專利名稱：用于外源蛋白可溶性表達的質粒及其制備和應用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種生物工程技術領域的質粒及其制備和應用方法，具體是一種利用產腸毒素大腸桿菌i^aeE基因提高外源蛋白在大腸桿菌中可溶性表達的質粒及其制備和應用方法。
背景技術：
大腸桿菌具有遺傳性狀了解透徹、生長快、培養(yǎng)經濟、表達水平高、待選質粒和宿主多等特點，在基因工程技術領域成為首選的表達系統(tǒng)。但是外源蛋白往往在獲得高水平表達的同時，容易被宿主蛋白酶降解或者形成包涵體。目前國內外對蛋白質體外復性研究較多，但其過程往往費時、費力，且不經濟，因此，探索外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達具有較高的學術價值和廣泛的應用前景。
提高外源基因大腸桿菌中可溶性表達可以通過共表達的輔助蛋白，例如分子伴侶 GroEL/ES 和 DnaK-Dnaj-GrpE、引發(fā)因子(Trigger factor)、硫氧還蛋白(Thioredoxin) 和折疊酶Oxidase)等以增加外源蛋白可溶性。但是應根據外源蛋白的特點有選擇性地共表達分子伴侶和折疊酶。例如在大腸桿菌中共表達熱激蛋白GroEL/ES能增加某些蛋白 (α-1，6-巖藻糖基轉移酶、浸麻芽孢桿菌環(huán)式糊精葡聚糖轉移酶、谷氨酸消旋酶、過氧化物歧化酶、酪氨酸激酶、人膠原酶原)的可溶性，卻對其他一些蛋白(人I型干擾素受體2c 亞基的胞外段、噬菌體P22結構蛋白、人酸性富含胱氨酸分泌型蛋白)無增溶效果。又如 GroEL/ES與人酪氨酸激酶Lck共表達并不能增加后者的可溶性，而硫氧還蛋白卻能顯著地促進該外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達。除此之外，溫度也可能會對共表達折疊輔助蛋白的效果產生重要的影響。例如preS2-S’ - β -半乳糖苷酶與DnaK和DnaJ分子伴侶共表達，能在30至42°C范圍內提高可溶蛋白的表達水平，而共表達GroEL和GroES分子伴侶卻只能在30°C條件下取得比較好的效果。值得一提的是，如果將幾種折疊輔助蛋白分子同時共表達，有可能獲得比單獨表達某種折疊輔助蛋白更好的效果。Jiro等將Gr0EI/ES，TrX 或DsbBD與谷氨酸消旋酶同時共表達，活性谷氨酸消旋酶的產量上升了 2. 2至2. 3倍。在某些情況下，共表達那些能增加蛋白可溶性和促進大腸桿菌生長的蛋白也能起到良好的效果。例如Kallio等在大腸桿菌中共表達透明顫菌血紅蛋白，發(fā)現(xiàn)該蛋白對活性蛋白的表達有明顯促進作用。
!^aeE是產腸毒素大腸桿菌鞭毛蛋白上的一個分子伴侶，在體內以同源二聚體的形式與鞭毛蛋白的其他亞基形成異源三聚體，從而保護這些亞基免受蛋白酶的降解，同時抑制這些亞基提前聚合，并將它們護送到跨膜蛋白。發(fā)明內容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術存在的上述不足，提供一種用于外源蛋白可溶性表達的質粒及其制備和應用方法，該方法構建了一個包含有該分子伴侶FaeE的大腸桿菌表達載體，可以促進外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達。
本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的
本發(fā)明涉及一種用于外源蛋白可溶性表達的質粒，該質粒為pET30e其DNA序列如 Seq ID No. I 所示，
所述的質粒包含有分子伴侶FaeE的編碼序列，含有BamH I，EcoR I，Sac I，SalI,Not I,Xho I限制性內切酶識別位點組成的多克隆位點，其分子伴侶FaeE的編碼序列包括有起始密碼子ATG和終止密碼子TAA，分子伴侶FaeE的編碼序列和外源基因序列之間有一個大腸桿菌核糖體結合位點，分子伴侶FaeE的編碼序列和外源基因序列共同受T7啟動子和Iac操縱子的調控，外源基因序列末端與6個His-tag基因融合；
