專利名稱：一種能夠定向調(diào)控軟骨細(xì)胞積聚的活性微球及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胚胎發(fā)育過程軟骨細(xì)胞積聚、臨床中軟骨缺損修復(fù)過程中的代替物及構(gòu)建軟骨組織修復(fù)的生物活性支架材料，具體地說是ー種具有能夠調(diào)控軟骨細(xì)胞定向積聚的生物活性多孔微球支架材料的制備方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞積聚不僅在軟骨的胚胎發(fā)育中至關(guān)重要，而且積聚發(fā)生的時間、空間以及方式都會顯著影響成體軟骨的維持和再生。在胚胎發(fā)育期，軟骨前體細(xì)胞積聚進(jìn)而形成胚胎早期軟骨肢芽的輪廓；隨后，透明質(zhì)酸酶降解細(xì)胞外基質(zhì)導(dǎo)致的細(xì)胞積聚引發(fā)進(jìn)ー步的軟骨細(xì)胞分化和組織形成。在成體軟骨中，軟骨細(xì)胞積聚在軟骨陷窩中。胚胎期的細(xì)胞積聚主要表現(xiàn)在細(xì)胞與細(xì)胞之間通過神經(jīng)細(xì)胞黏附分子和神經(jīng)鈣粘素的直接粘附；而在成體軟骨中，細(xì)胞積聚主要由細(xì)胞膜表面的整合素與II型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合形成。 tenascin-C 和 COMP (cartilage oligomeric matrixprotein)等細(xì)胞外基質(zhì)成分在發(fā)育的不同階段通過與細(xì)胞的整合素以及細(xì)胞表面受體⑶44，⑶105，⑶166相互作用完成對細(xì)胞積聚的調(diào)控。細(xì)胞積聚還可以通過抵抗細(xì)胞凋亡而促進(jìn)軟骨形成。有研究從不同側(cè)面證明了適當(dāng)?shù)募?xì)胞積聚有利于軟骨細(xì)胞分化和組織形成，同時也有研究表明磁珠介導(dǎo)的細(xì)胞積聚在體外適當(dāng)條件下可以提升軟骨細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)分泌。在體外軟骨細(xì)胞聚集的微團(tuán)培養(yǎng)中，單個軟骨細(xì)胞的成軟骨效率是由Wnt/β -catenin信號通路調(diào)控，并在特定數(shù)量下達(dá)到峰值。間充質(zhì)干細(xì)胞在殼聚糖修飾的聚乳酸與聚己內(nèi)酯共聚物多孔支架材料中積聚并分化成軟骨細(xì)胞，并且支架中添加的聚羥基丁酸酯(PHBV)微球促進(jìn)細(xì)胞的積聚并濃集了細(xì)胞外基質(zhì)。與軟骨細(xì)胞在水凝膠中分散存在并保持球形、不貼附狀態(tài)不同，軟骨細(xì)胞在多孔材料中顯著地積聚和増殖，這種積聚提升了成軟骨能力并減少了凋亡。目前很多方法可以調(diào)控細(xì)胞積聚，但都不適合在生物支架材料中應(yīng)用。體外誘導(dǎo)干細(xì)胞或軟骨細(xì)胞形成軟骨最有效的方法是人為造成高密度細(xì)胞積聚來模仿胚胎發(fā)育過程，如小球培養(yǎng)(pellet)和微團(tuán)培養(yǎng)(micromass)。介電泳力、離心カ結(jié)合AggrewelI 、激光，微流芯片等技術(shù)可以體外人為積聚細(xì)胞，但尚未應(yīng)用到三維支架材料和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中。