專利名稱：特異性檢測西瓜上果斑病菌的pcr方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種西瓜上果斑病菌(Acidovorax citrulli)的檢測方法，具體涉及一種特異性檢測西瓜上果斑病菌的PCR(聚合酶鏈式反應)技術。
背景技術：
在PCR檢測方面，PCR引物特異性很難令人滿意，一些文獻做PCR或?qū)崟r熒光 PCR沒有用相近細菌作對照，只介紹了靈敏度而沒有介紹特異性，而瓜類作物上除了果斑病菌還有角斑病菌等其它細菌。有的PCR引物設計很不合理，如某學位論文的PCR引物 5’ -GACCAGCCACACTGGGAC-3’經(jīng)BLAST居然出現(xiàn)排在前面的序列沒有果斑病菌序列。
另一碩士論文中設計的PCR引物也是如此，用其設計的引物做BLAST，結果前30條序列中沒有果斑病菌序列。第；34-37條才是此果斑病菌的序列，然而序列覆蓋率只有90 %， 其中相同堿基只有95%。
還有一篇論文中也是在16S rDNA區(qū)設計的PCR引物，用正向引物做BLAST，前1萬個找到的序列都是100%覆蓋和100%堿基相同，而果斑病菌的前5千個序列中沒有出現(xiàn)， 反向引物BLAST前250條序列都是100 %覆蓋和100 %堿基相同。這些100 %覆蓋和100 % 堿基相同的序列有不少是植物內(nèi)生菌，檢測時必然有假陽性出現(xiàn)。
因此，采用以上PCR引物檢測果斑病菌時，并不能明顯區(qū)分出果斑病菌和其他病菌，更不能檢測出西瓜上果斑病菌，因此檢測技術特異性是一個亟待解決的難題。
本人亦試圖依據(jù)果斑菌16S序列來設計引物，結果未能成功找到特異性好的備選序列。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決技術問題是針對上述現(xiàn)有技術的不足，提供一種特異性檢測西瓜上果斑病菌(Acidovorax citrulli)的PCR方法，解決了西瓜上果斑病菌PCR檢測上引物特異性不好的問題，可以準確地檢測西瓜上帶果斑病菌的情況。
為了解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案是一種特異性檢測西瓜上果斑病菌的PCR方法，該方法是以西瓜上果斑病菌特異性引物對待測樣品進行PCR擴增，最后電泳鑒定，該特異性引物為
正向引物5，-GTCCGAGCGTACGTTGAG-3，，
反向引物5，-ACGGCACCTGACCCGTTG-3，。
詳述如下
一、引物的設計
發(fā)明人利用細菌種間甚至亞種間菌毛蛋白基因核苷酸序列的特異性，從NCBI/ GenBank搜索并下載了果斑病菌AAC00-1菌系IV型菌毛蛋白基因(GenBank :CP000512. 1全基因組序列上從第30414 個堿基到第3041923個堿基共495個堿基)的核苷酸序列，運用MEGA4. 0軟件對這些序列進行比對，經(jīng)BLAST只找到其本身，見圖1。
依據(jù)此序列用primerBLAST工具設計PCR引物序列如下正向引物5，-GTCCGAGCGTACGTTGAG-3，(如SEQ ID No 1 所示)反向引物5，-ACGGCACCTGACCCGTTG-3，(如SEQ ID No 2 所示)；上述引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。PCR產(chǎn)物預期大小為333個堿基。將正向引物和反向引物分別經(jīng)BLAST檢索，見圖2和圖3。結果表明該正向引物和反向引物的序列與果斑病菌AAC00-1菌系IV型蛋白基因序列100%相同，而與其它菌的序列最高覆蓋率只有88%。二、病菌的PCR過程西瓜上細菌基因組DNA的提取取西瓜上的果斑細菌在常用的肉汁胨細菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)20-30h，得到單菌落，再用無菌牙簽挑取單菌落，洗入10 μ 1 ddH20中，99°C處理lOmin，離心后收集上清液，至于冰上備用。用上述設計的引物對對果斑細菌總DNA進行擴增，預計擴增片段約為33!3bp。PCR 擴增體系 05 μ 1) :DNA 擴增模板 IylUOXPCR Buffer 2·5μ1、 dNTPs (IOmm) O. 5 μ 1、Taq 酶(2· 5 μ / μ 1) O. 5 μ 1、Forward Primer (IOmm) 1 μ 1、Reverse Primer(IOmm) 1 μ dd H2O 18. 5 μ 1。序列擴增條件預變性94 "C 5min ；循環(huán)參數(shù)94 "C 30sec ；56 "C 30sec ； 720C 40sec ；共 30 個循環(huán)；72°C IOmin 延伸。三、PCR擴增產(chǎn)物的鑒定擴增產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)電泳并用凝膠成像系統(tǒng)檢查，結果出現(xiàn)的條帶與預期的大小相符。PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆在T載體上后測序，測序結果經(jīng)BLAST，只找到Acidovorax citrulli AAC00-1全基因組序列(Rb|CP000512. 1|)，與其的第3041605至3041900號堿基相同，見圖 4。(因測序結果要刪除引物序列，所以PCR產(chǎn)物的序列大小只有四6個堿基)。本文中提及的PCR技術包含從PCR衍生的所有技術，如實時熒光PCR。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點是本方法使用的一對引物是根據(jù)西瓜上果斑病菌菌系AAC00-1全基因組序列上的IV型菌毛蛋白基因序列設計的，使用此對引物做PCR檢測時，不僅可將它種細菌排除，將西瓜上果斑病菌與其它細菌準確區(qū)分開來，且可區(qū)分西瓜上的果斑病菌和甜瓜上的果斑病菌，特異性高。