本發(fā)明涉及上述用于外源蛋白可溶性表達的質粒的制備方法，通過將質粒模板與引物組進行PCR擴增后獲得的擴增產物與PMD18-T載體連接，經轉化大腸桿菌DH5 a后獲得大腸桿菌克隆體，將大腸桿菌克隆體作為底物進行酶切連接后將得到的產物轉化大腸桿菌DH5 a，獲得可溶性表達質粒分子。所述的大腸桿菌DH5CI購自上海英駿生物技術有限公司；所述的PMD18-T載體購自大連寶生物工程有限公司；所述的將質粒模板與引物組進行PCR擴增是指a)將F4ac型ETEC野生型菌株C83907質粒與第一引物和第二引物進行PCR擴增
或
b)將含有霍亂毒素B亞基(CTB)基因的質粒pETctb與第三引物和第四引物進行 PCR擴增；或
c)將含有過氧化物酶前體(PRX)基因的質粒pET32a-prx-24與第五引物和第六引物進行PCR擴增。
所述的F4ac型ETEC野生菌株C83907購自中國獸藥監(jiān)察所(China Institute of VeterinaryDrug Control)；
所述的第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，該序列包含一個Nde I限制性內切酶識別位點。
所述的第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，該序列包含一個BamH I限制性內切酶識別位點和一個大腸桿菌核糖體結合位點。
所述的第三引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示，該序列包含一個BamH I限制性內切酶識別位點。
所述的第四引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，該序列包含一個Xho I限制性內切酶識別位點。
所述的第五引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示，該序列包含一個BamH I限制性內切酶識別位點。
所述的第六引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示，該序列包含一個Xho I限制性內切酶識別位點。
所述的酶切連接是指
a)用限制性內切酶Nde I和BamH I酶切，獲得740bp的片段與用限制性內切酶 Nde I和BamH I酶切后的pET30a載體進行連接；或
b)用BamH I和Xho I酶切，獲得309bp的片段與采用BamH I和Xho I酶切后的 pET30e載體進行連接。
所述的pET30a質粒購自上海美季生物技術有限公司；
本發(fā)明涉及上述用于外源蛋白可溶性表達的質粒的應用方法，將獲得的可溶性表達質粒分子，用熱激法轉化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞得到重組大腸桿菌菌落，經接種培養(yǎng)得到菌體細胞后實現(xiàn)可溶性表達的提高。
所述的大腸桿菌BL21 (DE3)購自上海英駿生物技術有限公司；
所述的大腸桿菌BL21(DE!3)感受態(tài)細胞通過以下方式制備獲得從新活化的 SOB-Mg固體培養(yǎng)基平板上挑取BL21 (DE3)單菌落于50mL SOB-Mg液體培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)，至0D600 = 0. 3時，將細菌轉移到一個無菌的，冰預冷的SOmL的離心管中，冰上放置lOmin，使培養(yǎng)物冷卻到0°C。5，OOOrpm, 4°C，離心5min，盡量倒清培養(yǎng)液；加入30ml預冷的0. IMCaCl2溶液懸浮菌體；冰上放置20min ；5, OOOrpm，4°C，離心5min。小心倒去上清， 1/2原培養(yǎng)基體積的0. IM CaCl2 (加入20%的甘油)重新懸浮菌體。100 μ L/管分裝后直接用于轉化或者液氮速凍后，-70°C儲存。
