專利名稱：一種用乙醇分級沉淀純化dna的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種DNA純化的方法，特別涉及一種用乙醇分級沉淀純化DNA的方法。 背景技術：
單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)是指染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性。通常認為SNP只有兩種類型，即等位基因，在對已知SNP位點檢測分型時只需對SNP進行兩種不同類型堿基的確認分析。SNP廣泛存在于低等和高等生物中，在人類基因組中約有300多萬個。SNP具有數(shù)量多、分布廣和穩(wěn)定遺傳等特點，它與許多疾病直接相關，如血友病和苯酮尿病等，是決定人類疾病易感性和藥物反應差異的主要因素。因此，對SNP的分型在臨床檢驗和診斷、新藥研究、個性化用藥等領域顯得極其重要。越來越多的SNP分型方法被快速發(fā)展起來，如引物延伸法、寡核苷酸連接反應法、內(nèi)切酶酶切法、等位基因特異性雜交法等，其中，基于PCR擴增的引物延伸法因其簡單、高效、經(jīng)濟等特點，被使用的最為廣泛。引物延伸法中一個共同特性是通常需要用PCR 方法首先擴增得到含目的SNP位點的擴增產(chǎn)物，對其進行純化后，將其作為模板DNA再用于后續(xù)的等位基因分型。一般來講，引物延伸法對模板DNA的純度要求較高，因此，在用引物延伸法進行SNP分型中，發(fā)展一種有效、經(jīng)濟、簡單的純化PCR產(chǎn)物的方法顯得尤為重要。 被稱為OLE (One-label Extension，單標記延伸)的方法(薛紅、王子暉.單核苷酸多態(tài)性及點突變的檢測方法.中國發(fā)明專利，專利申請?zhí)?00410(^9526. 9，申請日2004.3. 18) 就是一種引物延伸法，該方法是根據(jù)下列事實緊鄰在任何一個SNP位置之5’端的核苷是已知的，且緊接于該位置之3’端的相鄰序列也是已知的；一個互補于緊鄰在靶多核苷酸內(nèi)SNP3’側之序列的引物被用于鏈延伸；聚合酶反應混合物包含有一個鏈終止核苷酸，該鏈終止核苷酸所具有的堿基互補于緊鄰該靶多核苷酸之SNP5’側的核苷酸；可加入一個額外的dNTP以產(chǎn)生一個最多有兩個堿基延伸的引物；對引物的鏈延伸長度或者從終止核苷酸標記了的形式滲入的標記量，以所形成的延長/終止反應產(chǎn)物來區(qū)分。該方法被成功發(fā)展建立并用于SNP的分型以研究SNP與精神分裂癥的相關性(Zhiliang Yu, Jianhuan Chen, Haifeng Shi, Gerald Stoeber, Shui-Ying Tsang, Hong Xue(2006). Analysis of GABRB2 association with schizophrenia in German population with DNA sequencing and one-label extension method for SNP genotyping. Clinical Biochemistry 39 (3) 210-218.)，分型檢測成功率為100%，顯示了良好的應用前景。但是，一個較大的限制因素是該方法對含目的SNP位點的PCR擴增后獲得的模板DNA的純度要求較高，由此需要用 DNA純化柱對PCR擴增產(chǎn)物進行純化，從而導致每個分型成本達到了 10元左右(主要是DNA 純化柱的成本)，大大高于其他一些分型方法的價格(1元左右的成本)，這極大的限制了該方法的產(chǎn)業(yè)化應用。模板DNA純化成本過高也是其他一些引物延伸法中的一個共性問題， 所以，發(fā)展建立一種經(jīng)濟、廉價及簡單的純化PCR擴增產(chǎn)物的方法，顯得極為重要。PCR擴增產(chǎn)物中，除了所需要的目的產(chǎn)物DNA片段外，主要的雜質是焦磷酸 (PPi)、多余的引物、多余的核苷酸(dNTPs)和DNA聚合酶，所以對PCR擴增產(chǎn)物純化的實質就是如何去除這些會干擾后續(xù)SNP分型反應的主要雜質。目前，市場上常見的PCR擴增的 DNA產(chǎn)物的純化方法主要有①一步乙醇沉淀法該方法主要是在PCR反應混合物中加入終體積濃度為75%左右的乙醇來沉淀目的DNA片段。該方法的優(yōu)點是廉價及簡單；缺點是 由于DNA聚合酶、多余的引物等雜質也會被同時沉淀下來，所以，純化后獲得的DNA純度不高。②DNA純化柱法該方法主要是在管子中填加一些吸附介質，將大片段PCR擴增的DNA 產(chǎn)物吸附，各類雜質不能被吸附而除去，然后用洗脫液將目的DNA再洗脫下來。該方法的優(yōu)點是方便且純化后獲得的DNA的純度極高；缺點是昂貴。③酶切法該方法主要是用核酸外切酶(exonuclease I)將PCR反應混合物中多余的引物降解成核苷酸，再用蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase)將所有的核苷酸降解除去。該方法的優(yōu)點雙酶的聯(lián)用可以有效去除引物和核苷酸，而且也較簡單；缺點不但昂貴，而且不能有效去除DNA聚合酶和焦磷酸，導致純化的DNA仍含有雜質聚合酶和焦磷酸。④膜過濾法該方法主要是在管子中加裝一張具有一定孔徑的高聚合物薄膜，依據(jù)分子篩的原理，能有效地讓焦磷酸、多余的核苷酸和多余的引物等通過薄膜被除去，而目的DNA片段和DNA聚合酶會被截留在膜上面。該方法的優(yōu)點方便而且能有效去除小分子量的雜質；缺點昂貴而且不能去除DNA 聚合酶，從而導致純化后的DNA仍含有雜質聚合酶。