磁カ介導(dǎo)細(xì)胞積聚比較成熟，但由于其有磁珠的殘留，不適合用于再生醫(yī)學(xué)。透明質(zhì)酸酶和I型膠原能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞積聚，而P1整合素抗體和膠原酶阻礙積聚的發(fā)生。在三維支架材料中，整合素對纖維粘連蛋白的特異性識別可以影響間充質(zhì)干細(xì)胞分化。細(xì)胞在傳統(tǒng)的三維多孔支架材料中趨向于局部濃集和積聚，但上述支架材料都缺乏主動調(diào)控細(xì)胞積聚的能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種具有能夠在體外調(diào)控軟骨定向積聚的生物活性多孔微球支架材料的制備方法，為軟骨細(xì)胞的體外功能表達(dá)提供良好的載體，同時為組織工程化軟骨提供ー種良好的生物支架材料。為實(shí)現(xiàn)上述目的，提供ー種能夠定向調(diào)控軟骨細(xì)胞體外積聚的活性多孔微載體，通過該エ藝制備的活性多孔微載體主要為含有生物活性的蛋白類、糖類以及趨化因子(Chemokine, Platelet-Derived Growth Factor)的多孔微載體。生物活性多孔微載體的制備エ藝，包括以下エ藝步驟(I)多孔聚酯類高分子微球制備將標(biāo)記為W1相的1-2. 5ml濃度為2. 5-10. Owt%的NH4HCO3溶液，加入2-10ml濃度為I. 0-6. 25wt%的脂肪族聚酯高分子有機(jī)溶液中，該高分子有機(jī)溶液標(biāo)記為O相，然后在冰浴中用均質(zhì)攪拌機(jī)高速攪拌得到初乳液，迅速將所得W1/O相初乳液倒入100-400ml的O. lwt%的標(biāo)記為W2相的聚こ烯醇PVA水溶液中，室溫下機(jī)械攪拌得到W1AVw2相二次乳液，在二次乳化過程中有機(jī)溶劑揮發(fā)最終得到多孔高分子微球，用去離子水反復(fù)沖洗所得微球，然后進(jìn)行冷凍干燥； (2)化學(xué)交聯(lián)將多孔微球浸入體積比為I : I的こ醇/水混合溶劑中浸泡2-3h，以去除表面粘附的油脂和其它雜質(zhì)；用水充分漂洗并烘干后，浸入1，6_己ニ胺濃度為O. 02-0. 10g/ml的異丙醇溶液中，37°C下反應(yīng)5_15分鐘，用無水こ醇終止反應(yīng)，并用去離子水充分漂洗以去除未反應(yīng)的己ニ胺；將胺解后的三維多孔支架浸入濃度為lwt%的戊ニ醛溶液中24小吋，然后利用去離子水清洗，浸泡24小時以保證徹底去除戊ニ醛；將多孔微球浸入不同生物活性大分子的こ酸溶液中，溶液中生物活性大分子含量為2-10mg/ml, pH=3. 5,反應(yīng)24h，反應(yīng)溫度2-4°C ;反應(yīng)結(jié)束后用I. Owt^的醋酸溶液和去離子水分別浸泡24h以去除剰余的生物活性大分子；(3)干燥將反應(yīng)制備得到的活性多孔微球在冷凍干燥機(jī)中干燥24h，即完成生物活性多孔載體微球的制備。所述的高分子材料為聚羥基こ酸、聚乳酸、聚こ醇酸中一種或從中選取幾種進(jìn)行復(fù)配。對于有機(jī)溶劑制備所使用的溶劑為ニ氯甲烷，其他有機(jī)溶劑不適合雙乳化揮發(fā)法制備多孔微球。而在活性成分修飾的步驟中，所使用的活性成分主要有明膠、ニ型膠原、RGD、殼聚糖、硫酸軟骨素或者天然軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的活性成分以及TOGF等趨化因子。