所述的熱激法轉化是指取大腸桿菌BL21(DE!3)感受態(tài)細胞置于冰上融化，然后加入待轉化的質粒，混勻后冰上放置30min ；42°C，熱激90sec ；熱激后迅速置于冰上冷卻 IOmin ；加入100 μ L無抗液體LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)45min ；將200 μ 1菌液全部涂布在加有相應抗生素的固體LB培養(yǎng)基上；37°C培養(yǎng)16hr。
所述的接種培養(yǎng)是指挑取重組大腸桿菌菌落接入3_5mL含卡那霉素50mg/L的 LB培養(yǎng)液，于37°C振蕩培養(yǎng)過夜。按1 100的接種量將過夜培養(yǎng)物接入IOOmL含卡那霉素50mg/L的LB培養(yǎng)液，37°C振蕩培養(yǎng)至對數中期0D595 = 0. 5-0. 6，并以1 1000的比例加入IM IPTG，37°C振蕩培養(yǎng)3-5h0 4°C 8，OOOrpm離心IOmin收集菌體細胞。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比
利用pET30e載體系統(tǒng)可以明顯的提高外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達。在本系統(tǒng)中CTB的可溶性表達提高了 8. 85%,PRX的可溶性表達提高了 13. 18%，所表達的可溶性蛋白具有生物學活性。同時本載體系統(tǒng)可以利用BamH I.EcoR I.Sac I.Sal I,Not I、 Xho I等多克隆位點將外源基因克隆進本發(fā)明的載體pET30e中，利用載體3，端的6His-tag 實現(xiàn)外源蛋白的快速純化；表達的外源蛋白不與其他大的輔助蛋白融合，不需要進一步的處理。因此本系統(tǒng)對于幫助外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達具有促進作用，對進一步的分析這些蛋白的功能具有重要的意義。


圖1為pET30e大腸桿菌表達載體示意圖及分子伴侶!^aeE在大腸桿菌中表達的 SDS-PAGE 分析。
圖2為pET30e載體結構示意圖。
圖3為pET30eCTB載體結構示意圖。
圖4為pET30ePRX載體結構示意圖。
圖5 為 pET30CTB 和 pET30eCTB 在大腸桿菌中表達的 SDS-PAGE 和 Western blot 分析。
圖6 為 pET30PRX 和 pET30ePRX 在大腸桿菌中表達的 SDS-PAGE 和 Western blot 分析。
圖7為GMl神經節(jié)糖苷酯ELISA結合試驗分析pET30e表達系統(tǒng)中獲得可溶的CTB 的活性。
圖8為pET30e表達系統(tǒng)獲得的過氧化物酶酶活測定及相對活性分析。
具體實施方式
下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。
實施例I
pET30e大腸桿菌表達載體示意圖及分子伴侶FaeE在大腸桿菌中表達的SDS-PAGE 分析
分子伴侶FaeE編碼序列通過Nde I和Bam HI兩個限制性內切酶克隆進商業(yè)化的表達載體pET30a中，使該基因位于17啟動子和Iac操縱子的調控制下，在分子伴侶編碼序列的5’端添加了大腸桿菌核糖體結合位點，在該位點之后是可以用來進行外源蛋白基因克隆的多克隆位點，包括Bam HIjEcoR I, Sac I，Hind III，Not I，Xho I，在多克隆位點之后是6個組氨酸編碼序列。外源基因通過17終止子進行終止。載體結構如圖I和圖2。
