專利名稱：防治西瓜細(xì)菌性果斑病生防菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治西瓜細(xì)菌性果斑病病害的芽孢桿菌生防菌株JC65，屬于農(nóng)作物防病治病技術(shù)領(lǐng)域，專用于西瓜細(xì)菌性果斑病的無(wú)公害防治。背景技術(shù)：
西瓜細(xì)菌性果斑病(Bacterial fruit blotch of watermelon, BFB)是西瓜上的一種危險(xiǎn)性檢疫病害，又稱細(xì)菌性斑點(diǎn)病，該病最早于1969年由Crall和Schenck在美國(guó)佛羅里達(dá)州發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)只是對(duì)果斑病癥狀進(jìn)行了描述，未做病原菌的鑒定；目前為止，在我國(guó)許多省市，像新疆，陜西，河北，山西，吉林，福建，甘肅等地都已有果斑病的報(bào)道。該病害主要危害果實(shí)，引起西瓜果實(shí)腐爛等，可造成毀滅性損失，一旦發(fā)病用藥防治基本沒有效果。而且?guī)ЬN子將成為下一年重要的初侵染源。該病的發(fā)生嚴(yán)重影響了西瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)，成為西瓜生產(chǎn)上亟待解決的難題之一。該病害是由燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N(Acidovorax avenae subsp. citrulli,Aac)引起的，西瓜果斑目前在瓜類作物中無(wú)免疫品種。西瓜細(xì)菌性果斑病是一種毀滅性的細(xì)菌性病害，大田生長(zhǎng)期不易被發(fā)現(xiàn)，且發(fā)病突然、發(fā)展迅速，由于目前
還沒有發(fā)現(xiàn)種子處理的更好方法，目前生產(chǎn)中所采用的化學(xué)藥劑有農(nóng)用鏈霉素，可殺得，新植霉素，細(xì)菌殺，葉雙青，加瑞農(nóng)，琥膠肥酸銅等，雖然化學(xué)藥劑對(duì)該病有一定的防治效果，但是但防治效果不高，而且大量使用化學(xué)殺菌劑往往會(huì)造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留，以及引起病原菌抗藥性等問(wèn)題。生物防治是一種安全有效的防治手段，符合農(nóng)業(yè)持續(xù)發(fā)展的方向。現(xiàn)有技術(shù)中按照本實(shí)驗(yàn)室的菌體保藏液專利(公開專利號(hào)CN1358838，
公開日
2002年7月17日)方法，菌體可室溫保存2 3年。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是生物防治西瓜產(chǎn)業(yè)潛在危害較大的西瓜細(xì)菌性果斑病，通過(guò)拮抗酶活試驗(yàn)和溫室大棚試驗(yàn)，篩選得到的芽孢桿菌JC65的菌劑防治該病害效果較好， 防效可達(dá)50%以上。技術(shù)方案
一種防治西瓜細(xì)菌性果斑病病害的生防菌株JC65，為芽孢桿菌OfeciBm sp. )，2010年12月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心， 地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO. 4475。生防菌株JC65用于制備生防菌劑的方法為
1)將該菌株接種到LB培養(yǎng)液中30°C培養(yǎng)ISOrpm振蕩培養(yǎng)，12 16小時(shí)后在超凈工作臺(tái)中分別取樣測(cè)600nm處的OD值，測(cè)定過(guò)程中以未接菌的LB培養(yǎng)液來(lái)調(diào)零；
2)當(dāng)培養(yǎng)至OD值在0.5 0. 8之間時(shí)，將種子菌液以1 :100體積比加入裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的200L發(fā)酵罐中，300C 250rpm振蕩培養(yǎng)20 M小時(shí)，發(fā)酵液pH值維持在7. 0，溶氧量 20%,通氣量5-7 m3/小時(shí)，罐壓0. 05-0. IKPa0然后6000rpm離心IOmin,每IOOOml培養(yǎng)液
3獲得13 16g濕菌，每克濕菌含4 X 101° IO15個(gè)菌體，取濕菌與菌體保藏液按1 g :40ml 配成菌劑，成品中活菌總濃度為IXlO9 lX1012cfu/ml。其中
1)種子培養(yǎng)液LB配方氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，調(diào)節(jié)pH值為
7. 2 ；
