙氨酸。丙烯酸法副產(chǎn)物多，需要高溫高壓，丙烯酸本身的腐蝕性很強(qiáng)，所以反應(yīng)對(duì)設(shè)備的要求較高。(2)丙烯腈法(US 2335997 Α, 1943. 12. 07 ；US 2377401 A, 1947. 06. 14):丙烯腈與氨在高溫高壓下反應(yīng)生成氨基丙腈，然后在酸性或堿性條件下水解反應(yīng)生成丙氨酸。丙烯腈法使用劇毒的丙烯腈，對(duì)安全防護(hù)要求較高，反應(yīng)需要高溫高壓，對(duì)設(shè)備要求也較高，反應(yīng)收率低，由于水解過程中生成大量無機(jī)鹽，產(chǎn)品提純較為困難，產(chǎn)品純度不高。(3) β -氨基丙腈法(US 2336067 Α, 1943. 12. 07 ；J. Am. Chem. Soc. 1945, 67, 876 ~877) : β-氨基丙腈在酸性或堿性條件下水解生成β-丙氨酸。氨基丙腈法的特點(diǎn)是反應(yīng)產(chǎn)率高，缺點(diǎn)是β -氨基丙腈的價(jià)格較高，造成生產(chǎn)成本過高,另外中和過程中會(huì)產(chǎn)生大量的鹽，造成提取困難。2、生物合成法
(I)丙烯酸加氨酶法(CN 1285730 C，2006. 11. 22):先培養(yǎng)微生物產(chǎn)生氨基化酶，然后將氨基化酶加入烯酸和氨的水溶液的反應(yīng)液中，在酶的作用下合成β -丙氨酸，經(jīng)脫氨、純化后得β-丙氨酸產(chǎn)品。該方法反應(yīng)效率高，成本低，但原料丙烯酸為強(qiáng)腐蝕性和刺激性液體，對(duì)人員安全和設(shè)備的要求較高，目前未見有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的報(bào)道。(2) L-天冬氨酸-α-脫羧酶法(CN 1242054 Α, 2006. 01. 19):以DL-天冬氨酸為原料，在L-天冬氨酸-α -脫羧酶法的作用下生成D-天冬氨酸和β -丙氨酸，然后調(diào)節(jié)pH值使D-天冬氨酸結(jié)晶析出，從而獲得β-丙氨酸。該方法丙氨酸含有少量的D-天冬氨酸，產(chǎn)品的純度不高；L-天冬氨酸-α -脫羧酶活力低，酶促反應(yīng)的效率低，原料DL-天冬氨酸價(jià)格較高，造成丙氨酸成本較高。(3)腈水解酶法(JP特開平10-42886 Α，2006· 02. 17):利用產(chǎn)有機(jī)腈水解酶的微
生物催化β-氨基丙腈合成丙氨酸。該法底物氨基丙腈價(jià)格高，且反應(yīng)濃度低，生產(chǎn)成本相對(duì)較高，經(jīng)濟(jì)效益差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種安全、環(huán)保、高效、成本低、產(chǎn)品品質(zhì)高的生物催化合成β_丙氨酸的方法，徹底杜絕了傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝中劇毒、強(qiáng)腐蝕性、強(qiáng)酸強(qiáng)堿和高價(jià)原料的使用。本發(fā)明達(dá)到發(fā)明目的所采用的技術(shù)方案是
本發(fā)明所采用的微生物為大腸桿菌屬菌株，在培養(yǎng)基上純培養(yǎng)，獲得兩種酶天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α -脫羧酶，富馬酸溶解于氨水中配制成反應(yīng)的底物一富馬酸銨溶液，將含酶的大腸桿菌細(xì)胞加入底物中進(jìn)行酶促反應(yīng)，從而生成β -丙氨酸。本發(fā)明所用的種子培養(yǎng)基為富馬酸I 10g/L，玉米漿干粉10 20g/L，多肽朊 5 15g/L,味精 5 10g/L, MgSO4 · 7H20 O. 2 O. 5g/L, K2HPO4 O. 15 O. 25g/L, NaClO. I O. 5g/L，用氨水調(diào)pH6. 8 7. 5 ;發(fā)酵培養(yǎng)基為富馬酸5 15g/L，玉米漿干粉10 20g/L，多肽朊5 15g/L，L-天冬氨酸5 15g/L，甜菜堿鹽酸鹽O. I O. 5g/L，MgSO4 ·7Η20O. 2 O. 5g/L, K2HPO4 O. 15 O. 25g/L, NaCl O. I O. 5g/L，用氨水調(diào) ρΗ6· 8 7. 5。本發(fā)明所述大腸桿菌的培養(yǎng)溫度為28 45°C，轉(zhuǎn)速150 300r/min，培養(yǎng)時(shí)間16 32h。本發(fā)明所述底物的pH為6. O 7. 5，底物中富馬酸的濃度為50 150g/L。本發(fā)明所述酶促反應(yīng)中大腸桿菌細(xì)胞的添加量為20 50g/L。本發(fā)明所述酶促反應(yīng)的溫度為32 50°C，pH為6. O 7. 5。本發(fā)明采用流加富馬酸來控制反應(yīng)過程中的pH。本發(fā)明所述的一種生物催化合成β -丙氨酸的方法，其有益效果主要體現(xiàn)在