將pET30a和獲得的pET30e大腸桿菌表達載體轉化人大腸桿菌表達菌株 BL21 (DE3)，將重組大腸桿菌 pET30a/BL21 (DE3)和 pET30e/BL21 (DE3)的單菌落在 IOOmL 含有50 ii g/mL的卡那霉素的新鮮LB液體培養(yǎng)液在37°C下進行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至0D590值為0.4時，加入IPTG至終濃度為lmmol/1進行誘導表達4hr。將誘導的和非誘導的大腸桿菌細胞在4°C下5，OOOrpm離心lOmin，收集的細胞沉淀重懸于10mL/g鮮重(FW)的PBS (pH7. 4) 中，在冰上進行超聲波處理。超聲波后的細胞裂解液在4°C下10，000印111離心101^11，收集上清液。取IOy L的上清液進行SDS-PAGE電泳，然后進行考馬氏蘭染色。結果(圖1B)顯示在大腸桿菌中表達的FaeE大小為24. 8kDa,與它的實際大小相符。
實施例2
pET30CTB 和 pET30eCTB 在大腸桿菌中表達的 SDS-PAGE 和 Western blot 分析。
將CTB編碼序列的編碼序列，通過Bam HI和Xho I酶切克隆進用相同的酶切處理的pET30e中，獲得表達載體pET30eCTB，載體結構如圖3。
所述的載體pET30eCTB質粒的DNA序列如Seq ID No. 2所示，其中包含分子伴侶 FaeE的編碼序列和霍亂毒素B亞基CTB的編碼序列,所述的霍亂毒素B亞基(CTB)編碼序列是以古典型霍亂弧菌(CVC)基因組DNA為模板擴增獲得。
將pET30CTB和pET30eCTB轉化入大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)，獲得重組大腸桿菌pET30CTB/BL21 (DE3)和pET30eCTB/BL21 (DE3)。細菌培養(yǎng)、蛋白誘導和處理的方法同實施例1，蛋白經SDS-PAGE進行分離，分離后將蛋白轉移到硝酸纖維素膜(NC)上，然后膜與第一抗體 His-tag 的兔多克隆抗體(Proteintech Group, USA) (1 2, 000ν/ν)進行反應； 然后再與堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗兔IgG(l 1，000ν/ν)進行反應；膜經過漂洗后，采用含有 nitroblue tetrazolium(NBT, Gibco)禾口 5-bromo-2-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP， Gibco)底物著色反應溶液進行著色反應；反應結束后采用滅菌重蒸水進行終止反應。 SDS-PAGE 結果(圖 5A)顯示，pET30CTB/BL21 (DE3)和 pET30eCTB/BL21 (DE3)都可以表達 11. 9kDa的CTB蛋白，而且表達的6His_CTB主要是在這兩個重組大腸桿菌表達蛋白的沉淀中存在，即，主要是以包涵體的形式存在的。而Western blot的結果(圖5B)除了證明CTB 除了在重組大腸桿菌pET30CTB/BL21 (DE3)和pET30eCTB/BL21 (DE3)中以包涵體的形式進行表達，而且還在pET30eCTB/BL21 (DE3)中以可溶的形式表達。
采用Ni-NTA親和層析柱進行His6preSl融和蛋白的Ni-NTA (Novagen,USA)純化， 方法參照供應商提供的實驗方案。并采用Bradford方法測定收集蛋白的濃度。結果表明， 通過pET30e大腸桿菌表達載體系統(tǒng)表達的可溶的6His-CTB占重組大腸桿菌pET30eCTB/ BL21 (DE3)表達的總可溶蛋白的8. 85%。而在重組大腸桿菌pET30CTB/BL21 (DE3)表達的可溶的蛋白中檢測不到CTB蛋白的存在。即，通過pET30e大腸桿菌表達系統(tǒng)可以使表達的 CTB的可溶性提高8. 85%。
實施例3
pET30PRX 和 pET30EPRX 在大腸桿菌中表達的 SDS-PAGE 和 Western blot 分析