有鑒于以上不同方法的優(yōu)缺點，本發(fā)明提供一種用乙醇分級沉淀的方法來純化 PCR擴增的DNA產(chǎn)物，該方法能有效去除焦磷酸(PPi)、多余的引物、多余的核苷酸(dNTPs) 和DNA聚合酶等雜質，所純化的含SNP位點的DNA能作為模板被應用于基于OLE的SNP分型檢測中。該純化方法不但具有經(jīng)濟、廉價、方便、廣泛適用性等優(yōu)點，而且所純化的DNA具有較高的純度，所以其能作為普適性的方法被推廣應用于DNA純化制備。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種乙醇分級沉淀純化PCR擴增產(chǎn)物的方法，以及所述純化方法適用于基于OLE方法的SNP分型檢測的應用，該純化方法具有成本低，操作簡單方便，適用性廣，所純化制備的DNA純度高，環(huán)境友好等特點。本發(fā)明采用的技術方案是一種用乙醇分級沉淀純化DNA的方法，所述方法為(1)在PCR擴增產(chǎn)物中加入無水乙醇使得到的混合液乙醇體積終濃度為35 45%，在-20°C下沉淀后，離心收集上清液 A，丟棄雜質沉淀A ；所述PCR擴增產(chǎn)物中還包含0 0. 3mM焦磷酸(PPi)、0 20. OnM寡核苷酸引物鏈、0 26. 7 μ M核苷酸(dNTPs)和0 0. IU Taq聚合酶；⑵取所述的上清液A 中加入無水乙醇使得到的上清液A乙醇混合液中乙醇的體積終濃度為60 75%，在-20°C 下再沉淀后，離心，除去上清液B，收集沉淀B ； (3)取沉淀B用體積濃度為75%乙醇水溶液洗滌后，離心，除去上清液C，收集沉淀C ； (4) 50°C烘干沉淀C后，再加入TE溶液(pH = 8. 0 的10mWris-HCl，lmM EDTA)溶解，獲得純化后的DNA。所述步驟(1)在PCR擴增產(chǎn)物中加入無水乙醇使得到的混合液乙醇水溶液的體積終濃度優(yōu)選為38 42 %，最優(yōu)為40 %。所述步驟O)中上清液A加入乙醇水溶液使得到的上清液A乙醇混合液中乙醇的體積終濃度優(yōu)選為63 70 %，最優(yōu)為65 %。進一步，所述的用乙醇分級沉淀純化DNA的方法推薦按如下步驟進行(1)在PCR擴增產(chǎn)物中加入無水乙醇使得到的混合液中乙醇體積終濃度為40%，在-20°C下沉淀池后，13000rpm離心IOmin收集上清液A，丟棄雜質沉淀A ；所述PCR擴增產(chǎn)物中還包含0 0. 3mM焦磷酸、0 20. OnM寡核苷酸引物鏈、0 沈.7 μ M核苷酸和0 0. IU Taq聚合酶； (2)所收集的上清液A中加入無水乙醇使得到的上清液A乙醇混合液中乙醇的體積終濃度為65%，在-20°C下再沉淀濁后，13000rpm離心，除去上清液B，收集沉淀B ； (3)沉淀B 用體積濃度為75%乙醇水溶液洗滌后，13000rpm離心lOmin，除去上清液C，收集沉淀C ； (4) 50°C烘干沉淀C后，再加入TE溶液(pH = 8. O的IOmM Tris-HCl, ImM EDTA)溶解，獲得純化后的DNA。所述PCR擴增產(chǎn)物按如下方法制備1)PCR反應體系人基因組DNA，引物，250 μ M 的 dNTPs，50mM KCl，IOmM Tris-HCl, 1. 5mM MgCl2 禾口 IU 的 Taq 聚合酶；所述 dNTPs 由下列組分構成62. 5 μ M 的 dATP、62. 5 μ M 的 dTTP、62. 5 μ M 的 dCTP 和 62. 5 μ M 的 dGTP ；2)PCR 擴增程序為94°C變性5min，然后是35個循環(huán)，每個循環(huán)為94°C變性lmin，55°C退火50s， 72°C延伸lmin，循環(huán)結束后，72°C再延伸lOmin，獲得PCR擴增產(chǎn)物，4°C保存；所述PCR擴增產(chǎn)物中還包含O 0. 3mM焦磷酸、O 20. OnM寡核苷酸引物鏈、O 沈.7 μ M核苷酸和 O 0. IU Taq聚合酶，擴增結束后，用濃度為1. O%瓊脂糖凝膠電泳確證PCR目的產(chǎn)物大小，備用。本發(fā)明所用的人基因組DNA濃度為lOng，所述的引物為終濃度IOOnM的上游引物 F2(5，GGGAATGGTGCTCAGTAAAC3，)和 IOOnM 的下游引物 R2(5，GCACTGAAAGTCCAAGGTCC3，)。本發(fā)明所述PCR擴增產(chǎn)物為185 2085bp。進一步，所述PCR擴增產(chǎn)物包含SNP位點。更進一步，所述PCR擴增產(chǎn)物大小72:3bps，包含1個SNP位點，所述SNP位點為 5’ _(G/G)T_3，SNP位點的具體位置對本發(fā)明沒有影響，本發(fā)明的本質是一種純化DNA的方法，SNP分型只是用來評價純化方法。本發(fā)明所述含目的SNP位點的PCR擴增產(chǎn)物純化后的DNA作為模板用于單標記延伸(OLE)反應。目的產(chǎn)物的特性描述片段大小72:3bps，含有1個編號為rsl816072的SNP位點， 該SNP位點是個A/G的變化(即有的人可能是一樣的等位型AA或GG，有些人可能是不一樣的等位型AG)，本發(fā)明所選用的樣本是一個GG的等位型，緊鄰SNP(rsl816072)位點是個堿基T，所以本樣本rsl816072處是5’ - (G/G) T-3’。選用常用的4種不同的純化方法對含目的SNP位點的PCR擴增產(chǎn)物進行純化。所選用的方法和步驟如下①一步乙醇沉淀法在25 μ 1 PCR擴增產(chǎn)物中加入75 μ 1的無水乙醇至乙醇終體積濃度為75%左右，在-20°C下沉淀池后，13000rpm離心lOmin，除去上清， 沉淀中加入100 μ 1的體積濃度75%乙醇水溶液洗滌后，13000rpm離心lOmin，除去上清， 50°C烘干沉淀后，加入25 μ L的TE (Tris-EDTA)溶液溶解DNA備用。