本發(fā)明的技術(shù)效果如下具備特定形貌和生物活性的微球可以在生物支架材料中主動調(diào)控細(xì)胞積聚。經(jīng)研究表明細(xì)胞在生物支架材料中的種植過程(Cell Seeding)中趨向隨機(jī)分布，而現(xiàn)有的生物材料普遍缺乏預(yù)埋的活性位點(diǎn)主動調(diào)控細(xì)胞的分布。很多跡象顯示這種主動調(diào)控可能顯著減少細(xì)胞的凋亡并提升細(xì)胞的功能活性。除了活性位點(diǎn)，生化因子的濃度梯度也能調(diào)控細(xì)胞的遷移而誘導(dǎo)細(xì)胞定向積聚。軟骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞的直徑在10 μ m左右，通過細(xì)胞膜表面的糖蛋白如整合素等與基質(zhì)或材料結(jié)合進(jìn)而粘附、増殖和遷移。調(diào)控細(xì)胞定向分布和積聚的微球應(yīng)該具有如下特點(diǎn)1)較大的比表面積和生物活性位點(diǎn)使細(xì)胞能夠接觸并粘附其表面；2)多孔、可降解結(jié)構(gòu)能介導(dǎo)黏附在其表面的細(xì)胞遷移和積聚；3)生化因子的有效濃度梯度；4)可以加載細(xì)胞?；谏鲜隼斫?，我們設(shè)計了在生物支架材料中主動介導(dǎo)細(xì)胞積聚的微球，它們具備如下特點(diǎn)1)良好的生物相容性和降解性；井隨著外層材料的降解，細(xì)胞進(jìn)一步積聚；2)合理的理化性質(zhì)和微觀拓?fù)湫蚊玻?)微球直徑在100-150 μ m,具有連通性良好的多孔結(jié)構(gòu)，孔徑20-40 μ m ;4)具備由內(nèi)向外的生物活性因子濃度梯度。


圖I為生物活性微球制備示意圖，其表明了將高分子微球修飾上生物活性分子(如明膠等)，并通過調(diào)整微球的降解速率形成生化因子的濃度梯度，調(diào)控細(xì)胞的粘附與積聚。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I活性多孔微球的制備(I)多孔聚乳酸高分子微球制備將I. 25ml濃度為5%的NH4HCO3溶液(W1相)加入4ml濃度為3. 13%的聚乳酸高分子有機(jī)溶液中(O相)，然后在冰浴中用均質(zhì)攪拌機(jī)高速攪拌得到初乳液(W1A))，迅速將所得初乳液倒入400ml O. 1%的PVA水溶液中(W2相)，室溫下機(jī)械攪拌得到二次乳液(W1AVW2)，在二次乳化過程中有機(jī)溶劑揮發(fā)最終得到多孔聚乳酸高分子微球，去離子水反復(fù)沖洗所得微球，最后冷凍干燥得到所需的微球；(2)化學(xué)交 聯(lián)將多孔微球浸入50mlこ醇/水(1/1，v/v)混合溶劑中浸泡2 — 3h，以去除表面粘附的油脂和其它雜質(zhì)。用水充分漂洗并烘干后，浸入20mll-6己ニ胺濃度為O. 06g/ml異丙醇溶液中，37度下反應(yīng)5分鐘，用無水こ醇終止反應(yīng)，并用大量水充分漂洗以去除未反應(yīng)的己ニ胺。將胺解后的三維多孔微球浸入50ml濃度為lwt%的戊ニ醛溶液中24小時，然后利用大量去離子水清洗，大約浸泡24小時以保證徹底去除戊ニ醛。然后將支架浸入50ml殼聚糖生物活性大分子(2mg，こ酸PH=3. 5)的溶液中反應(yīng)24個小時，反應(yīng)溫度為2 — 4°C。