將PRX的編碼序列，通過Bam HI和Bio I酶切克隆進用相同的酶切處理的pET30e 中，獲得表達載體pET30ePRX，載體結構如圖4。
所述的載體pET30ePRX質粒的DNA序列如kq ID No. 3所示，包含分子伴侶!^aeE 的編碼序列和水稻內源過氧化物酶的編碼序列，所述的水稻內源過氧化物酶(PRX)基因序列是以水稻基因組DNA為模板擴增獲得。
將pET30PRX和pET30EPRX轉化入大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)，獲得重組大腸桿菌pET30PRX/BL21 (DE3)和pET30ePRX/BL21 (DE!3)。細菌培養(yǎng)、蛋白誘導和處理的方法同實施例1，Western blot分析方法同實施例2。SDS-PAGE結果(圖6A)顯示，pET30PRX/ BL21 (DE3)和 pET30ePRX/BL21 (DE3)都可以表達 37. 8kDa 的 PRX 蛋白，而且表達的 6Hi s-PRX 主要是在這兩個重組大腸桿菌表達蛋白的沉淀中存在，即，主要是以包涵體的形式存在的。 而Wfestern blot的結果(圖6B)除了證明PRX除了在重組大腸桿菌pET30PRX/BL21 (DE3) 和pET30ePRX/BL21(DE;3)中以包涵體的形式進行表達，而且還在pET30ePRX/BL21 (DE3) 中以可溶的形式表達?？扇艿?His-PRX經純化后分析得，該可溶的蛋白張重組大腸桿菌pET30ePRX/BL21(DE;3)表達的總可溶蛋白的13. 18%。而在重組大腸桿菌pET30PRX/ BL21(DE3)表達的可溶的蛋白中，檢測不到PRX蛋白的存在。即，通過pET30e大腸桿菌表達系統(tǒng)可以使表達的PRX的可溶性提高13. 18%。
實施例4
GMl神經節(jié)糖苷酯ElISA結合試驗分析pET30e表達系統(tǒng)中獲得可溶的CTB的活性。
用GM1-ELISA分析CTB蛋白的生物學活性。采用以下方法用GMl (SigmaG27641) 包被96孔酶標板，同時用半乳糖(fel)、BSA、PBS作為對照，4°C過夜后，將85ng CTB蛋白包被于已結合有GMl的酶標板土 ；用His-tag兔多克隆抗體做為一抗，堿性磷酸酶偶聯(lián)的羊抗8兔IgG作為第二抗體，用NPP進行顯色，終止反應后，用酶標儀(ElxSOOUV，BioTEK)測定各孔溶液的光吸收值，激發(fā)光波長為405nm。
從圖7的結果可以看出，純化獲得的pET30e大腸桿菌表達的可溶的6His_CTB與對照Mlis蛋白比較，與GMl神經節(jié)苷脂具有很強的結合能力，而且與對照半乳糖和BSA都沒有結合能力。CTB在體內天然的受體是神經節(jié)苷脂，CTB只有形成五聚體的形式，才能和它的受體進行結合，結果表明，獲得的這種可溶的Mlis-CTB能夠形成它天然的構象，所以可以與它的受體結合。
實施例5
pET30e表達系統(tǒng)獲得的過氧化物酶酶活測定及相對活性分析。
過氧化物酶活性是用Amplex Red過氧化氫/過氧化物酶分析試劑盒 (MolecularProbes)進行分析，方法參照說明書。用 0，25，37. 5，50，62. 5，75，87. 5，and 100mU/mL的標準的HRP與Amplex Red反應混合物在30°C條件下進行反應60min的結果制定標準曲線。利用該標準曲線來計算Mlis-PRX和Mlis蛋白的相對活性。
從圖8A的結果可以看出，pET30e表達系統(tǒng)獲得的過氧化物酶可以催化H2A釋放出O2，并且6His-PRX的活性會隨著反應時間的延長提高，雖然與商品化的HRP的活性比起來還有些差異。但是根據標準曲線計算的6His-PRX的相對活性為1. 00 μ UmL-Ipmol-I，與 6His具有顯著差異(P < 0. 01)(圖8B)。
實施例6