②DNA純化柱法按產(chǎn)品說明將25 μ 1 PCR擴增產(chǎn)物中加入到DNA純化柱(VI0GENE，Taiwan)中，放置5min后， 8000rpm離心lmin，除去濾過液，加入100 μ 1的洗滌液，放置Imin后，8000rpm離心lmin，除去濾過液，再13000rpm離心Imin除去余液，加入25 μ L的洗脫液，放置5min后，13000rpm 離心lmin，收集純化后DNA樣品。③酶切法25 μ 1 PCR擴增產(chǎn)物中加入1 μ 1的10Χ蝦堿性磷酸酶反應緩沖液、IU的蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase, SAP) (Roche Molecular Biochemicals，USA)和 2U 的核酸外切酶(E. coli exonuclease I,Exo I) (USB,Cleveland, USA)，在37°C下消化Ih后，95°C下高溫處理1. 5h使酶失活，獲得純化后DNA。 ④膜過濾法按產(chǎn)品說明將25 μ 1 PCR擴增產(chǎn)物中加入到過濾膜(Millipore，USA)上，放置5min后，8000rpm離心lmin，除去濾過液，加入100 μ 1的洗滌液，放置Imin后，8000rpm 離心lmin，除去濾過液，加入25 μ L的洗脫液即TE溶液(pH = 8. 0的IOmM Tris-HCl，ImM EDTA)，室溫放置30min后，收集洗脫液，即為純化后DNA樣品。用OLE反應檢測以上純化后DNA的質量，以評價不同的純化方法。進一步，對每種純化后DNA模板均建立如下的2個OLE反應①反應1即dTTP反應配置20 μ 1的反應體系，內(nèi)含2μ 1以上不同方法純化后DNA模板(含約120ng的DNA)， IOOnM OLE 引物 B2TCAF(5，-CTCATTCCAATGGCAACTCTA_3，)(Invitrogen, Carlsbad, USA)(完全互補于緊鄰在SNP rsl816072位置之3，端的序列)，15nM的Rl 10-ddATP (PerkinElmer, Boston, USA),4y 1 5X0LE溶液(內(nèi)含反應緩沖液和高保真的DNA聚合酶I^pohq) (PharmacoGenetics Ltd.，Hong Kong)，50 μ M 的 dTTP ；②反應 2 即 dCTP 反應，與反應 1 即 dTTP反應一樣，除了反應1中50 μ M的dTTP用50 μ M的dCTP替代。OLE反應程序為94°C 變性5min，然后是30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C變性30s，55 °C退火40s，循環(huán)結束后，用 Victor-V型光譜儀(PerkinElmer，Boston，USA)測定反應1和反應2的熒光偏振值(激發(fā)波長480nm ；發(fā)射波長535nm)的變化情況。Rl 10-ddATP(用熒光染料RllO標記的ddATP) 帶有熒光染料Rl 10，當其沒有被聚合酶整合到DNA鏈上時(游離態(tài))，熒光偏振值較低，而當其被聚合酶整合到DNA鏈上時(結合態(tài))，熒光偏振值會升高，RllO-ddATP為雙脫氧的核苷酸(終止型核苷酸)，一旦被整合到核苷酸鏈上，核苷酸鏈將不能繼續(xù)被延伸。由于本發(fā)明所選用的樣本在SNP位點處是5’ _(G/G)T_3’，所以，如圖1所示，理論上講，對于反應 1即dTTP反應，不會有OLE引物B2TCAF的延伸，RllO-ddATP為游離態(tài)，熒光偏振值會比較低，而對于反應2即dCTP反應，會有OLE引物B2TCAF的兩個堿基的延伸，RllO-ddATP為結合態(tài)，熒光偏振值會比較高。對4種不同的純化方法所獲得的DNA模板，分別進行兩個OLE 反應，檢測熒光偏振值。如圖2所示，純化柱法純化效果較好，所得的DNA模板經(jīng)OLE反應后，顯示dCTP反應和dTTP反應的熒光偏振值的差異最明顯，區(qū)分度最大；其次是酶切法； 再接下去是膜過濾法；而一步乙醇沉淀法效果最差，其純化獲得的DNA模板，經(jīng)OLE反應顯示，dTTP反應和dCTP反應的熒光偏振值都是高的，由此體現(xiàn)出樣品SNP分型是AG型，與實際不符(經(jīng)DNA測序證實本樣品實際的SNP分型是GG型)。綜上可見，以上所測試的純化方法種，純化柱法效果最好，最能適宜于SNP分型，但是，純化柱比較昂貴。為建立乙醇分級沉淀DNA來純化PCR擴增產(chǎn)物用于SNP分型的方法，采取以下策略25 μ 1的PCR擴增產(chǎn)物中加入低濃度的乙醇，在-20 °C下沉淀池后，13000rpm離心lOmin，收集上清(丟棄雜質沉淀)，并加入高濃度的乙醇后，在_20°C下再沉淀池后， 13000rpm離心lOmin，除去上清，DNA沉淀中加入100 μ 1的體積濃度75%乙醇溶液洗滌后， 13000rpm離心lOmin，除去上清，50°C烘干沉淀后，加入25 μ L的TE溶液溶解DNA備用。然后對每種純化后DNA模板均建立如上所述的2個OLE反應(dTTP反應和dCTP反應)以評估純化效果。結果如圖3所示先采用終體積濃度為40%的乙醇沉淀去除雜質，再用終體積濃度為65%的乙醇沉淀DNA效果最好，純化所得的DNA模板經(jīng)OLE反應后，顯示dCTP反應和 dTTP反應的熒光偏振值的差異最明顯，區(qū)分度最大，其結果可與純化柱法的結果相媲美，而成本卻比純化柱法遠遠要低；先采用終體積濃度為35%的乙醇沉淀去除雜質，再用終體積濃度為65%的乙醇沉淀DNA的效果次之；其他的分級沉淀純化方法效果都不好。綜上可見， 從OLE分型檢測的效果來看，采用先40%乙醇沉淀去雜再用65%的乙醇沉淀DNA的方法完全可以取代昂貴的純化柱法。