(O反應(yīng)過程中沒有使用劇毒、強(qiáng)腐蝕性、強(qiáng)酸強(qiáng)堿原料，生產(chǎn)工藝安全環(huán)保；
(2)反應(yīng)直接生成β-丙氨酸，工藝簡(jiǎn)單易行；
(3)反應(yīng)過程中溫度為32 50°C，pH為6.O 7. 5，反應(yīng)條件溫和；
(4)反應(yīng)中無副產(chǎn)物和大量的鹽產(chǎn)生，提取工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)品純度高；
(5)原材料富馬酸廉價(jià)易得，底物濃度高，產(chǎn)率高，生產(chǎn)成本低。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于此。實(shí)施例I :含量的測(cè)定
(O富馬酸含量的測(cè)定(高效液相色譜法)
酶促反應(yīng)液10000r/min離心沉淀細(xì)胞,取上清液并稀釋10倍，同時(shí)準(zhǔn)備富馬酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(2mg/ml),進(jìn)行高效液相色譜分析。柱型號(hào)Alltech有機(jī)酸色譜柱 No. 88645, 250mmX 4. 6mm 流動(dòng)相25mmol/L KH2PO4, pH2. 5
進(jìn)樣量20 μ I 柱溫35°C
梯度方式恒流I. 0ml/min 檢測(cè)器紫外波長(zhǎng)210nm 計(jì)算方式外標(biāo)法(2)β-丙氨酸含量的測(cè)定(高效液相色譜法)
分別取提取烘干的β_丙氨酸樣品和丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(2mg/ml)，進(jìn)行高效液相色譜分析。衍生方法準(zhǔn)確稱取O. 3430g鄰苯二甲醒溶于5ml無水乙醇中，然后加入O. 1472gN-乙酰-L-半胱氨酸，用O. lmol/L的硼砂緩沖液(pH=9. 5)定容到25ml，配制衍生劑避光備用。依次加入硼砂緩沖液(ρΗ=9· 5)300 μ I，樣品溶液250 μ 1，衍生劑250 μ I?；靹蚝蟮却?min (嚴(yán)格控制時(shí)間和試劑添加量)，然后進(jìn)樣。柱型號(hào)XDB-C8中性柱，150mmX4. 6mm 流動(dòng)相A 0. 05mol/L醋酸鈉緩沖液，B :甲醇 進(jìn)樣量20μ I
柱溫30°C
梯度方式流動(dòng)相A :流動(dòng)相B=65 :35，恒流I. Oml/min 檢測(cè)器紫外波長(zhǎng)334nm 計(jì)算方式外標(biāo)法
實(shí)施例2 :生物催化合成β-丙氨酸
種子培養(yǎng)基富馬酸5g，玉米漿干粉10g，多肽朊10g，味精10g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，K2HPO4 O. 15g，NaCl 0. 4g，加水配制成IL的溶液并用氨水調(diào)ρΗ7· 0,121°C蒸汽滅菌20min。發(fā)酵培養(yǎng)基富馬酸20g，玉米漿干粉40g，多肽朊40g，L-天冬氨酸20g，甜菜堿鹽酸鹽O. 8g，MgSO4 · 7H20 O. 8g，K2HPO4 O. 6g，NaCl 0. 4g，加水配制成4L的溶液并用氨水調(diào)pH7. 0,121°C蒸汽滅菌 20min。底物溶液富馬酸100g，用氨水調(diào)節(jié)pH7. 5，定容至1L。大腸桿菌斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，200r/min，37°C搖床培養(yǎng)24h。以10%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，200r/min, 37°C搖床培養(yǎng)18h得到發(fā)酵液，用離心機(jī)在4000r/min轉(zhuǎn)速下，離心收集126g大腸桿菌濕細(xì)胞。