本發(fā)明涉及上述用于提高外源基因在大腸桿菌中可溶性表達的質粒的應用方法， 將獲得的可溶性表達質粒分子，用熱激法轉化大腸桿菌BL21(DE!3)感受態(tài)細胞。挑取重組大腸桿菌菌落接入3-5mL含卡那霉素(50mg/L)的LB培養(yǎng)液，于37°C振蕩培養(yǎng)過夜。按 1 100的接種量將過夜培養(yǎng)物接入IOOmL含卡那霉素(50mg/L)的LB培養(yǎng)液，37°C振蕩培養(yǎng)至對數中期(0D595 = 0. 5-0. 6)。以1 1000的比例加入IM IPTG，37°C振蕩培養(yǎng)3_5h。 4°C 8，OOOrpm離心IOmin收集菌體細胞。進行表達蛋白的可溶性分析和純化。
所述的感受態(tài)細胞的制備方法為從新活化的SOB-Mg固體培養(yǎng)基平板上挑取 BL21 (DE3)單菌落于50mL SOB-Mg液體培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)，至0D600 = 0. 3時， 將細菌轉移到一個無菌的，冰預冷的80mL的離心管中，冰上放置lOmin，使培養(yǎng)物冷卻到 0°C。5，OOOrpm, 4°C，離心5min，盡量倒清培養(yǎng)液；加入30mL預冷的0. IM CaCl2溶液懸浮菌體；冰上放置20min ；5, OOOrpm，4°C，離心5min。小心倒去上清，1/2原培養(yǎng)基體積的0. IM CaCl2 (加入20%的甘油)重新懸浮菌體。100 μ L/管分裝后直接用于轉化或者液氮速凍后，-70°C儲存。
所述的感受態(tài)細胞的轉化方法為取感受態(tài)細胞，置于冰上融化，然后加入待轉化的質粒，混勻后冰上放置30min ；42°C，熱激90sec ；熱激后迅速置于冰上冷卻IOmin ；加入 100μ L無抗液體LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)45min ；將200 μ L菌液全部涂布在加有相應抗生素的固體LB培養(yǎng)基上；37°C培養(yǎng)16hr。
所述的蛋白純化方法按照Novagen公司The pET System manual進行。純化后的蛋白進行相關的活性分析。
所述的可溶性分析方法為用PBS (ImM KH2P04, IOmM Na2HP04,137mMNaCl， 2. 7mMKCl, pH7. 4)洗滌菌體兩次，然后將菌體用PBS重懸后進行超聲波破碎。然后在4V條件下，12, OOOrpm離心30min。將上清和沉淀分開,沉淀用等體積的PBS重懸后進行分析。 分別將上清和沉淀進行SDS-PAGE分析和Western blot分析。
所述的SDS-PAGE分析方法為特收集的蛋白樣品加入等體積的2XSDS凝膠加樣緩沖液(50mM Tis-HCl (pH6. 8)，IOOmM 二硫蘇糖醇(DTT) ,2% (m/V) SDS (電泳級)，0. I %溴酚藍，10% (V/V)甘油)，沸水煮5-10min后，12，OOOrpm離心5min，取上清進行SDS-PAGE分析。
所述的Western blot分析方法為蛋白樣品在SDS-PAGE電泳結束后將蛋白轉移到硝酸纖維素(NC)膜上。200mA，轉膜2hr，轉移結束后關掉電源，取出NC膜放入容器(培養(yǎng)皿)中，加適量的封閉緩沖液(含5% (w/v)脫脂奶粉的PBS緩沖液)，室溫輕輕搖動溫育l-2hr。換新的培養(yǎng)皿，加入IOmL上述封閉緩沖液稀釋的一抗(I 500稀釋)，4°C溫育2hr。PBS緩沖液洗滌三次，每次lOmin。將NC膜轉移至另一培養(yǎng)皿中，加適量的二抗緩沖液(150mM NaCl, 50mM Tris-Cl，pH7. 5)，室溫洗滌lOmin。倒去緩沖液，加入含有5%脫脂奶粉的上述二抗緩沖液，并以I : 5000量加入二抗(堿性磷酸酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG)，室溫搖動溫育lhr。再將NC膜轉移至另一培養(yǎng)皿中，加適量的二抗緩沖液(150mM NaCl, 50mM Tris-Cl，pH7. 5)，室溫洗滌三次，每次lOmin。加酶聯(lián)抗體生色底物NBT/BCIP窒溫避光搖動溫育。蛋白帶顏色達到要求后，把膜轉移到另一培養(yǎng)皿中，加終止液(40iiL 0. 5M EDTA， IOmL PBS)終止反應。