為考察乙醇分級沉淀法去除核苷酸(dNIPs)的效果，建立以下反應體系用以上闡述的常規(guī)PCR條件，PCR擴增含目的SNP位點的F2-R2片段，PCR產(chǎn)物先用純化柱法進行純化(根據(jù)以上的試驗結果可知，純化后的DNA片段質量較好)，然后，配置4種DNA模板①純化后的DNA中不額外加入dNIPs ；②純化后的DNA中額外加入終濃度為0. 267 μ M 的dNIPs ；③純化后的DNA中額外加入終濃度為2. 67 μ M的dNIPs ；④純化后的DNA中額外加入終濃度為26. 7 μ M的dNIPs。對以上4種DNA模板分別進行2個OLE反應(dTTP反應和dCTP反應)，評估dNIPs雜質對OLE反應的影響。如圖4中的A所示，不額外加入雜質 dNTPs的模板，dCTP反應和dTTP反應的熒光偏振值的差異較明顯，區(qū)分度較大，SNP分型較好；少量dNIPs雜質(0. 267 μ Μ)對SNP分型影響不大；而當雜質dNIPs增加到2. 67 μ M時， dCTP反應和dTTP反應的熒光偏振值的差異明顯縮小，區(qū)分度不明顯，SNP分型不理想；當雜質dNIPs濃度進一步增加到26. 7 μ M，對SNP分型的影響加劇。綜上可見，DNA模板中的高濃度雜質dNIPs會干擾OLE反應中的dTTP和dCTP的特異性識別區(qū)分SNP位點的堿基，從而影響SNP分型。進一步，按以上方法制備含雜質dNIPs濃度為沈.7 μ M的DNA模板，然后分別用不同的方法純化此DNA模板①不進一步純化(對照)；②純化柱法進行純化(另一對照)； ③酶切法純化；④乙醇分級沉淀法即先40 %乙醇沉淀去雜再用65 %的乙醇沉淀DNA的方法純化。然后，對以上4種DNA模板分別進行2個OLE反應(dTTP反應和dCTP反應)，評估不同純化方法去除雜質dNIPs的效果。結果如圖4中的B所示，不進一步純化的DNA模板， dCTP反應和dTTP反應的熒光偏振值的差異很小，區(qū)分不明顯，SNP分型不好；而經(jīng)所選的3 種不同純化方法的純化，SNP分型均比較理想。綜上可見，①純化柱法、酶切法和乙醇分級沉淀法均能較好的去除dNIPs ；②3種方法的純化效果差不多；③乙醇分級沉淀法完全可以替代昂貴的純化柱法和酶切法來去除dNIPs。為考察乙醇分級沉淀法去除焦磷酸(PPi)的效果，建立以下反應體系用以上闡述的常規(guī)PCR條件，PCR擴增含目的SNP位點的F2-R2片段，PCR產(chǎn)物先用純化柱法進行純化(根據(jù)以上的試驗結果可知，純化后的DNA片段質量較好)，然后，配置4種DNA模板① 純化后的DNA中不額外加入PPi ；②純化后的DNA中額外加入終濃度為0. 003mM的PPi ；③ 純化后的DNA中額外加入終濃度為0. 03mM的PPi ；④純化后的DNA中額外加入終濃度為 0. 3mM的PPi ；⑤純化后的DNA中額外加入終濃度為3mM的PPi。對以上5種DNA模板分別進行2個OLE反應(dTTP反應和dCTP反應)，評估PPi雜質對OLE反應的影響。如圖5A所示，不額外加入雜質PPi的模板，dCTP反應和dTTP反應的熒光偏振值的差異較明顯，區(qū)分度較大，SNP分型較好；少量PPi雜質(0. 003mM)對SNP分型基本沒有影響；進一步增加PPi 的濃度(0. 03mM)，dCTP反應和dTTP反應的熒光偏振值的差異縮小，區(qū)分度變小，對SNP分型的有影響；而當雜質PPi增加到0. 3mM或進一步增加到3mM時，dCTP反應和dTTP反應的熒光偏振值均很低(高濃度PPi會抑制OLE反應中的引物延伸)，導致不能SNP分型。綜上可見，DNA模板中的高濃度雜質PPi會抑制OLE反應中的OLE引物鏈延伸的正向反應，從而影響SNP分型。
進一步，按以上方法制備含雜質PPi濃度為0. 3mM的DNA模板，然后分別用不同的方法純化此DNA模板①不進一步純化(對照)；②純化柱法進行純化(另一對照)；③酶切法純化；④乙醇分級沉淀法即先40%乙醇沉淀去雜再用65%的乙醇沉淀DNA的方法純化。 然后，對以上4種DNA模板分別進行2個OLE反應(dTTP反應和dCTP反應)，評估不同純化方法去除雜質PPi的效果。結果如圖5中的B所示，不進一步純化的DNA模板，dCTP反應和dTTP反應的熒光偏振值均很低，不能SNP分型；而酶切法也不能去除雜質PPi，dCTP反應和dTTP反應的熒光偏振值也均很低，也不能SNP分型；而純化柱法和乙醇分級沉淀法均能較好的去除雜質PPi，SNP分型均比較理想。綜上可見，①純化柱法和乙醇分級沉淀法均能較好的去除PPi ；②2種方法的純化效果差不多；③乙醇分級沉淀法完全可以替代昂貴的純化柱法去除PPi。為考察乙醇分級沉淀法去除Taq DNA聚合酶(Taq)的效果，建立以下反應體系 用以上闡述的常規(guī)PCR條件，PCR擴增含目的SNP位點的F2-R2片段，PCR產(chǎn)物先用純化柱法進行純化(根據(jù)以上的試驗結果可知，純化后的DNA片段質量較好)，然后，配置4種DNA 模板①純化后的DNA中不額外加入Taq ；②純化后的DNA中額外加入終濃度為0. 0001U的 Taq ；③純化后的DNA中額外加入終濃度為0. OOlU的Taq ；④純化后的DNA中額外加入終濃度為0. OlU的I1aq ；⑤純化后的DNA中額外加入終濃度為0. IU的hq。對以上5種DNA模板分別進行2個OLE反應(dTTP反應和dCTP反應)，評估Taq雜質對OLE反應的影響。如圖 6A所示，不額外加入雜質Taq的模板，dCTP反應和dTTP反應的熒光偏振值的差異較明顯， 區(qū)分度較大，SNP分型較好；少量Taq雜質(0. 0001U和0. 001U)對SNP分型基本沒有影響； 進一步增加Taq的濃度至0. 01U, dCTP反應和dTTP反應的熒光偏振值的差異有所縮小，區(qū)分度變小，對SNP分型的有點影響；而當雜質Taq增加到0. IU，dCTP反應和dTTP反應的熒光偏振值差異進一步縮小，對SNP分型影響加劇。