反應(yīng)完之后分別用I. 0%的醋酸溶液和去離子水分別浸泡24小時以去除剰余的生物活性大分子。(3)干燥將反應(yīng)制備得到的活性多孔微球在冷凍干燥機(jī)中干燥24h，即完成活性多孔微球的制備。實(shí)施例2活性多孔微球的制備(I)多孔聚乳酸高分子微球制備將I. 25ml濃度為5%的NH4HCO3溶液(W1相)加入4ml濃度為3. 13%的聚乳酸高分子有機(jī)溶液中(O相)，然后在冰浴中用均質(zhì)攪拌機(jī)高速攪拌得到初乳液(W1A))，迅速將所得初乳液倒入400ml0. 1%的PVA水溶液中(W2相)，室溫下機(jī)械攪拌得到二次乳液(W1AVW2)，在二次乳化過程中有機(jī)溶劑揮發(fā)最終得到多孔聚乳酸高分子微球，去離子水反復(fù)沖洗所得微球，最后冷凍干燥得到所需的微球；(2)化學(xué)交聯(lián)將多孔微球浸入50mlこ醇/水(1/1，v/v)混合溶劑中浸泡2 — 3h，以去除表面粘附的油脂和其它雜質(zhì)。用水充分漂洗并烘干后，浸入20ml 1-6己ニ胺濃度為O. 06g/ml異丙醇溶液中，37度下反應(yīng)5分鐘，用無水こ醇終止反應(yīng)，并用大量水充分漂洗以去除未反應(yīng)的己ニ胺。將胺解后的三維多孔微球浸入50ml濃度為Iwt %的戊ニ醛溶液中24小時，然后利用大量去離子水清洗，大約浸泡24小時以保證徹底去除戊ニ醛。然后將支架浸入50ml明膠生物活性大分子(2mg，こ酸PH=3. 8)的溶液中反應(yīng)24個小吋，反應(yīng)溫度為2 — 4°C。反應(yīng)完之后分別用I. 0%的醋酸溶液和去離子水分別浸泡24小時以去除剰余的生物活性大分子。(3)干燥將反應(yīng)制備得到的活性多孔微球在冷凍干燥機(jī)中干燥24h，即完成活性多孔微球的制備。實(shí)施例3活性多孔微球的制備(I)多孔聚乳酸高分子微球制備將I. 25ml濃度為5%的NH4HCO3溶液(W1相)加入4ml濃度為3. 13%的聚乳酸高分子有機(jī)溶液中(O相)，然后在冰浴中用均質(zhì)攪拌機(jī)高速攪拌得到初乳液(W1A)),迅速將所得初乳液倒入400ml O. 1%的PVA水溶液中(W2相)，室溫下機(jī)械攪拌得到二次乳液(W1AVW2)，在二次乳化過程中有機(jī)溶劑揮發(fā)最終得到多孔聚乳酸高分子微球，去離子水反復(fù)沖洗所得微球，最后冷凍干燥得到所需的微球；(2)化學(xué)交聯(lián)將多孔微球浸入50mlこ醇/水(1/1，v/v)混合溶劑中浸泡2 — 3h，以去除表面粘附的油脂和其它雜質(zhì)。用水充分漂洗并烘干后，浸入20ml 1-6己ニ胺濃度為O. 06g/ml異丙醇溶液中，37度下反應(yīng)5分鐘，用無水こ醇終止反應(yīng)，并用大量水充分漂洗以去除未反應(yīng)的己ニ胺。將胺解后的三維多孔微球浸入50ml濃度為lwt%的戊ニ醛溶液中24小時，然后利用大量去 離子水清洗，大約浸泡24小時以保證徹底去除戊ニ醛。然后將支架浸入50ml ニ型膠原生物活性大分子(2mg，こ酸PH=3. 8)的溶液中反應(yīng)24個小時，反應(yīng)溫度為2 — 4°C。反應(yīng)完之后分別用I. O %的醋酸溶液和去離子水分別浸泡24小時以去除剰余的生物活性大分子。