所述的活性分析方法包括利用本系統(tǒng)表達的CTB的活性分析和PRX的活性分析。
本實施例采用了 GM1-ELISA的方法分析CTB的活性，具體方法如下用 GMl (SigmaG27641)包被 96 孔酶標板(BIO BASIC INC)，每孔 2 y g (PBS 稀釋，每孔 100 y L)； 同時用半乳糖(Gal)、BSA、PBS作為對照，每個樣品做3個重復，4°C過夜。棄盡包被物，重蒸水連續(xù)沖洗4次；126 BSA(lg BSA溶于IOOmL PBS, pH7. 4)封閉，室溫下放置2_5hr。棄盡封閉液，重蒸水沖洗4次；將IOOng CTB蛋白包被于已結合有GMl的酶標板上；37°C溫育 2hr ;棄盡包被物，重蒸水沖洗4次；加入300 u L封閉緩沖液(0. 05% Tween20, ImM EDTA,0.125%BSA0. 17M H3B04,0. 12M NaCl,pH8. 5)，25°C封閉 30min，用重蒸水沖洗 3 次，再加入 50 U L用封閉緩沖液稀釋的His-tag抗體，室溫2hr ;用重蒸水沖洗3次后，加入封閉緩沖液封閉lOmin，再用重蒸水沖洗3次，加入50 y L用封閉緩沖液稀釋的堿性磷酸酶偶聯(lián)的第二抗體(I 2000)，室溫2hr ;重蒸水沖洗3次后，加入75 u L NPP溶液[5mg NPP溶于50 y L 重蒸水，用NPP緩沖液(0. IIM甘氨酸，ImM MgCl2, IM ZnCl2, pH10. 4)以I 100比例稀釋]； 室溫顯色Ihr后，加入25 ii L 0. 5M NaOH終止反應；對照作相同處理。用酶標儀(Elx800UV， BioTEK)測定各孔溶液的光吸收值，激發(fā)光波長為405nm。
PRX活性采用Amplex Red過氧化氫/過氧化物酶分析試劑盒(Molecular Probes) 進行分析，具體方法參照說明書。用I U g純化的6His-PRX蛋白與Amplex Red反應混合物在30°C條件下進行反應,在SpectraMax 190 (Molecular Devices)儀器上測定560nm的條件下的光吸收值。每Imin采集一次,共采集60min,進行酶活分析。分別以2 y g的6His蛋白和100mU/mL過氧化物酶(HRP)作為陰性和陽性對照。用0,25,37. 5,50,62. 5,75,87. 5 和100mU/mL的標準的HRP與Amplex Red反應混合物在30°C條件下進行反應60min的結果制定標準曲線。利用該標準曲線來計算6His-PRX和6His蛋白的相對活性。
總之，通過構建一個含有產腸毒素大腸桿菌鞭毛蛋白中的一個分子伴侶亞基FaeE,可以提高外源基因在大腸桿菌中的可溶性表達。通過CTB、PRX驗證建立的系統(tǒng)，表明這兩種蛋白在pET30e載體系統(tǒng)中可以獲得可溶性表達，而且表達的可溶的CTB可以和它的受體結合，證明其形成了其天然的構象；表達的可溶的PRX也具有過氧化物酶的活性。
因此，構建的這一載體在提高外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達方面具有重要作用，可以用于多種生物工程酶及生物醫(yī)藥的生產。
權利要求
1.一種用于外源蛋白可溶性表達的表達載體，其特征在于，所述表達載體包含有分子伴侶!^aeE的編碼序列。
2.根據權利要求1所述的表達載體，其特征在于，所述表達載體為原核細胞表達載體。
3.一種用于外源蛋白可溶性表達的大腸桿菌質粒，其特征在于，所述質粒包含有分子伴侶!^aeE的編碼序列。
4.根據權利要求3所述的質粒，其特征在于，所述的分子伴侶!^aeE的編碼序列的5’端添加了大腸桿菌核糖體結合位點。