綜上可見，由于普通PCR所用的常規(guī)Taq 聚合酶不是嚴格保真的聚合酶，DNA模板中高濃度雜質Taq的存在會導致OLE反應中的非特異性擴增，從而引起dTTP反應(理論上的陰性反應)的熒光偏振值錯誤的增加，影響SNP 分型。進一步，按以上方法制備含雜質Taq濃度為0. IU的DNA模板，然后分別用不同的方法純化此DNA模板①不進一步純化(對照)；②純化柱法進行純化(另一對照)；③酶切法純化；④乙醇分級沉淀法即先40%乙醇沉淀去雜再用65%的乙醇沉淀DNA的方法純化。 然后，對以上4種DNA模板分別進行2個OLE反應(dTTP反應和dCTP反應)，評估不同純化方法去除雜質Taq的效果。結果如圖6中的B所示，不進一步純化的DNA模板，dCTP反應和dTTP反應的熒光偏振值差異很小，不能SNP分型；而酶切法不能去除雜質Taq，dCTP反應和dTTP反應的熒光偏振值差異也很小，也不能SNP分型；而純化柱法和乙醇分級沉淀法均能較好的去除雜質Taq，SNP分型均比較理想。綜上可見，①純化柱法和乙醇分級沉淀法均能較好的去除Taq ；②2種方法的純化效果差不多；③乙醇分級沉淀法完全可以替代昂貴的純化柱法去除Taq。為考察乙醇分級沉淀法去除PCR引物的效果，建立以下反應體系用以上闡述的常規(guī)PCR條件，PCR擴增含目的SNP位點的F2-R2片段，PCR產(chǎn)物先用純化柱法進行純化(根據(jù)以上的試驗結果可知，純化后的DNA片段質量較好)，然后，配置4種DNA模板①純化后的DNA中不額外加入PCR引物；②純化后的DNA中額外加入終濃度為0. 200nM的PCR引物(0. IOOnM的上游引物F2和0. IOOnM的下游引物R2)；③純化后的DNA中額外加入終濃度為 2. OOnM的PCR引物(1. OOnM的上游引物F2和1. OOnM的下游引物R2)；④純化后的DNA中額外加入終濃度為20. OnM的PCR引物(10. OnM的上游引物F2和10. OnM的下游引物R2)。 對以上4種DNA模板分別進行2個OLE反應(dTTP反應和dCTP反應)，評估PCR引物雜質對OLE反應的影響。如圖7中的A所示，不額外加入雜質PCR引物的模板，dCTP反應和dTTP 反應的熒光偏振值的差異較明顯，區(qū)分度較大，SNP分型較好；少量PCR引物雜質(0. 200nM) 對SNP分型沒有影響；而當雜質PCR引物增加到2. OOnM時，dCTP反應和dTTP反應的熒光偏振值的差異有所縮小，區(qū)分度有所減小，SNP分型仍然可以；當雜質PCR引物進一步增加到20. OnM，對SNP分型的影響有所加劇。綜上可見，由于DNA模板中的高濃度的PCR引物雜質會與OLE反應中的OLE引物形成競爭而影響OLE引物與模板DNA的雜合，從而影響SNP 分型。進一步，按以上方法制備含PCR引物雜質濃度為20. OnM的DNA模板，然后分別用不同的方法純化此DNA模板①不進一步純化(對照)；②純化柱法進行純化(另一對照)； ③酶切法純化；④乙醇分級沉淀法即先40 %乙醇沉淀去雜再用65 %的乙醇沉淀DNA的方法純化。然后，對以上4種DNA模板分別進行2個OLE反應(dTTP反應和dCTP反應)，評估不同純化方法去除PCR引物雜質的效果。結果如圖7中的B所示，不進一步純化的DNA模板，dCTP反應和dTTP反應的熒光偏振值的差異最小，區(qū)分度一般，SNP分型效果一般；而經(jīng)所選的3種不同純化方法的純化，SNP分型均比較理想。綜上可見，①純化柱法、酶切法和乙醇分級沉淀法均能較好的去除PCR引物；②3種方法的純化效果差不多；③乙醇分級沉淀法完全可以替代昂貴的純化柱法和酶切法來去除PCR引物。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一種乙醇分級沉淀純化 PCR擴增產(chǎn)物的方法，該方法能有效去除PCR反應后的主要雜質焦磷酸(PPi)、多余的PCR 引物、多余的核苷酸(dNTPs)和DNA聚合酶，所述的乙醇分級沉淀方法所純化的DNA模板適用于基于OLE方法的SNP分型檢測的應用。該純化方法具有成本低，操作簡單方便，適用性廣，所純化制備的DNA純度高，環(huán)境友好等特點，在生物技術和生物工程領域的高純度DNA 制備方面具有廣闊的應用前景。


圖10LE反應的流程示意圖； 圖2基于OLE反應評價的常見純化方法純化PCR產(chǎn)物的效果；圖3基于OLE反應評價的乙醇分級沉淀法純化PCR產(chǎn)物的效果；圖4基于OLE反應評價的乙醇分級沉淀法去除dNIPs的效果，其中A為不同量的 dNTPs雜質對OLE反應的影響；圖5基于OLE反應評價的乙醇分級沉淀法去除PPi的效果，其中A為不同量的PPi 雜質對OLE反應的影響，B為乙醇分級沉淀法去除DNA模板中PPi雜質的性能；圖6基于OLE反應評價的乙醇分級沉淀法去除Taq聚合酶的效果，其中A為不同量的Taq酶雜質對OLE反應的影響，B為乙醇分級沉淀法去除DNA模板中Taq酶雜質的性能；圖7基于OLE反應評價的乙醇分級沉淀法去除PCR引物的效果，其中A為不同量的引物雜質對OLE反應的影響，B為乙醇分級沉淀法去除DNA模板中引物雜質的性能；圖8基于OLE反應評價的乙醇分級沉淀法純化不同長度的PCR產(chǎn)物的效果。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例1常規(guī)PCR擴增反應制備含目的SNP位點的DNA1)配置 25 μ 1 的常規(guī) PCR 反應體系10ng 人基因組 DNA (Hong Kong Red Cross, 香港紅十字會)，IOOnM 的上游引物 F2 (5，-GGGAATGGTGCTCAGTAAAC-3，) (Invitrogen, Carlsbad, USA)和 IOOnM 的下游引物 R2(5，-GCACTGAAAGTCCAAGGTCC-3，) (Invitrogen, Carlsbad, USA), 250 μ M 的 dNTPs (即含 62. 