2)發(fā)酵培養(yǎng)液配方麥芽糖2.5g/L，玉米粉5 g/L，黃豆粉5g/L，胰蛋白胨5g/L， 二水氯化鈣0. 5 g/L，一水硫酸錳0. 5 g/L,磷酸氫二鉀lg/L，調(diào)節(jié)pH值為7. 0 ；
3)菌體保藏液為0.Olmol/L磷酸鹽緩沖液，還含有濃度為0. 001mol/L的Tween20非離子型表面活性劑。有益效果
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)在本發(fā)明是專門針對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病病害開發(fā)的生防制劑。由于是生物制劑，完全沒有因化學(xué)農(nóng)藥的使用所帶來(lái)的一系列問(wèn)題，因而有利于西瓜的無(wú)公害生產(chǎn)，農(nóng)民可以不用或減少其他化學(xué)農(nóng)藥的用量，這不僅可為農(nóng)民節(jié)省開支，而且有利于西瓜的出口貿(mào)易。生防菌JC65菌體在平板拮抗試驗(yàn)中顯示對(duì)西瓜果斑病病原菌有較好的抑制作用 (圖1.);同時(shí)該菌具有蛋白酶(圖2.)，嗜鐵素酶(圖3.)以及纖維素酶活性(圖4.)，溫室大棚試驗(yàn)結(jié)果顯示，生防菌劑JC65對(duì)西瓜的促生作用效果顯著，生物量增加達(dá)到119. 00% (表1)，并且生防菌劑JC65對(duì)西瓜果斑病病害防效顯著，高達(dá)57. 63%(表2)，同時(shí)大田試驗(yàn)結(jié)果顯示生防菌劑JC65能夠顯著降低西瓜細(xì)菌性果斑病的發(fā)病率，其平均防效達(dá)50. 76%， 同時(shí)本制劑對(duì)西瓜具有顯著的促生作用，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該菌劑對(duì)無(wú)病田塊的增產(chǎn)平均能達(dá)到16. 96%，對(duì)有病田塊的增產(chǎn)能平均達(dá)至IJ 125. 30% (表3)
該菌劑用濕菌與本實(shí)驗(yàn)室的菌體保藏液(屬本實(shí)驗(yàn)室已授權(quán)專利，專利號(hào)ZL02112559. 7，公開專利號(hào)CN1358838，
公開日2002年7月17日)按1 :40 (g/ml)配成菌劑，可室溫保存2 3年。該菌劑可以稀釋后于西瓜播種或移摘時(shí)澆灌施用。四

圖1. Bacillus sp. JC65平板拮抗西瓜細(xì)菌性果斑病病菌效果； 圖2. Bacillus sp. JC65蛋白酶酶活試驗(yàn)效果圖3. Bacillus sp. JC65纖維素酶酶活試驗(yàn)效果圖4. Bacillus sp. JC65嗜鐵素酶酶活試驗(yàn)效果圖5. Bacillus sp. JC65對(duì)西瓜的促生作用五具體實(shí)施例方式
一種防治西瓜細(xì)菌性果斑病病害的生防菌株JC65，為芽孢桿菌OfeciBm sp.)，由浙江省德清縣梨園梨樹根圍土壤中分離得到。生防菌株ifeciBm 5/7. JC65用于制備生防菌劑的方法為
1)將該菌株接種到LB培養(yǎng)液中30°C培養(yǎng)ISOrpm振蕩培養(yǎng)，12 16小時(shí)后在超凈工作臺(tái)中分別取樣測(cè)600nm處的OD值，測(cè)定過(guò)程中以未接菌的培養(yǎng)液來(lái)調(diào)零；
2)當(dāng)培養(yǎng)至OD值在0.5 0. 8之間時(shí)，將種子菌液以1 :100體積比加入裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的200L發(fā)酵罐中，300C 250rpm振蕩培養(yǎng)20 M小時(shí)，發(fā)酵液pH值維持在7. 0，溶氧量 20%,通氣量5-7 m3/小時(shí)，罐壓0. 05-0. IKPa0然后6000rpm離心IOmin,每1000ml培養(yǎng)液獲得13 16g濕菌，每克濕菌含4 X 101° IO15個(gè)菌體，取濕菌與菌體保藏液按1 g :40ml
4配成菌劑，成品中活菌總濃度為1X109 lX1012cfu/ml。其中
種子培養(yǎng)液LB配方氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，調(diào)節(jié)pH值為
7. 2 ；
發(fā)酵培養(yǎng)液配方麥芽糖2. 5g/L，玉米粉5g/L，黃豆粉5g/L，胰蛋白胨5g/L，二水氯化鈣0. 5 g/L，一水硫酸錳0. 5 g/L,磷酸氫二鉀lg/L，調(diào)節(jié)pH值為7. 0 ；
菌體保藏液為0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液，還含有濃度為0. OOlmol/L的Tween20非離子型表面活性劑。下面將結(jié)合試驗(yàn)相關(guān)結(jié)果圖，進(jìn)行實(shí)施方案解釋 (1) 芽孢桿菌JC65菌體平板拮抗試驗(yàn)
