專利名稱：兔軟骨下骨成骨細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種兔膝關(guān)節(jié)炎軟骨下骨成骨細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種臨床常見的老年性退變性疾病，以關(guān)節(jié)疼痛和關(guān)節(jié)功能障礙(包括關(guān)節(jié)畸形)為主要臨床表現(xiàn)。OA是以軟骨降解和軟骨下骨硬化為主要特征的骨再造，二者之間的聯(lián)系對(duì)提示骨細(xì)胞代謝活性的改變有著重要意義。OA 治療時(shí)既應(yīng)關(guān)注軟骨變化，又要預(yù)防軟骨下骨退變。然而多年來(lái)的研究多數(shù)集中在軟骨病變上，軟骨下骨的研究甚少。Radin等首次提出軟骨下骨可能在軟骨退變的開始及進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。骨重塑異常引起的軟骨下骨硬化，使其失去作為一個(gè)“震蕩吸收器”的作用， 從而使反作用于關(guān)節(jié)軟骨的應(yīng)力增強(qiáng)，同時(shí)其釋放的因子通過(guò)生物學(xué)交流影響軟骨細(xì)胞的代謝，導(dǎo)致軟骨破壞Amin AK, Huntley JS, Simpson AH, Hall AC. Chondrocyte survival in articular cartilage :the influence of subchondral bone in a bovine model. J Bone Joint Surg Br. 2009,91(5) :691_9。另外還有研究者提出軟骨下骨重塑可先于軟骨的退變，導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎的病變。Sanchez等對(duì)OA病人軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，并與OA 軟骨下骨硬化骨共培，發(fā)現(xiàn)硬化骨成骨細(xì)胞會(huì)阻礙軟骨細(xì)胞聚集蛋白多糖基因表達(dá)，卻促進(jìn)金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-3及MMP-13表達(dá)，表明OA病人的軟骨下硬化骨成骨細(xì)胞可以刺激軟骨細(xì)胞產(chǎn)生MMP而引起軟骨降解，并抑制聚集蛋白多糖的合成Sanchez C, Deberg ΜΑ, Piccardi N, et al, Subchondral bone osteoblasts induce phenotypic changes in human osteoarthritic chondrocytes[J]. Osteoarthritis Cartilage. 2005 ；13 (11) 979-997.。然而上述方法是通過(guò)骨組織與軟骨細(xì)胞共培完成，如果我們可以成功分離出軟骨下骨成骨細(xì)胞與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，得到的結(jié)果無(wú)疑更有說(shuō)服力。軟骨下骨成骨細(xì)胞的分離、純化、體外大量擴(kuò)增對(duì)于骨性關(guān)節(jié)炎的研究具有重要意義。骨性關(guān)節(jié)炎是力學(xué)和生物學(xué)因素共同作用下，軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、軟骨下骨成骨細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)降解合成偶聯(lián)失衡的結(jié)果。以滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、軟骨下骨成骨細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，可以在模擬體內(nèi)環(huán)境的條件下，考察三種細(xì)胞間的相互影響，從細(xì)胞的角度去推斷骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。同時(shí)，軟骨下骨成骨細(xì)胞具有普通成骨細(xì)胞的功能表達(dá)，亦可作為種子細(xì)胞參與骨組織工程的研究。目前涉及到軟骨下骨的研究均是以生物力學(xué)及外科手術(shù)研究為主，生物學(xué)研究特別是細(xì)胞學(xué)水平的研究甚少。究其原因，除了骨性關(guān)節(jié)炎標(biāo)準(zhǔn)化模型制造困難，更重要的是骨性關(guān)節(jié)炎軟骨下骨成骨細(xì)胞難以獲取?，F(xiàn)報(bào)道的成骨細(xì)胞的培養(yǎng)方法主要有酶消化法和組織塊法，前者是將消化骨片后的細(xì)胞懸浮液離心后所得細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)，而后者是用骨片貼附培養(yǎng)Pelletier JP, Lajeunesse D, Jovanovic DV, et al. Carprofen simultaneously reduces progression of morphological changes in cartilage and subchondral bone in experimental dog osteoarthritis[J]. J Rheumato12000 ；27 2893-2902.。