5 μ M 的 dATP、62. 5 μ M 的 dTTP、62. 5 μ M 的 dCTP 和 62. 5 μ M 的 dGTP)，50mM KCl，IOmM Tris-HCl, 1. 5mM MgCl2 禾口 IU 的 Taq 聚合酶。2)PCR擴增程序為94°C變性5min，然后是35個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C變性 lmin，55°C退火50s，72°C延伸lmin，循環(huán)結束后，72°C再延伸lOmin，獲得PCR擴增產(chǎn)物(含有PCR擴增目的產(chǎn)物及焦磷酸、多余的PCR引物、多余的核苷酸和Taq聚合酶等雜質)，4°C 保存。擴增結束后，用質量濃度為1.0%瓊脂糖進行凝膠電泳確證PCR目的產(chǎn)物大小后備用。3)瓊脂糖凝膠電泳確證PCR目的產(chǎn)物的特性描述片段大小723bps，包含1個編號為rsl816072的SNP位點，是個A/G的變化(即有的人可能是一樣的等位基因AA或 GG,有些人可能是不一樣的等位基因AG)，本發(fā)明所選用的樣本是一個GG的等位型，緊鄰 SNP(rsl816072)位點是個堿基T，所以本樣本rsl816072處是5’ _(G/G)T_3，(如圖1所示)°實施例2 4種不同的純化方法對含目的SNP位點的PCR擴增產(chǎn)物的純化①一步乙醇沉淀法在實施例1方法制備的25 μ 1 PCR擴增產(chǎn)物中加入75 μ 1的無水乙醇至乙醇終體積濃度為75%，在-20°C下沉淀2hr后，13000rpm離心lOmin，除去上清，沉淀中加入100 μ 1的體積濃度75%乙醇水溶液洗滌后，13000rpm離心lOmin，除去上清，50°C烘干沉淀后，加入 25 μ L 的 TE 溶液(IOmM Tris-HCl pH = 8. 0, ImM EDTA)溶解 DNA②DNA純化柱法將實施例1方法制備的25 μ 1 PCR擴增產(chǎn)物加入到DNA純化柱 (VI0GENE, Taiwan)中，放置5min后，8000rpm離心lmin，除去過濾液，加入100 μ 1的洗滌液 (VI0GENE, Taiwan)，放置 Imin 后，8000rpm 離心 lmin，除去過濾液，再 13000rpm 離心 Imin 除去余液，加入25 μ L的洗脫液(VI0GENE, Taiwan)，放置5min后，13000rpm離心lmin,收
集純化后DNA樣品。③酶切法25μ 1實施例1方法制備的PCR擴增產(chǎn)物中加入1μ 1的10Χ蝦堿性磷酸酶反應緩沖液、IU的蝦堿性磷酸酶(shrimp alkalinephosphatase, SAP) (Roche Molecular Biochemicals，USA)和 2U 的核酸外切酶(Ε· coli exonuclease I,Exo I) (USB, Cleveland, USA)，在37°C下消化Ih后，95°C下高溫處理1. 5h使酶失活后即獲得純化DNA。④膜過濾法按產(chǎn)品說明將實施例1方法制備的25 μ 1 PCR擴增產(chǎn)物加入到過濾膜(Millipore, USA)上，放置5min后，8000rpm離心lmin，除去過濾液，加入100 μ 1的洗滌液(Millipore, USA)，放置Imin后，8000rpm離心Imin,除去過濾液，加入25 μ L的洗脫液即TE溶液(pH = 8. 0的IOmM Tris-HCl, ImM EDTA)，室溫放置30min后，收集洗脫液，即為
純化后DNA樣品。實施例3 純化DNA用于SNP分型的OLE反應對每種純化方法制備的DNA模板均建立如下的2個OLE反應①反應1即dTTP反應配置20 μ 1的反應體系，內(nèi)含2μ 1純化制備的DNA 模板(含約 120ng 的 DNA)，IOOnM OLE 引物 B2TCAF(5，-CTCATTCCAATGGCAACTCTA-3，) (Invitrogen, Carlsbad, USA)(完全互補于緊鄰在SNP rsl816072位置之3，端的序列)，15nM 的 Rl 10-ddATP(PerkinElmer，Boston, USA),4 μ 1 5XOLE 溶液(內(nèi)含反應緩沖液禾口高保真的 DNA 聚合醇 TopoTaq) (PharmacoGenetics Ltd. , Hong Kong)，50 μ M 的 dTTP (Invitrogen, Carlsbad, USA)；②反應2即dCTP反應，與反應1即dTTP反應一樣，除了反應1中50 μ M的dTTP 用 50 μ M 的 dCTP (Invitrogen, Carlsbad, USA)替代。OLE反應程序為94°C變性5min，然后是30個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C變性30s， 55°C退火40s，循環(huán)結束后，用Victor-V型光譜儀(PerkinElmer，Boston, USA)測定反應1 和反應2的熒光偏振值(激發(fā)光波長480nm ；發(fā)射光波長535nm)的變化情況。實施例4乙醇分級沉淀法對含目的SNP位點的PCR擴增產(chǎn)物的純化程序取實施例1方法制備的25 μ 1的PCR擴增產(chǎn)物分成6組，每組分別加入無水乙醇使乙醇終體積濃度為0、0、25%、35%、40%、50% (如圖3所示)，分別在_20°C下沉淀濁后， 13000rpm離心lOmin，收集上清(丟棄雜質沉淀)，并分別加入無水乙醇使乙醇終體積濃度分別為75%、65%、65%、65%、65%、65% (如圖3所示)后，分別在_20°C下再沉淀2h后， 13000rpm離心lOmin，除去上清，DNA沉淀中加入100 μ 1的質量濃度75%乙醇水溶液洗滌后，13000rpm離心lOmin，除去上清，50°C烘干沉淀后，加入25 μ L的TE溶液(pH = 8. 