選擇西瓜細(xì)菌性果斑病病原菌燕麥?zhǔn)人峋鷌Acidovorax avenae) FC440 (Jianjun Feng, Erin L. Schuenzel, Jianqiang Li, and Norman W. Schaad. 2009. Multilocus Sequence Typing Reveals Two Evolutionary Lineages of Acidovorax a venae subsp. Citrul 11. Bacteriology. 99(8): 913-920 )作為供試病原菌。將病原菌在LB培養(yǎng)液(氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，調(diào)節(jié)pH值為7. 2)中培養(yǎng)16-24 h至CFU 為108/ml)，加入熔化冷卻至40°C左右的固體培養(yǎng)基中，體積比1:200，將培養(yǎng)基每20mL倒入9 cm直徑的平板中。待冷卻凝固后，牙簽接種生防菌JC65。置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 24 h后記錄抑菌圈環(huán)徑。(2) 芽孢桿菌JC65菌體酶活測(cè)定試驗(yàn)
將生防菌JC65活化在LB平板上(氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，調(diào)節(jié)pH值為7.2)，培養(yǎng)M h,用牙簽挑取單菌落分別接種到蛋白酶，嗜鐵素酶，以及纖維素酶活測(cè)定的平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3 d,測(cè)量透明圈的大小。(3) 芽孢桿菌JC65溫室促生試驗(yàn)
將催芽后的西瓜種子播種于裝有無(wú)菌土壤中盆砵中，每盆一粒，16/8 h光周期。播種前保持土壤較為干燥。西瓜播種的同時(shí)進(jìn)行澆灌處理，將懸浮好的菌液以IO8 CFU/ml的濃度緩慢灌入西瓜種圍，每株20 ml，此后常規(guī)澆水。置于溫室中培養(yǎng)J8°C，70%相對(duì)濕度以上，生防菌接種30天后，分別取處理組和對(duì)照組植株，小心剔除根部土壤，清洗干凈后，自然風(fēng)干，分別統(tǒng)計(jì)地上部長(zhǎng)，地下部長(zhǎng)，植株鮮重。60°C，烘干72 h后測(cè)量植株干重。生物量增加(％)=(處理組植株干重-對(duì)照植株干重)/對(duì)照植株干重X 100% (4) 芽孢桿菌JC65溫室大棚防效試驗(yàn)
將催芽后的西瓜種子播種于裝有無(wú)菌土壤中盆砵中，每盆一粒，播種前保持土壤較為干燥。西瓜播種的同時(shí)進(jìn)行澆灌處理，將懸浮好的菌液以IO8 CFU/ml的濃度緩慢灌入西瓜種圍，每株20 ml，其中以清水作為對(duì)照，隨后置于溫室中培養(yǎng)J8°C，70%相對(duì)濕度以上， 16/8 h光周期。第二、三天只少量澆水保持種圍濕潤(rùn)即可，此后常規(guī)澆水。15天時(shí)再次使用生防菌噴施于植株葉片，待第二接種拮抗菌5天后，進(jìn)行病原菌的接種，接種濃度為IO7 CFU/ml，接種后3天，開始統(tǒng)計(jì)其發(fā)病率，并計(jì)算防效。病害嚴(yán)重度％=[Σ (病級(jí)株數(shù)X代表級(jí)數(shù))/植株總數(shù)X最高代表級(jí)值]X100% ；
防效％=(對(duì)照發(fā)病率一處理防病率)/對(duì)照發(fā)病率X100% ； 生物量增加％=(對(duì)照組生物量一處理組生物量)對(duì)照組生物量X100% ；(5)芽孢桿菌JC65大田試驗(yàn)
本試驗(yàn)共分兩個(gè)大區(qū)，分別為有病田塊與無(wú)病田塊，待西瓜移摘之際，將本制劑以每畝用量6-10 L的量與定根水混勻，進(jìn)行在植物根圍的澆灌，隨后分別在移摘后30 d, 60 d，以上述相同的方法與用量進(jìn)行跟蹤處理。在收獲之際，統(tǒng)計(jì)植株的發(fā)病情況與每個(gè)田塊的畝產(chǎn)量。從而計(jì)算各自的防效與促生情況。 病害嚴(yán)重度％=[Σ (病級(jí)株數(shù)X代表級(jí)數(shù))/植株總數(shù)X最高代表級(jí)值]X100% ；
防效％=(對(duì)照發(fā)病率一處理防病率)/對(duì)照發(fā)病率X100% ； 生物量增加％=(對(duì)照組生物量一處理組生物量)對(duì)照組生物量X100% ； 試驗(yàn)結(jié)果
(1)生防菌JC65拮抗病原菌試驗(yàn)結(jié)果
生防芽孢桿菌JC65菌體顯示較好的平板抑制效果(圖1.).