圖1是果斑病菌IV型菌毛蛋白基因序列的BLAST結果。圖2是本發(fā)明正向引物的BLAST結果。圖3是本發(fā)明反向引物的BLAST結果。圖4是用本發(fā)明引物作PCR的擴增產(chǎn)物的堿基序列的BLAST結果。圖5是用本發(fā)明設計的引物對作PCR的初步檢驗結果。圖中從左至右的5道電泳帶依次為雜菌，西瓜菌株1，甜瓜菌株，西瓜菌株2， Marker0圖6是用本發(fā)明設計的引物對作PCR的檢驗結果。圖中從左至右的7道電泳帶依次為Marker，西瓜菌株1，西瓜菌株2，甜瓜菌株 1，甜瓜菌株2，甜瓜菌株3，雜菌。
圖7是甜瓜上果斑菌株16S核糖體RNA基因堿基序列的BLAST結果。圖8是用本發(fā)明引物對對接種西瓜果斑病菌的西瓜葉片的PCR檢測結果。圖中從左至右的7道電泳帶依次為第1道為2000Marker，第2-7道為病葉樣本。
具體實施例方式實施例一從中國農(nóng)業(yè)科學院植保所趙廷昌實驗室得到5個果斑菌株(全已做16S核糖體 RNA基因測序和BLAST比對經(jīng)及接種試驗)。首先用本發(fā)明的引物對對2個西瓜上的菌株 (分別采自海南三亞(西瓜菌株1)和黑龍江哈爾濱(西瓜菌株幻)和1個甜瓜上的菌株 (采自內(nèi)蒙古臨河市)這3個菌株以及1個雜菌做了初步PCR檢測。結果只有西瓜上的2 個菌株為陽性，擴增出的條帶大小與預期的333個堿基相符。甜瓜上的菌株和雜菌均為陰性，見圖5。為保證試驗的準確性，又增加了另外2個甜瓜菌株(分別采自新疆(甜瓜菌株2) 和海南(甜瓜菌株3))做PCR，結果還是一樣，見圖6，第2-3道的2個西瓜菌株為陽性，第 4-6道的3個甜瓜菌株均為陰性，第7道的雜菌為陰性。為了確認甜瓜上的3個菌株確為果斑菌，將這3個菌株的16S核糖體RNA基因做了 PCR。16SrDNA序列的擴增用16SrDNA序列通用引物對甜瓜上的細菌總DNA進行擴增，引物序列如下正向引物16SF 為5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，(如 SEQ ID No 3 所示)，反向引物16SR 為5，-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，(如 SEQ ID No 4 所示)，預計擴增片段約為1500bp。PCR 擴增體系(25 μ 1)DNA擴增模板 1 μ 1，10XPCR Buffer 2· 5 μ 1，dNTPs (IOmm) 0· 5 μ 1，Taq 酶(2· 5 μ / μ 1)0. 5 μ 1, Forward Primer (IOmm) 1 μ 1, Reverse Primer (IOmm)1 μ 1, dd H2O 18.5 μ 1。I6SrDNA 序列擴增條件預變性 94°C 5min ；循環(huán)參數(shù):94 V 3Osec ；56°C 3Osec ； 72°C 90sec ；共 30 個循環(huán)；72°C IOmin 延伸。PCR產(chǎn)物測序后做BLAST，見圖7，結果表明這3個甜瓜菌株都是果斑菌。實施例二檢測染病西瓜葉片采用本發(fā)明的引物對檢測染果斑病的西瓜葉片，PCR檢測程序同前，但檢測對象不是菌種，而是接種西瓜果斑病菌后發(fā)病的西瓜葉片。結果從6個人工接種西瓜果斑病菌的西瓜葉片均得到陽性結果(圖8)，擴增出的條帶大小與預期的相符。由以上實施例可知，本發(fā)明的該對特異性引物對西瓜上果斑病菌是特異的，采用該引物對對西瓜上果斑病菌作PCR，能準確地將西瓜上果斑病菌與其它細菌準確區(qū)分開來， 且可區(qū)分西瓜上的果斑病菌和甜瓜上的果斑病菌。
權利要求
1.一種特異性檢測西瓜上果斑病菌的PCR方法，其特征在于該方法是以西瓜上果斑病菌特異性引物對待測樣品進行PCR擴增，最后電泳鑒定，該特異性引物為正向引物5’ -GTCCGAGCGTACGTTGAG-3， 反向引物5’ -ACGGCACCTGACCCGTTG-3，。
2.如權利要求1所述的特異性檢測西瓜上果斑病菌的PCR方法，其特征在于所述特異性引物是根據(jù)西瓜上果斑病菌AAC00-1菌系IV型菌毛蛋白基因的核苷酸序列設計的， PCR產(chǎn)物大小為333個堿基。
全文摘要
一種特異性檢測西瓜上果斑病菌(Acidovorax citrulli)的PCR方法，是根據(jù)西瓜上果斑病菌菌系AAC00-1全基因組序列上假定的IV型菌毛蛋白基因(GenBankCP000512.1)序列設計一對引物，BLAST結果表明這對引物的特異性非常好。用這對引物做PCR檢測時不僅可將它種細菌排除，且可區(qū)分西瓜上的果斑病菌和甜瓜上的果斑病菌，使用此對引物對可將西瓜上果斑病菌菌株與其它細菌準確區(qū)分開來，特異性高。
文檔編號C12Q1/68GK102492779SQ20111045287
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權日2011年12月30日
發(fā)明者高必達 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學