5.根據權利要求3所述的質粒，其特征在于，所述質粒還含有T7啟動子、Iac操縱子、 T7終止子，所述的分子伴侶!^aeE的編碼序列位于T7啟動子和Iac操縱子的調控下，并通過 T7終止子進行終止。
6.根據權利要求5所述的質粒，其特征在于，所述質粒還含有由BamHI, EcoR I, Sac I、Hind III、Hot I,Xho I限制性內切酶識別位點組成的多克隆位點，位于所述的分子伴侶 FaeE的編碼序列和所述的T7終止子之間。
7.根據權利要求6所述的質粒，其特征在于，所述質粒還含有6個His-tag基因，位于所述的多克隆位點和所述的T7終止子之間。
8.根據權利要求3所述的質粒，其特征在于，所述質粒為pET30e，序列如kqID No. 1 所示。
9.根據權利要求3-7中任一權利要求所述的質粒，其特征在于，所述質粒還包括所述外源蛋白的編碼序列，與所述的分子伴侶i^aeE的編碼序列位于同一個表達單元。
10.根據權利要求9所述的質粒，其特征在于，所述外源蛋白是霍亂毒素B亞基(CTB)。
11.根據權利要求9所述的質粒，其特征在于，所述外源蛋白是過氧化物酶前體(PRX)。
12.根據權利要求9所述的質粒的應用方法，其特征在于，所述方法包括將所述的質粒分子轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞得到重組大腸桿菌菌落，經接種培養(yǎng)得到菌體細胞后實現(xiàn)可溶性表達的提高。
13.根據權利要求12所述的應用方法，其特征在于，所述的大腸桿菌感受態(tài)細胞是大腸桿菌 BL21(DE3)。
14.根據權利要求13所述的應用方法，其特征在于，所述的轉化方法是熱激法。
15.一種制備用于外源蛋白可溶性表達的表達載體的方法，其特征在于，所述方法包括將分子伴侶i^aeE的編碼序列克隆進所述表達載體中而獲得所述的用于外源蛋白可溶性表達的表達載體。
16.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，所述表達載體是原核細胞表達載體。
17.根據權利要求15所述的方法，其特征在于，所述表達載體是大腸桿菌質粒。
18.根據權利要求17所述的方法，其特征在于，所述的大腸桿菌質粒是表達載體 pET30ao
19.根據權利要求18所述的方法，其特征在于，通過NdeI和BamH I兩個限制性內切酶將所述的分子伴侶i^aeE的編碼序列克隆進所述的表達載體pET30a。
20.根據權利要求18所述的方法，其特征在于，所述方法還包括使所述的分子伴侶 FaeE的編碼序列位于T7啟動子和Iac操縱子的調控下。
21.根據權利要求17所述的方法，其特征在于，所述方法還包括在將分子伴侶!^aeE的編碼序列克隆進大腸桿菌質粒前，在分子伴侶FaeE編碼序列的5’端添加大腸桿菌核糖體結合位點。
全文摘要
一種生物工程技術領域的用于外源蛋白可溶性表達的質粒及其制備和應用方法，該質粒為pET30e，其DNA序列如Seq ID No.1所示；通過將質粒模板與引物組進行PCR擴增后獲得的擴增產物與pMD18-T載體連接，經轉化大腸桿菌DH5α后獲得大腸桿菌克隆體，將大腸桿菌克隆體作為底物進行酶切連接后將得到的產物轉化大腸桿菌DH5α，獲得可溶性表達質粒分子；應用方法將獲得的表達質粒分子，用熱激法轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞得到重組大腸桿菌菌落，經接種培養(yǎng)得到菌體細胞后實現(xiàn)可溶性表達的提高。本發(fā)明對于幫助外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達具有促進作用，對進一步的分析這些蛋白的功能具有重要的意義。
文檔編號C12N15/70GK102533835SQ20111044638
公開日2012年7月4日 申請日期2010年8月31日 優(yōu)先權日2010年8月31日
發(fā)明者張大兵, 梁婉琪, 申慧峰, 袁政 申請人:上海交通大學