(2)芽孢桿菌JC65菌體平板酶活測(cè)定試驗(yàn)
生防芽孢桿菌JC65菌體具有蛋白酶活性，纖維素酶活性，以及嗜鐵素活性。(圖2， 圖3，圖4)
(3)芽孢桿菌JC65溫室促生試驗(yàn)
溫室促生試驗(yàn)結(jié)果顯示，芽孢桿菌JC65能夠顯著促進(jìn)西瓜的生長(zhǎng)，表現(xiàn)在西瓜的鮮重，干重，根長(zhǎng)，莖長(zhǎng)，與對(duì)照相比，都有顯著的增加，結(jié)果計(jì)算得芽孢桿菌JC65對(duì)西瓜的生物量增加能達(dá)119%。
權(quán)利要求
1.一種防治西瓜細(xì)菌性果斑病的生防菌株JC65，為芽孢桿菌(feciWm sp. )，2010年 12月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO. 4475。
2.用權(quán)利要求1所述生防菌株JC65制備的生防菌劑。
3.權(quán)利要求2所述生防菌劑在防治西瓜細(xì)菌性果斑病中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述生防菌株JC65用于制備生防菌劑的方法，1)將權(quán)利要求1所述生防菌株JC65接種到LB培養(yǎng)液中30°C培養(yǎng)ISOrpm振蕩培養(yǎng)， 12 16小時(shí)后在超凈工作臺(tái)中分別取樣測(cè)600nm處的OD值，測(cè)定過(guò)程中以未接菌的培養(yǎng)液來(lái)調(diào)零；2)當(dāng)培養(yǎng)至OD值在0.5 0. 8之間時(shí)，將種子菌液以1 :100體積比加入裝有發(fā)酵培養(yǎng)液的200L發(fā)酵罐中，300C 250rpm振蕩培養(yǎng)20 M小時(shí)，發(fā)酵液pH值維持在7. 0，溶氧量 20%,通氣量5-7 m3/小時(shí)，罐壓0. 05-0. IKPa,然后6000rpm離心IOmin,每IOOOml培養(yǎng)液獲得13 16g濕菌，每克濕菌含4 X 101° IO15個(gè)菌體，取濕菌與菌體保藏液按1 g :40ml 配成菌劑，成品中活菌總濃度為IXlO9 lX1012cfu/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中1)種子培養(yǎng)液LB配方氯化鈉10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，調(diào)節(jié)pH值為7. 2 ；2)發(fā)酵培養(yǎng)液配方麥芽糖2.5g/L，玉米粉5 g/L，黃豆粉5g/L，胰蛋白胨5g/L， 二水氯化鈣0. 5 g/L，一水硫酸錳0. 5 g/L,磷酸氫二鉀lg/L，調(diào)節(jié)pH值為7. 0 ；3)菌體保藏液為0.Olmol/L磷酸鹽緩沖液，還含有濃度為0. 001mol/L的Tween20非離子型表面活性劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防治西瓜細(xì)菌性果斑病的生防菌株JC65，屬于農(nóng)作物防病治病技術(shù)領(lǐng)域。該菌是芽孢桿菌(Bacillussp.)，將該菌在LB培養(yǎng)液30℃180rpm振蕩培養(yǎng)20～24小時(shí)，然后6000rpm離心10min，取濕菌與本實(shí)驗(yàn)室的菌體保藏液按1∶40(g/ml)配成菌劑，成品中活菌總濃度為1×109～1×1012cfu/ml。稀釋至1×108cfu/ml濃度時(shí)使用，對(duì)西瓜細(xì)菌性果斑病的防效為50～90%，病田增產(chǎn)效果為10～200%。對(duì)無(wú)病植株的促生效果可達(dá)10－200%，對(duì)無(wú)病田的增產(chǎn)效果為5－20%。該菌劑可以兌水噴霧使用，或做成堆肥使用，也可稀釋后在移栽時(shí)灌根使用。
文檔編號(hào)A01P1/00GK102174431SQ20111000493
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月12日
發(fā)明者蔣春號(hào), 郭堅(jiān)華, 陳云 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)