(3)干燥將反應(yīng)制備得到的活性多孔微球在冷凍干燥機(jī)中干燥24h，即完成活性多孔微球的制備。實(shí)施例4活性多孔微球的制備(I)多孔聚乳酸高分子微球制備將I. 25ml濃度為5%的NH4HCO3溶液(W1相)加入4ml濃度為3. 13%的聚乳酸高分子有機(jī)溶液中(O相)，然后在冰浴中用均質(zhì)攪拌機(jī)高速攪拌得到初乳液(W1A))，迅速將所得初乳液倒入400ml O. 1%的PVA水溶液中(W2相)，室溫下機(jī)械攪拌得到二次乳液(W1AVW2)，在二次乳化過程中有機(jī)溶劑揮發(fā)最終得到多孔聚乳酸高分子微球，去離子水反復(fù)沖洗所得微球，最后冷凍干燥得到所需的微球；(2)化學(xué)交聯(lián)將多孔微球浸入50mlこ醇/水(1/1，v/v)混合溶劑中浸泡2 — 3h，以去除表面粘附的油脂和其它雜質(zhì)。用水充分漂洗并烘干后，浸入20ml 1-6己ニ胺濃度為O. 06g/ml異丙醇溶液中，37度下反應(yīng)5分鐘，用無水こ醇終止反應(yīng)，并用大量水充分漂洗以去除未反應(yīng)的己ニ胺。將胺解后的三維多孔微球浸入50ml濃度為lwt%的戊ニ醛溶液中24小時，然后利用大量去離子水清洗，大約浸泡24小時以保證徹底去除戊ニ醛。然后將支架浸入50ml天然軟骨細(xì)胞外基質(zhì)生物活性大分子(2mg，こ酸PH=3. 8)的溶液中反應(yīng)24個小吋，反應(yīng)溫度為2 — 4°C。反應(yīng)完之后分別用I. O %的醋酸溶液和去離子水分別浸泡24小時以去除剰余的生物活性大分子。(3)干燥將反應(yīng)制備得到的活性多孔微球在冷凍干燥機(jī)中干燥24h，即完成活性多孔微球的制備。實(shí)施例5活性多孔微球的制備(I)多孔聚乳酸-羥基こ酸高分子微球制備將I. 25ml濃度為5%的NH4HCO3溶液(W1相)加入4ml濃度為3. 13%的聚乳酸-羥基こ酸高分子有機(jī)溶液中(O相)，然后在冰浴中用均質(zhì)攪拌機(jī)高速攪拌得到初乳液(W1A)),迅速將所得初乳液倒入400ml O. 1%的PVA水溶液中(W2相)，室溫下機(jī)械攪拌得到二次乳液(W1AVW2)，在二次乳化過程中有機(jī)溶劑揮發(fā)最終得到多孔聚乳酸-羥基こ酸高分子微球，去離子水反復(fù)沖洗所得微球，最后冷凍干燥得到所需的微球；(2)化學(xué)交聯(lián)將多孔微球浸入50mlこ醇/水(1/1，v/v)混合溶劑中浸泡2—3h，以去除表面粘附的油脂和其它雜質(zhì)。用水充分漂洗并烘干后，浸入20ml 1-6己ニ胺濃度為O. 06g/ml異丙醇溶液中，37度下反應(yīng)5分鐘，用無水こ醇終止反應(yīng)，并用大量水充分漂洗以去除未反應(yīng)的己ニ胺。將胺解后的三維多孔微球浸入50ml濃度為lwt%的戊ニ醛溶液中24小時，然后利用大量去離子水清洗，大約浸泡24小時以保證徹底去除戊ニ醛。然后將支架浸入50ml殼聚糖生物活性大分子(2mg，こ酸PH=3. 5)的溶液中反應(yīng)24個小吋，反應(yīng)溫度為2 — 4°C。反應(yīng)完之后分別用I. O %的醋酸溶液和去離子水分別浸泡24小時以去除剰余的生物活性大分子。(3)干燥將反應(yīng)制備得到的活性多孔微球在冷凍干燥機(jī)中干燥24h，即完成活性多孔微球的制備。實(shí)施例6活性多孔微球的制備(I)多孔聚乳酸-羥基こ酸高分子微球制備將I. 25ml濃度為5%的NH4HCO3溶液(W1相)加入4ml濃度為3. 