0的 IOmM Tris-HCiamM EDTA)溶解DNA，獲得6組純化后的DNA，分別按照實施例3所述的方法進行OLE反應，熒光偏振值見圖3所示。實施例5 DNA模板中不同的雜質對基于OLE反應的SNP分型的影響用于OLE反應的DNA模板的制備按實施例1的方法進行PCR擴增，再按實施例2 中純化柱法進行純化，純化后的DNA模板分成18組(組1 組18)，組1 組4分別加入不同濃度的dNTPs (0,0. 267 μ Μ、2. 67 μ M和26. 7 μ Μ)、組5 組9分別加入不同濃度的PPi (0、 0. 003mM、0. 03mM、0. 3mM和3mM)、組10 組14分別加入不同量的Taq聚合酶(0、0. 0001U、 0. 001U、0. OlU和0. 1U)和組15 組18分別加入不同濃度的PCR引物(0,0. 200nM(0. IOOnM 的 F2 和 0. IOOnM 的 R2)、2. OOnM (1. OOnM 的 F2 和 1. OOnM 的 R2)和 20. OnM (10. OnM 的 F2 和 10. OnM 的 R2))。上述18組模板，按實施例3的方法分別進行OLE反應，觀察SNP分型情況以評估不同量的雜質對OLE反應的影響。結果如圖4中A、圖5中A、圖6中A和圖7中A所示，低濃度的雜質，如 0. 267μΜ 的 dNTPs、0. 003mM 的 PPi、0. 0001U 和 0. 001U 的 Taq 或 0. 200nM 的PCR引物，對OLE反應沒有影響，SNP分型比較清晰準確；當雜質濃度增加，如2. 67 μ M的 dNTPs,0. 03mM 的 PPi、0. OlU 的 Taq、或 2. OOnM 和 2. OOnM 的 PCR 引物，對 OLE 反應產(chǎn)生影響，從而導致SNP分型區(qū)分度下降；而當雜質濃度進一步增加，如沈.7 μ M的dNTPs、0. 3mM和3mM的PPi或0. IU的hq，對OLE反應產(chǎn)生非常明顯的影響，甚至會產(chǎn)生錯誤的SNP分型 (與理論不符)。實施例6乙醇分級沉淀法去除DNA模板中雜質的性能按實施例1的方法進行PCR擴增，再按實施例2中純化柱法進行純化，純化后的 DNA模板分成4組(組a 組d)，組a中加入終濃度為沈.7 μ M的dNTPs、組b中加入終濃度為0. 3mM的PPiJi c中加入終濃度為0. IU的Taq聚合酶、組d中加入終濃度為20. OnM 的PCR引物(10. OnM的上游引物F2和10. OnM的下游引物R2)，對以上制備的4組含雜質的DNA分別進行乙醇分級沉淀法進行純化，即25 μ 1上述DNA溶液(組a 組d)中分別加入乙醇，使混合液匯總乙醇體積終濃度為40%，分別在-20°C下沉淀池后，13000rpm離心 IOmin,收集上清(丟棄雜質沉淀)，并加入乙醇使混合液中乙醇體積終濃度為65%，再分別在-20°C下再沉淀2h后，13000rpm離心lOmin，除去上清，DNA沉淀中分別加入100 μ 1的體積濃度75%乙醇水溶液洗滌后，13000rpm離心lOmin，除去上清，50°C烘干沉淀后，加入 25 μ L 的 TE 溶液(pH = 8. 0 的 IOmM Tris-HCl, ImM EDTA)溶解 DNA，獲得 4 組純化后的 DNA 模板(組a 組d)，備用。將上述純化后的DNA模板(組a 組d)按實施例3的方法分別進行OLE反應，同樣條件下按照實施例2中的方法②和③及不純化的模板作為對照，觀察SNP分型情況以評估乙醇分級沉淀法去除DNA模板中雜質的性能。結果如圖4中B、圖5中B、圖6中B和圖 7中B所示，含有雜質的DNA模板若不進行純化，OLE反應后的SNP分型不好，甚至會產(chǎn)生錯誤的分型結果；含雜質的DNA模板經(jīng)乙醇分級沉淀法純化后，OLE反應后的SNP分型比較清晰、理想，均與事實相符，而且，乙醇分級沉淀法純化的DNA模板的分型效果與商業(yè)化的純化柱法純化的相當。實施例7乙醇分級沉淀法純化不同長度DNA模板的效果分別采用不同的配對引物，按實施例1的方法PCR擴增不同長度的目的DNA 上游引物 F2D(5，-TCAGGATGCGTTATTGGATAGT-3，) (Invitrogen, Carlsbad, USA)和下游引物R2配對用于擴增185bps的目的DNA，上游引物F2C(5，-ACCAAGGTTTTATGGGCGTGC T-3，) (Invitrogen, Carlsbad, USA)和下游引物R2配對用于擴增359bps的目的DNA, 上游引物 F2B(5，-TACGTATGATACAGGATCATCC-3，) (Invitrogen, Carlsbad, USA)和下游引物R2配對用于擴增4^bps的目的DNA，上游引物F2和下游引物R2配對用于擴增 723bps 的目的 DNA，上游引物 F2 和下游引物 R2N(5，-CCTAATGGGGGAGTTTGAAC-3，) (Invitrogen, Carlsbad, USA)配對用于擴增1078bps的目的DNA，上游引物F2D和下游引物 R4N(5，-CTTAATAGCTGGAAAGGTGAT-3，)(Invitrogen, Carlsbad,USA)配對用于擴增 1534bps 的目的DNA，上游引物F2和下游引物R4N配對用于擴增208^ps的目的DNA，所擴增的目的 DNA均含有同一 SNP位點rsl816072。對上述含有不同長度目的DNA片段的PCR擴增產(chǎn)物按實施例6中的乙醇分級沉淀方法進行純化，然后，對純化后不同長度的DNA模板按實施例3的方法進行OLE反應，評估乙醇分級沉淀方法純化不同長度DNA的效果。結果如圖8所示，不同長度的DNA模板，經(jīng) OLE反應，顯現(xiàn)出一致的SNP分型結果，每種模板的2個OLE反應間的區(qū)分度基本一致，可見，先40%的乙醇沉淀去雜再65%的乙醇沉淀DNA的分級沉淀方法適用于純化不同長度的 PCR擴增產(chǎn)物，所純化的DNA能被較好地用于基于OLE反應的SNP分型。