兩種方法對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的顱骨或骨膜來(lái)源組織的消化均能得到一定量的成骨細(xì)胞，然而對(duì)于成年關(guān)節(jié)炎模型動(dòng)物的軟骨下骨成骨細(xì)胞的分離效果鮮有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種兔軟骨下骨成骨細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法及應(yīng)用，通過(guò)利用兔關(guān)節(jié)不穩(wěn)模型，采用I型膠原酶消化聯(lián)合組織塊貼附法獲得軟骨下骨成骨細(xì)胞，所獲得的細(xì)胞純度高且增殖能力良好。本發(fā)明建立一種簡(jiǎn)單、高效的軟骨下骨成骨細(xì)胞的制備方法。對(duì)研究OA發(fā)生、發(fā)展及其防治OA有重要意義。本發(fā)明提供的兔膝關(guān)節(jié)炎軟骨下骨成骨細(xì)胞是采用改良Hulth兔關(guān)節(jié)不穩(wěn)模型， 無(wú)菌手術(shù)分離兔膝關(guān)節(jié)，于脛骨平臺(tái)下軟骨下骨皮質(zhì)區(qū)獲取軟骨下骨骨片，通過(guò)酶消化聯(lián)合貼壁法獲得的。本發(fā)明提供的兔膝關(guān)節(jié)炎軟骨下骨成骨細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法包括如下的步驟1)制作改良Hulth兔關(guān)節(jié)不穩(wěn)模型4 6周后，無(wú)菌手術(shù)分離兔膝關(guān)節(jié)；2)將脛骨平臺(tái)軟骨下骨皮質(zhì)區(qū)削為小骨片，經(jīng)I型膠原酶-EDTA復(fù)合酶消化 0. 5 2小時(shí)，I型膠原酶單獨(dú)消化2次，第1次12-20小時(shí)，第2次1 4小時(shí)，棄凈消化液；3)將骨片接種于血清包被的12孔板內(nèi)，分次加入培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2天換液，注意手法輕柔，勿使骨片漂起；4)骨片貼附7 14天開始有細(xì)胞從骨片邊緣爬出，制備出軟骨下骨成骨細(xì)胞。所述的骨片來(lái)源于脛骨平臺(tái)軟骨下骨皮質(zhì)區(qū)，大小為0. 5 3X0. 5 3Xlmm。步驟2)所述的I型膠原酶-EDTA復(fù)合酶濃度為0. 05 0. 5 % I型膠原酶及0. 01 0. 05% EDTA，消化條件為搖床37°C，250 500轉(zhuǎn)/分。所述的I型膠原酶單獨(dú)消化濃度為0. 05 0. 5%，第1次消化條件為M 30°C， 第2次消化條件為搖床37°C，250 500轉(zhuǎn)/分。步驟幻所述的培養(yǎng)液為包含5-20%胎牛血清的高糖DMEM。所述軟骨下骨成骨細(xì)胞呈短梭形或三角形，胞體透亮，折光性好，經(jīng)過(guò)四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、I型膠原染色及RT-PCR檢測(cè)鑒定，證實(shí)其確實(shí)具有成骨細(xì)胞生物學(xué)特性，增殖能力良好，純度高。所述的軟骨下骨成骨細(xì)胞可作為骨組織工程種子細(xì)胞，觀察其增殖活性及特異性表達(dá)產(chǎn)物可作為評(píng)價(jià)調(diào)控軟骨下骨代謝及重塑藥物療效的可靠手段。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于所選用的關(guān)節(jié)不穩(wěn)模型可以準(zhǔn)確定位并獲取軟骨下骨骨片。經(jīng)過(guò)兩步復(fù)合酶消化法獲取的目標(biāo)骨片在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)7 14天即可見細(xì)胞貼壁、伸展和增殖。來(lái)源于關(guān)節(jié)炎模型的軟骨下骨成骨細(xì)胞比顱骨、骨膜等來(lái)源的成骨細(xì)胞更適合于骨性關(guān)節(jié)的研究，及在防治骨性關(guān)節(jié)炎方面的應(yīng)用。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單易行，獲取時(shí)間短，獲得的細(xì)胞成活率高、純度高，可在短時(shí)間內(nèi)滿足大量制備的需要。


圖1兔關(guān)節(jié)炎膝關(guān)節(jié)大體照。圖2兔關(guān)節(jié)炎膝關(guān)節(jié)組織學(xué)HE染色(a) X 400和(b) X 100。