13%的聚乳酸-羥基こ酸高分子有機(jī)溶液中(O相)，然后在冰浴中用均質(zhì)攪拌機(jī)高速攪拌得到初乳液(W1A)),迅速將所得初乳液倒入400ml O. 1%的PVA水溶液中(W2相)，室溫下機(jī)械攪拌得到二次乳液(W1AVW2)，在二次乳化過程中有機(jī)溶劑揮發(fā)最終得到多孔聚乳酸-羥基こ酸高分子微球，去離子水反復(fù)沖洗所得微球，最后冷凍干燥得到所需的微球；(2)化學(xué)交聯(lián)將多孔微球浸入50mlこ醇/水(1/1，v/v)混合溶劑中浸泡2— 3h，以去除表面粘附的油脂和其它雜質(zhì)。用水充分漂洗并烘干后，浸入20ml 1-6己 ニ胺濃度為O. 06g/ml異丙醇溶液中，37度下反應(yīng)5分鐘，用無水こ醇終止反應(yīng)，并用大量水充分漂洗以去除未反應(yīng)的己ニ胺。將胺解后的三維多孔微球浸入50ml濃度為lwt%的戊ニ醛溶液中24小時，然后利用大量去離子水清洗，大約浸泡24小時以保證徹底去除戊ニ醛。然后將支架浸入50ml明膠生物活性大分子(2mg，こ酸PH=3. 8)的溶液中反應(yīng)24個小時，反應(yīng)溫度為2 — 4°C。反應(yīng)完之后分別用I. 0%的醋酸溶液和去離子水分別浸泡24小時以去除剰余的生物活性大分子。(3)干燥將反應(yīng)制備得到的活性多孔微球在冷凍干燥機(jī)中干燥24h，即完成活性多孔微球的制備。實(shí)施例7活性多孔微球的制備(I)多孔聚乳酸-羥基こ酸高分子微球制備將I. 25ml濃度為5%的NH4HCO3溶液(W1相)加入4ml濃度為3. 13%的聚乳酸-羥基こ酸高分子有機(jī)溶液中(O相)，然后在冰浴中用均質(zhì)攪拌機(jī)高速攪拌得到初乳液(W1A)),迅速將所得初乳液倒入400ml O. 1%的PVA水溶液中(W2相)，室溫下機(jī)械攪拌得到二次乳液(W1AVW2)，在二次乳化過程中有機(jī)溶劑揮發(fā)最終得到多孔聚乳酸-羥基こ酸高分子微球，去離子水反復(fù)沖洗所得微球，最后冷凍干燥得到所需的微球；(2)化學(xué)交聯(lián)將多孔微球浸入50mlこ醇/水(1/1，v/v)混合溶劑中浸泡2— 3h，以去除表面粘附的油脂和其它雜質(zhì)。用水充分漂洗并烘干后，浸入20ml 1-6己ニ胺濃度為O. 06g/ml異丙醇溶液中，37度下反應(yīng)5分鐘，用無水こ醇終止反應(yīng)，并用大量水充分漂洗以去除未反應(yīng)的己ニ胺。將胺解后的三維多孔微球浸入50ml濃度為lwt%的戊ニ醛溶液中24小時，然后利用大量去離子水清洗，大約浸泡24小時以保證徹底去除戊ニ醛。然后將支架浸入50ml ニ型膠原生物活性大分子(2mg，こ酸PH=3. 8)的溶液中反應(yīng)24個小時，反應(yīng)溫度為2 — 4°C。反應(yīng)完之后分別用I. 0%的醋酸溶液和去離子水分別浸泡24小時以去除剰余的生物活性大分子。(3)干燥將反應(yīng)制備得到的活性多孔微球在冷凍干燥機(jī)中干燥24h，即完成活性多孔微球的制備。實(shí)施例8活性多孔微球的制備(I)多孔聚乳酸-羥基こ酸高分子微球制備將I. 25ml濃度為5%的NH4HCO3溶液(W1相)加入4ml濃度為3. 13%的聚乳酸-羥基こ酸高分子有機(jī)溶液中(O相)，然后在冰浴中用均質(zhì)攪拌機(jī)高速攪拌得到初乳液(W1A)),迅速將所得初乳液倒入400ml O. 1%的PVA水溶液中(W2相)，室溫下機(jī)械攪拌得到二次乳液(W1AVW2)，在二次乳化過程中有機(jī)溶劑揮發(fā)最終得到多孔聚乳酸-羥基こ酸高分子微球，去離子水反復(fù)沖洗所得微球，最后冷凍干燥得到所需的微球；(2)化學(xué)交聯(lián)將多孔微球浸入50mlこ醇/水(1/1，v/v)混合溶劑中浸泡2— 3h，以去除表面粘附的油脂和其它雜質(zhì)。