取35g大腸桿菌的濕細(xì)胞加入底物溶液，進(jìn)行酶促反應(yīng)，不斷流加富馬酸來控制反應(yīng)的PH7. 5，反應(yīng)18h后pH保持穩(wěn)定，流加富馬酸64g，再繼續(xù)反應(yīng)，每間隔Ih取樣一次，用HPLC檢測(cè)富馬酸含量，4h后檢測(cè)反應(yīng)液中富馬酸含量<0. 1%，反應(yīng)完成。反應(yīng)液在4000r/min離心去除大腸桿菌細(xì)胞，加活性炭脫色，過濾，減壓濃縮至原體積的1/4，在緩慢攪拌條件下，滴加3倍體積無水乙醇，有大量白色結(jié)晶析出，抽濾出晶體并用少量無水乙醇洗滌，烘干后稱量得白色固體101. 8g，收率為80. 9%，用HPLC檢測(cè)β -丙氨酸的含量為99. 2%。實(shí)施例3 :生物催化合成丙氨酸
種子培養(yǎng)基富馬酸10g，玉米漿干粉15g，多肽朊5g，味精8g，MgS04*7H20 0. 3g, K2HPO4
O.20g, NaCl O. 25g，加水配制成IL的溶液并用氨水調(diào)ρΗ7· 2，121°C蒸汽滅菌20min。發(fā)酵培養(yǎng)基富馬酸40g，玉米漿干粉60g，多肽朊20g，L-天冬氨酸40g，甜菜堿鹽酸鹽I. 0g, MgSO4 · 7H20 I. 0g, K2HPO4 O. 8g，NaCl I. 0g，加水配制成4L的溶液并用氨水調(diào)pH7. 2,121°C蒸汽滅菌 20min。底物溶液富馬酸80g，用氨水調(diào)節(jié)pH7.0，定容至1L。大腸桿菌斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，250r/min，32°C搖床培養(yǎng)20h。以10%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，250r/min, 32°C搖床培養(yǎng)24h得到發(fā)酵液，用離心機(jī)在4000r/min轉(zhuǎn)速下，離心收集142g大腸桿菌濕細(xì)胞。取25g大腸桿菌的濕細(xì)胞加入底物溶液，進(jìn)行酶促反應(yīng)，不斷流加富馬酸來控制反應(yīng)的PH7. O,反應(yīng)16h后pH保持穩(wěn)定，流加富馬酸68g，再繼續(xù)反應(yīng)，每間隔Ih取樣一次，用HPLC檢測(cè)富馬酸含量，4h后檢測(cè)反應(yīng)液中富馬酸含量<0. 1%，反應(yīng)完成。反應(yīng)液在4000r/min離心去除大腸桿菌細(xì)胞，加活性炭脫色，過濾，減壓濃縮至原體積的1/4，在緩慢攪拌條件下，滴加3倍體積無水乙醇，有大量白色結(jié)晶析出，抽濾出晶體并用少量無水乙醇洗滌，烘干后稱量得白色固體85. 6g，收率為75. 4%，用HPLC檢測(cè)β -丙氨酸的含量為98. 9%。實(shí)施例4 :生物催化合成丙氨酸
種子培養(yǎng)基富馬酸8g，玉米漿干粉20g，多肽朊15g，味精5g，MgS04*7H20 O. 5g, K2HPO4O. 25g, NaCl O. 5g,加水配制成IL的溶液并用氨水調(diào)pH7. 5,121°C蒸汽滅菌20min。 發(fā)酵培養(yǎng)基富馬酸60g，玉米漿干粉80g，多肽朊60g，L-天冬氨酸60g，甜菜堿鹽酸鹽2. 0g, MgSO4 · 7H20 2. 0g, K2HPO4 I. 0g, NaCl 2. 0g，加水配制成4L的溶液并用氨水調(diào) pH7. 5,121°C蒸汽滅菌 20min。底物溶液富馬酸140g，用氨水調(diào)節(jié)pH6. 5，定容至1L。大腸桿菌斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，300r/min，4rC搖床培養(yǎng)18h。以10%的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，300r/min，4rC搖床培養(yǎng)27h得到發(fā)酵液，用離心機(jī)在4000r/min轉(zhuǎn)速下，離心收集161g大腸桿菌濕細(xì)胞。取45g大腸桿菌的濕細(xì)胞加入底物溶液，進(jìn)行酶促反應(yīng)，不斷流加富馬酸來控制反應(yīng)的PH6. 5，反應(yīng)25h后pH保持穩(wěn)定，流加富馬酸97g，再繼續(xù)反應(yīng)，每間隔Ih取樣一次，用HPLC檢測(cè)富馬酸含量，6h后檢測(cè)反應(yīng)液中富馬酸含量<0. 1%，反應(yīng)完成。反應(yīng)液在4000r/min離心去除大腸桿菌細(xì)胞，加活性炭脫色，過濾，減壓濃縮至原體積的1/3，在緩慢攪拌條件下，滴加3倍體積無水乙醇，有大量白色結(jié)晶析出，抽濾出晶體并用少量無水乙醇洗滌，烘干后稱量得白色固體155. 3g，收率為85. 4%，用HPLC檢測(cè)β -丙氨酸的含量為99. 0%。
