專利名稱：發(fā)酵過程中添加NaCl生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高效發(fā)酵生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的方法。
背景技術(shù)：
Y -聚谷氨酸(poly- γ -glutamic acid,簡稱γ -PGA)是由L_谷氨酸或D-谷氨酸通過Y-酰胺鍵結(jié)合形成的一種水溶性的生物高分子聚合物。由于Y-聚谷氨酸具有吸水性、可降解性、水解性等眾多特性，因此被廣泛用于醫(yī)藥、食品加工、農(nóng)業(yè)、綠化以及水處理等多種領(lǐng)域，具有極大的開發(fā)價值和應(yīng)用前景。γ -聚谷氨酸最初由炭疽芽抱桿菌中發(fā)現(xiàn)，在高(X)2濃度的誘導(dǎo)下，炭疽芽抱桿菌可產(chǎn)生Y-D-聚谷氨酸，產(chǎn)生的Y-D-聚谷氨酸附著在細胞壁上并在微生物細胞外面形成莢膜，炭疽芽抱菌株的毒性限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。由于枯草芽孢桿菌和地衣芽抱桿菌的易培育性和安全性，現(xiàn)在聚谷氨酸的生產(chǎn)大多報道由此類菌株產(chǎn)生。Y-聚谷氨酸一般以游離形式直接分泌到培養(yǎng)基中，可靜態(tài)發(fā)酵也可動態(tài)發(fā)酵，可稱為游離型Y-聚谷氨酸。 Y -聚谷氨酸可作為細胞外營養(yǎng)物存儲，可促進細胞膜的形成，在非常時期為微生物提供生存所需，可防止噬菌體的侵襲，并在高鹽環(huán)境下對金屬離子進行包裹從而對細胞具有保護作用。目前國內(nèi)外主要采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)Y-聚谷氨酸。迄今所報道的Y-PGA產(chǎn)生菌主要有四種枯草(納豆)芽孢桿菌(BaciLLus subtiLis)、地衣芽孢桿菌(BaciLLus Licheniformis)、而 高溫芽 包桿菌(BaciLLus thermotoLerant)、炭Iil芽 包桿菌(BaciLLus. anthracis)，盡管許多研究者對微生物發(fā)酵法生產(chǎn)Y -聚谷氨酸進行了大量研究，但產(chǎn)率普遍還處于較低水平，生產(chǎn)成本高，這在很大程度上限制了 Y -聚谷氨酸的工業(yè)生產(chǎn)與應(yīng)用。由于Y-PGA生物合成的機理至今尚不很清楚，而且菌株生成Y-PGA的代謝途徑復(fù)雜， 調(diào)節(jié)方式多樣，目前提高其生產(chǎn)效率的方法主要依靠選育優(yōu)良菌種和優(yōu)化發(fā)酵工藝。因此提高Y-聚谷氨酸的生產(chǎn)效率是大規(guī)模生產(chǎn)與應(yīng)用亟待解決的重要課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的發(fā)酵工藝以提高Y-聚谷氨酸(Y-PGA)的產(chǎn)量， 即將納豆芽孢桿菌在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)一段時間后添加NaCl以提高發(fā)酵基質(zhì)的滲透壓，再繼續(xù)培養(yǎng)至發(fā)酵終點以提高Y-PGA產(chǎn)量。一般認(rèn)為γ -PGA是某些細菌的莢膜或黏液層的主要有機成分，而莢膜或黏液層的形成既是這些細菌的遺傳屬性，也與其所處環(huán)境條件密切相關(guān)。如對數(shù)期的細菌很少形成莢膜，進入穩(wěn)定期后才開始大量形成，這是細菌對環(huán)境劣變(如營養(yǎng)成分減少、代謝廢物增加)的一種適應(yīng)機制。有文獻報道(李大力等，化學(xué)與生物工程，24:50-51，2007)在配制培養(yǎng)基時添加NaCl培養(yǎng)枯草芽孢桿菌能提高Y -PGA的產(chǎn)量，并認(rèn)為這是菌種對滲透壓提高的一種適應(yīng)機制。但我們的研究發(fā)現(xiàn)這種添加NaCl的方式在培養(yǎng)納豆芽孢桿菌 (Bacillus subtilis natto) CICC20643時并不能提高γ-PGA的產(chǎn)量，甚至使產(chǎn)量和生物量CN 102533885 A
都降低。究其原因是較高的滲透壓對納豆芽孢桿菌的生長會造成一定程度的抑制，使生物量比未加入NaCl的狀態(tài)下要少一些。因此先讓納豆芽孢桿菌在不受抑制的狀態(tài)下培養(yǎng)，待其進入穩(wěn)定期后加入NaCl再繼續(xù)培養(yǎng)，則既保證了足夠的生物量，又形成了合成Y -PGA的有利環(huán)境，其結(jié)果使Y-PGA產(chǎn)量提高。本發(fā)明提供的生產(chǎn)γ -聚谷氨酸的方法采取如下步驟(1)、將納豆芽孢桿菌斜面菌種接種于已滅菌冷卻的液態(tài)種子培養(yǎng)基中，在30 37°C搖瓶培養(yǎng)18 36h，即成納豆芽孢桿菌種子液；O)、將納豆芽孢桿菌種子液按 6%接種量接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于 30 37°C搖瓶培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)12 36h ；然后在培養(yǎng)基中添加重量體積百分比為3% 6%的NaCl，NaCl以固體顆?；蛉芤籂顟B(tài)加入，添加NaCl后繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)36 48h，終止發(fā)酵；(3)、對發(fā)酵液進行提取、純化，制得含Y-聚谷氨酸的產(chǎn)品。其中，液態(tài)種子培養(yǎng)基，以重量體積百分比計，單位為g/L，其組成為蛋白胨8 12g/L，牛肉膏 4 6g/L，NaC18 12g/L，pH6. 5 7. 5，其余為水。其中，液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，以重量體積百分比計，單位為g/L，其組成為蔗糖或葡萄糖 20 25g/L，酵母膏 5 10g/L，谷氨酸鈉 20 50g/L，Na2HPO4 lg/L，NaH2PO4 lg/L，MgSO4 0. 5g/L，ρΗ6· 0 7. 5，其余為水。本發(fā)明的優(yōu)點在于在菌種生長穩(wěn)定期加入NaCl不影響菌種生長，這樣既保證了足夠的生物量，又形成了合成Y-PGA的有利環(huán)境，結(jié)果使Y-PGA產(chǎn)量提高。本方法比接種前添加NaCl或不加NaCl能提高Y -聚谷氨酸的產(chǎn)量10% 40 %，且操作簡單、便于大規(guī)模生產(chǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。