1權利要求
1.一種用乙醇分級沉淀純化DNA的方法，其特征在于所述方法為(1)在PCR擴增產(chǎn)物中加入無水乙醇使得到的混合液乙醇體積終濃度為35 45%，在-20°C下沉淀后，離心收集上清液A，丟棄雜質沉淀A ；所述PCR擴增產(chǎn)物中還包含0 0. 3mM焦磷酸、0 20. OnM 寡核苷酸引物鏈、0 沈.7 μ M核苷酸和0 0. IU Taq聚合酶；( 取所述的上清液A加入無水乙醇使得到的上清液A乙醇混合液中乙醇的體積終濃度為60 75%，在-20°C下再沉淀后，離心，除去上清液B，收集沉淀B ;C3)取沉淀B用體積濃度為75%乙醇水溶液洗滌后， 離心，除去上清液C，收集沉淀C ； (4) 50°C烘干沉淀C后，再加入TE溶液溶解，獲得純化后的 DNA。
2.如權利要求1所述的用乙醇分級沉淀純化DNA的方法，其特征在于所述步驟(1)中加入無水乙醇使得到的混合液乙醇體積終濃度為38 42%。
3.如權利要求1所述的用乙醇分級沉淀純化DNA的方法，其特征在于所述步驟O)中上清液A加入無水乙醇使得到的上清液A乙醇混合液中乙醇的體積終濃度為63 70%。
4.如權利要求1所述的用乙醇分級沉淀純化DNA的方法，其特征在于所述方法按如下步驟進行(1)在PCR擴增產(chǎn)物中加入無水乙醇使得到的混合液中乙醇體積終濃度為40%， 在-20°C下沉淀池后，13000rpm離心IOmin收集上清液A，丟棄雜質沉淀A ；所述PCR擴增產(chǎn)物還包含0 0. 3mM焦磷酸、0 20. OnM寡核苷酸引物鏈、0 沈.7 μ M核苷酸和0 0. IU Taq聚合酶；( 取所述的上清液A加入無水乙醇使得到的上清液A乙醇混合液中乙醇的體積終濃度為65%，在-20°C下再沉淀池后，13000rpm離心，除去上清液B，收集沉淀 B ； (3)沉淀B用體積濃度為75%乙醇水溶液洗滌后，13000rpm離心lOmin，除去上清液C， 收集沉淀C ； (4) 50°C烘干沉淀C后，再加入TE溶液溶解，獲得純化后的DNA。
5.如權利要求1 4之一所述的用乙醇分級沉淀純化DNA的方法，其特征在于所述 PCR擴增產(chǎn)物按如下方法制備1)PCR反應體系人基因組DNA，引物，終濃度為250 μ M的 dNTPs,50mM KCl，IOmM Tris-HCl，1. 5mM MgCl2 禾口 IU 的 Taq 聚合酶；所述 dNTPs 由下列組分構成終濃度為 62. 5 μ M 的 dATP、62. 5 μ M 的 dTTP、62. 5 μ M 的 dCTP 和 62. 5 μ M 的 dGTP ； 2) PCR擴增程序為94°C變性5min，然后是35個循環(huán)，每個循環(huán)為94°C變性lmin，55°C退火 50s，72°C延伸lmin，循環(huán)結束后，72°C再延伸lOmin，獲得PCR擴增產(chǎn)物；所述PCR擴增產(chǎn)物中還包含O 0. 3mM焦磷酸、O 20. OnM寡核苷酸引物鏈、O 沈.7 μ M核苷酸和O 0. IU iTaq聚合酶。
6.如權利要求1所述的用乙醇分級沉淀純化DNA的方法，其特征在于所述PCR擴增產(chǎn)物為 185 2085bp。
7.如權利要求1所述的用乙醇分級沉淀純化DNA的方法，其特征在于所述PCR擴增產(chǎn)物包含SNP位點。
8.如權利要求7所述的用乙醇分級沉淀純化DNA的方法，其特征在于所述PCR擴增產(chǎn)物大小72:3bps，包含1個SNP位點，所述SNP位點為5，_(G/G)T_3。
9.如權利要求7所述的用乙醇分級沉淀純化DNA的方法，其特征在于所述的引物為上游引物 F2(5，GGGAATGGTGCTCAGTAAAC3，)和下游引物 R2 (5，GCACTGAAAGTCCAAGGTCC3，)。
10.如權利要求7所述的用乙醇分級沉淀純化DNA的方法，其特征在于所述人基因組 DNA終濃度為10ng，引物為終濃度IOOnM的上游引物F2 (5，GGGAATGGTGCTCAGTAAAC3，)和 IOOnM 的下游引物 R2(5，GCACTGAAAGTCCAAGGTCC3，)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用乙醇分級沉淀純化DNA的方法(1)在PCR擴增產(chǎn)物中加入無水乙醇使得到的混合液乙醇體積終濃度為35～45％，在-20℃下沉淀后，離心收集上清液A，丟棄雜質沉淀A；(2)取所述的上清液A中加入無水乙醇使得到的上清液A乙醇混合液中乙醇的體積終濃度為60～75％，在-20℃下再沉淀后，離心，除去上清液B，收集沉淀B；(3)取沉淀B用體積濃度為75％乙醇水溶液洗滌后，離心，除去上清液C，收集沉淀C；(4)50℃烘干沉淀C后，再加入TE溶液溶解，獲得純化后的DNA；本發(fā)明純化方法成本低，操作簡單方便，適用性廣，所純化制備的DNA純度高，環(huán)境友好等，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N15/10GK102559659SQ20111044653
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月28日 優(yōu)先權日2011年12月28日
發(fā)明者余志良, 張正波, 趙春田 申請人:浙江工業(yè)大學