圖3P0軟骨下骨成骨細(xì)胞培養(yǎng)1 Id (X 100)。圖4P0軟骨下骨細(xì)胞培養(yǎng)21d(X100)。圖5P1軟骨下骨細(xì)胞培養(yǎng)Id (X 100)。圖6P1軟骨下骨細(xì)胞培養(yǎng)9d (X 100)。圖7軟骨下骨成骨細(xì)胞增殖活性曲線。圖8軟骨下骨成骨細(xì)胞I型膠原免疫組化染色陽(yáng)性(X 100)。圖9軟骨下骨成骨細(xì)胞RT-PCR檢測(cè)I型膠原表達(dá)陽(yáng)性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說(shuō)明。1)改良Hulth動(dòng)物模型王云峰，白人驍，張楊等.改良Hulth模型復(fù)制膝不同時(shí)期骨關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究.天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).2009，15 (3) :25-27構(gòu)建兔關(guān)節(jié)不穩(wěn)模型 選用3 4月齡健康新西蘭大耳白兔(清潔級(jí)，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，雌雄不限，肌注氯胺酮 100 μ 1/kg (軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)、速眠新II 100 μ 1/kg (軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)聯(lián)合麻醉后，在常規(guī)無(wú)菌條件下，于兔膝關(guān)節(jié)前內(nèi)側(cè)行縱形切口，暴露膝關(guān)節(jié)，切斷前交叉韌帶，切除內(nèi)側(cè)半月板，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶。術(shù)中保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨不受損傷。無(wú)菌生理鹽水將關(guān)節(jié)腔沖洗干凈，逐層縫合。分籠飼養(yǎng)。術(shù)后抗感染治療，連續(xù)3天，密切觀察傷口情況。造模4 6周，關(guān)節(jié)不穩(wěn)模型造模成功。表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)腫脹，滑膜充血水腫，炎性滲出增多，關(guān)節(jié)軟骨失去光澤，關(guān)節(jié)面粗糙，可見小裂隙(圖1)。組織學(xué)表現(xiàn)為軟骨面纖維化，軟骨細(xì)胞壞死(圖2-a)，與軟骨下骨脫離，表層見纖維素性滲出物包裹的纖維軟骨組織 (圖 2-b)。2)選用空氣栓塞法處死模型兔，無(wú)菌條件下，逐層切開膝關(guān)節(jié)皮膚、皮下組織。 去除關(guān)節(jié)囊周圍的肌肉等軟組織，咬骨鉗分離出整個(gè)關(guān)節(jié)，用含100 500U/ml青霉素的 Hank’ s液浸泡10 30分鐘，再用Hank’ s液沖洗3次，放入無(wú)菌大平皿中。切開關(guān)節(jié)囊，充分暴露關(guān)節(jié)，用手術(shù)刀去除脛骨平臺(tái)表面的關(guān)節(jié)軟骨和其它結(jié)締組織，暴露軟骨下骨皮質(zhì)區(qū)準(zhǔn)確定位。用錘子敲擊手術(shù)刀將軟骨下骨皮質(zhì)區(qū)削為大小約 0. 5 3 X 0. 5 3 X Imm的骨片，直至肉眼見到脛骨平臺(tái)出現(xiàn)蜂窩樣骨小梁組織為止。獲得的骨片立即放入含100 300U/ml青霉素的Hank，s液浸泡5 10分鐘，再移入Hank，s 液繼續(xù)清洗2次，獲得軟骨下骨骨片。3)將經(jīng)過(guò)Hank’ s液清洗的骨片移入0. 05 0. 5% I型膠原酶(Invitrogen)及 0. 01 0. 05 % EDTA復(fù)合酶消化液中進(jìn)一步剪碎后，置入搖床37°C，250 500轉(zhuǎn)/分，消化0. 5 2小時(shí)，800 1500轉(zhuǎn)/分離心5 15分鐘棄凈消化液；再次加入0. 05 0. 5% I型膠原酶消化液，24 30°C條件下消化10 20小時(shí)；置入搖床36 38°C，250 500 轉(zhuǎn)/分，1 4小時(shí)，血清終止消化，800 1500轉(zhuǎn)/分離心5 15分鐘棄凈消化液，獲得目標(biāo)軟骨下骨骨片。4)目標(biāo)骨片接種于血清包被的12孔板內(nèi)(Gibco血清均勻涂布于培養(yǎng)板底，37°C， 5% C02條件下12-20小時(shí))，每孔約5 10片，置于37°C，1 10% (X)2條件下固定培養(yǎng) 0. 5 3小時(shí)，而后每孔于組織塊周圍輕輕滴加100 200μ 1含5 20% Gibco FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；1 4小時(shí)后，每孔再加入100 400 μ 1上述培養(yǎng)液；培養(yǎng)12 M小時(shí)后，再加入500 μ 1培養(yǎng)液。此后每2天換液一次，每孔500μ 1 800μ 1 5 20% GibcoFBS的高糖DMEM培養(yǎng)液，注意手法輕柔，勿使骨片漂起。骨片貼附7 14天開始有細(xì)胞從骨片邊緣爬出，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞呈短梭形或三角形，胞體透亮。(圖3)。21天，細(xì)胞以骨片為中心，密度明顯增大，細(xì)胞間隙致密(圖 4)。傳代接種后1天，細(xì)胞以短梭型為主(圖幻，9天可呈復(fù)層生長(zhǎng)(圖6)。