具體實施例方式實施例1 搖瓶發(fā)酵(1)種子液的制備生產(chǎn)γ-PGA采用的納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto)來自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC)，菌種編號CICC 20643。種子培養(yǎng)基組成為蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaC110g/L, pH7. 0，其余為蒸餾水或自來水，裝液量50mL/250 mL三角瓶，在121 °C 滅菌30min，冷卻后，取一環(huán)預(yù)先保存于斜面培養(yǎng)基的納豆芽孢桿菌接種于種子培養(yǎng)基中， 在37°C、120 r/min搖瓶培養(yǎng)對h，即成納豆芽孢桿菌種子液。⑵搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分25g/L，酵母膏5g/L，谷氨酸鈉40g/L，Na2HPO4 lg/L, NaH2PO4 lg/L, MgSO4 0. 5g/L，其余為蒸餾水；初始pH值為6. 5，裝液量70 mL/250mL三角瓶，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min，在發(fā)酵24h后添加50g/LNaCl，NaCl以固體顆粒經(jīng)滅菌后按無菌操作方式加入；繼續(xù)培養(yǎng)4 后終止發(fā)酵。C3) Y-PGA 的提取將發(fā)酵液于5000r/min下離心25min,上清液用lmol/L HCl調(diào)pH到3. 0，加入4 倍體積的95%乙醇，放于4°C下冰箱內(nèi)過夜。然后于5000r/min下離心20min，用乙醇洗滌沉淀物，收集粘性沉淀物，干燥得Y-PGA產(chǎn)品。
實施例2 液態(tài)深層發(fā)酵(1)種子液的制備同實例1。(2)液態(tài)深層培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分葡萄糖20g/L、酵母粉10g/L、谷氨酸鈉20g/L、磷酸氫二鈉 lg/L、磷酸氫二鈉lg/L、硫酸鎂0. 5g/L，其余為自來水；初始pH值為7. 0，在5L微生物發(fā)酵罐中加入3L發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌冷卻后以5%接種量接入納豆芽孢桿菌種子液，37°C培養(yǎng)，通氣比0. 5 0. 8 (ν/ν)，攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)24h后添加4%的NaCl，NaCl以濃溶液經(jīng)滅菌后按無菌操作方式加入。繼續(xù)在37°C培養(yǎng)36h后結(jié)束，培養(yǎng)過程通氣比降低至 0. 3 0. 5 (ν/ν) ο(3) γ -PGA 的提取提取純化工藝同同實例1，Y -PGA的最高產(chǎn)量達到29. 76g/L。
權(quán)利要求
1.發(fā)酵過程中添加NaCl生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于采取如下步驟(1)、將納豆芽孢桿菌斜面菌種接種于已滅菌冷卻的液態(tài)種子培養(yǎng)基中，在30 37°C 搖瓶培養(yǎng)18 36h，即成納豆芽孢桿菌種子液；(2)、將納豆芽孢桿菌種子液按1% 6%接種量接種于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 37°C搖瓶培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)12 36h ；然后在培養(yǎng)基中添加重量體積百分比為3% 6%的 NaCl, NaCl以固體顆?；蛉芤籂顟B(tài)加入，添加NaCl后繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)或通氣培養(yǎng)36 48h， 終止發(fā)酵；(3)、對發(fā)酵液進行提取、純化，制得含Y-聚谷氨酸的產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵過程中添加NaCl生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于所述的液態(tài)種子培養(yǎng)基，以重量體積百分比計，單位為g/L，其組成為蛋白胨8 12g/L，牛肉膏4 6g/L, NaC18 12g/L, ρΗ6· 5 7. 5，其余為水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)酵過程中添加NaCl生產(chǎn)Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于所述的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，以重量體積百分比計，單位為g/L，其組成為蔗糖或葡萄糖20 25g/L，酵母膏 5 10g/L，谷氨酸鈉 20 50g/L，Na2HPO4 lg/L，NaH2PO4 lg/L，MgSO4 0. 5g/ L，pH6. 0 7. 5，其余為水。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種發(fā)酵過程中添加NaCl生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法。本方法以納豆芽孢桿菌為γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)菌，主要發(fā)酵工藝步驟包括將菌種在液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中預(yù)先好氧培養(yǎng)一段時間，然后添加NaCl以提高發(fā)酵基質(zhì)的滲透壓，再繼續(xù)好氧培養(yǎng)至發(fā)酵終點等三個步驟。本方法比接種前添加NaCl或不加NaCl能明顯提高γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量，且操作簡單、便于大規(guī)模生產(chǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12P13/02GK102533885SQ201210006209
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者朱丹, 鄒水洋 申請人:東莞理工學(xué)院