權(quán)利要求
1.一種生物催化合成β-丙氨酸的方法，其特征在于本發(fā)明采用的微生物為大腸桿菌屬菌株，在培養(yǎng)基上純培養(yǎng)，獲得兩種酶天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α -脫羧酶，富馬酸溶解于氨水中配制成反應(yīng)的底物一富馬酸銨溶液，將含酶的大腸桿菌細(xì)胞加入底物中進(jìn)行酶促反應(yīng)，從而生成β_丙氨酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種生物催化合成丙氨酸的方法，其特征在于種子培養(yǎng)基為富馬酸I 10g/L，玉米漿干粉10 20g/L，多肽朊5 15g/L，味精5 10g/L，MgSO4 ·7Η20 O. 2 O. 5g/L, K2HPO4 O. 15 O. 25g/L，NaCl O. I O. 5g/L，用氨水調(diào) ρΗ6· 8 7.5 ;發(fā)酵培養(yǎng)基為富馬酸5 15g/L，玉米漿干粉10 20g/L，多肽朊5 15g/L，L-天冬氨酸 5 15g/L，甜菜堿鹽酸鹽 O. I O. 5g/L，MgSO4 · 7H20 O. 2 O. 5g/L，K2HPO4 O. 15 O.25g/L, NaCl O. I O. 5g/L，用氨水調(diào) ρΗ6· 8 7. 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種生物催化合成丙氨酸的方法，其特征在于大腸桿菌的培養(yǎng)溫度為28 45°C，轉(zhuǎn)速150 300r/min，培養(yǎng)時(shí)間16 32h。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種生物催化合成β-丙氨酸的方法，其特征在于底物的pH為6. O 7. 5，底物中富馬酸的濃度為50 150g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種生物催化合成丙氨酸的方法，其特征在于酶促反應(yīng)中大腸桿菌細(xì)胞的添加量為20 50g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種生物催化合成丙氨酸的方法，其特征在于酶促反應(yīng)的溫度為32 50°C，pH為6· O 7· 5。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或5所述的一種生物催化合成β-丙氨酸的方法，其特征在于利用流加富馬酸來控制反應(yīng)過程中的pH。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種生物催化合成β-丙氨酸的方法，屬于酶工程領(lǐng)域。該方法是培養(yǎng)大腸桿菌屬微生物，獲得天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脫羧酶，將含酶的大腸桿菌細(xì)胞和富馬酸銨水溶液混合，進(jìn)行酶反應(yīng)生成β-丙氨酸。該方法原料廉價(jià)易得，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、安全、環(huán)保，反應(yīng)條件溫和、效率高，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)品品質(zhì)高，與傳統(tǒng)方法相比，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)保效益。
文檔編號(hào)C12P13/06GK102851333SQ20121007513
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月21日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請(qǐng)人:蔣光玉