5)經(jīng)四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性Mosmann Τ. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival!application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods, 1983,65 (1-2)，在培養(yǎng)過(guò)程中軟骨下骨成骨細(xì)胞的增殖活性總體呈上升趨勢(shì)，10天時(shí)最高。(圖7)6) I型膠原免疫組化染色4%多聚甲醛固定15min，加入3% H2A 15min，PBS洗3 次；加入10倍稀釋的羊血清lOmin，甩干；加入1 50的I型膠原一抗4°C過(guò)夜，PBS洗3 次；加入二抗90min，PBS洗3次；加入DAB，避光15min，去離子水沖洗，鏡下觀察。及RT-PCR 檢測(cè)I型膠原表達(dá)楊志明，余希杰，解慧琪等.不同來(lái)源成骨細(xì)胞生物學(xué)特性的比較研究.中華創(chuàng)傷雜志.2001，17(1) :10-13證明所制備的軟骨下骨來(lái)源的成骨細(xì)胞具有合成分泌I型膠原的功能活性(圖8)，在mRNA水平，I型膠原高表達(dá)(圖9)。
權(quán)利要求
1.一種兔膝關(guān)節(jié)炎軟骨下骨成骨細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法，其特征在于，包括如下的步驟1)制作改良Hulth兔關(guān)節(jié)不穩(wěn)模型4 6周后，無(wú)菌手術(shù)分離兔膝關(guān)節(jié)；2)將脛骨平臺(tái)軟骨下骨皮質(zhì)區(qū)削為小骨片，經(jīng)I型膠原酶-EDTA復(fù)合酶消化0.5 2 小時(shí)，I型膠原酶單獨(dú)消化2次，第1次12-20小時(shí)，第2次1 4小時(shí)，棄凈消化液；3)將骨片接種于血清包被的12孔板內(nèi)，分次加入培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2天換液，注意手法輕柔，勿使骨片漂起；4)骨片貼附7 14天開始有細(xì)胞從骨片邊緣爬出，制備出軟骨下骨成骨細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的骨片來(lái)源于脛骨平臺(tái)軟骨下骨皮質(zhì)區(qū),大小為0. 5 3X0. 5 3X 1mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的I型膠原酶-EDTA復(fù)合酶濃度為0. 05 0. 5% I型膠原酶及0. 01 0. 05% EDTA,消化條件為搖床37°C，250 500轉(zhuǎn)/ 分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的I型膠原酶單獨(dú)消化濃度為 0. 05 0. 5%，第1次消化條件為M 30°C，第2次消化條件為搖床37°C，250 500轉(zhuǎn)/ 分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述的培養(yǎng)液為包含5-20%胎牛血清的高糖DMEM。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法得到的兔膝關(guān)節(jié)炎軟骨下骨成骨細(xì)胞，其呈短梭形或三角形，胞體透亮。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法得到的兔膝關(guān)節(jié)炎軟骨下骨成骨細(xì)胞在評(píng)價(jià)調(diào)控軟骨下骨代謝及重塑藥物療效中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種兔膝關(guān)節(jié)炎軟骨下骨成骨細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法及應(yīng)用。其培養(yǎng)方法是首先制作改良Hulth兔關(guān)節(jié)不穩(wěn)模型4～6周后無(wú)菌手術(shù)分離兔膝關(guān)節(jié)；然后將脛骨平臺(tái)軟骨下骨皮質(zhì)小骨片經(jīng)I型膠原酶-EDTA復(fù)合酶消化0.5～2小時(shí)后接種于血清包被的12孔板內(nèi)，分次加入培養(yǎng)液培養(yǎng)；骨片貼附7～14天開始有細(xì)胞從骨片邊緣爬出。所獲得的細(xì)胞純度高且增殖能力良好。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單易行，獲取時(shí)間短，獲得的細(xì)胞成活率高、純度高，可在短時(shí)間內(nèi)滿足大量制備的需要，對(duì)研究骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展及其防治骨性關(guān)節(jié)炎有重要意義。
文檔編號(hào)C12N5/077GK102517250SQ201110445679
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者馮俊奇, 孫曉雷, 崔麗, 張楊, 張瑋, 李秀蘭, 郭悅 申請(qǐng)人:天津市天津醫(yī)院