用水充分漂洗并烘干后，浸入20ml 1-6己ニ胺濃度為O. 06g/ml異丙醇溶液中，37度下反應(yīng)5分鐘，用無水こ醇終止反應(yīng)，并用大量水充分漂洗以去除未反應(yīng)的己ニ胺。將胺解后的三維多孔微球浸入50ml濃度為lwt%的戊ニ醛溶液中24小時，然后利用大量去離子水清洗，大約浸泡24小時以保證徹底去除戊ニ醛。然后將支架浸入50ml天然軟骨細(xì)胞外基質(zhì)生物活性大分子(2mg，こ酸PH=3. 8)的溶液中反應(yīng)24個小時，反應(yīng)溫度為2 — 4°C。反應(yīng)完之后分別用I. O %的醋 酸溶液和去離子水分別浸泡24小時以去除剰余的生物活性大分子。(3)干燥將反應(yīng)制備得到的活性多孔微球在冷凍干燥機(jī)中干燥24h，即完成活性多孔微球的制備。實(shí)施例9活性多孔微球用于軟骨細(xì)胞積聚(I)取一定量的活性多孔微球，75%的酒精浸泡兩個小時，然后在紫外燈的照射下滅菌半個小時，取一定量的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基浸泡活性多孔微球一晝夜，離心置于離心管中備用；(2)將軟骨細(xì)胞消化離心后，用密度為l，000，000cellS/ml的細(xì)胞懸浮液與一定量的活性多孔微球進(jìn)行共混培養(yǎng)；(3)共混培養(yǎng)兩周后通過FDA/PI染色后，用熒光共聚焦顯微鏡來觀測細(xì)胞積聚的狀態(tài)；(4)同時可以將積聚體植入到軟骨缺損模型中觀察軟骨再生的過程。
權(quán)利要求
1.一種生物活性多孔載體微球的制備方法，其特征在于，包括以下工藝步驟(O多孔聚酯類高分子微球制備將標(biāo)記為W1相的1-2. 5ml濃度為2. 5-10. 0wt%的 NH4HCO3溶液，加入2-10ml濃度為I. 0-6. 25wt%的脂肪族聚酯高分子有機(jī)溶液中，該高分子有機(jī)溶液標(biāo)記為O相，然后在冰浴中用均質(zhì)攪拌機(jī)高速攪拌得到初乳液，迅速將所得W1A) 相初乳液倒入100-400ml的O. lwt%的標(biāo)記為W2相的聚乙烯醇PVA水溶液中，室溫下機(jī)械攪拌得到W1AVW2相二次乳液，在二次乳化過程中有機(jī)溶劑揮發(fā)最終得到多孔高分子微球， 用去離子水反復(fù)沖洗所得微球，然后進(jìn)行冷凍干燥；(2)化學(xué)交聯(lián)將多孔微球浸入體積比為I: I的乙醇/水混合溶劑中浸泡2-3h， 以去除表面粘附的油脂和其它雜質(zhì)；用水充分漂洗并烘干后，浸入1，6-己二胺濃度為O.02-0. 10g/ml的異丙醇溶液中，37°C下反應(yīng)5_15分鐘，用無水乙醇終止反應(yīng)，并用去離子水充分漂洗以去除未反應(yīng)的己二胺；將胺解后的三維多孔支架浸入濃度為lwt%的戊二醛溶液中24小時，然后利用去離子水清洗，浸泡24小時以保證徹底去除戊二醛；將多孔微球浸入不同生物活性大分子的乙酸溶液中，溶液中生物活性大分子含量為2-10mg/ ml, pH=3. 5，反應(yīng)24h，反應(yīng)溫度2_4°C ;反應(yīng)結(jié)束后用I. Owt %的醋酸溶液和去離子水分別浸泡24h以去除剩余的生物活性大分子；(3)干燥將反應(yīng)制備得到的活性多孔微球在冷凍干燥機(jī)中干燥24h，即完成生物活性多孔載體微球的制備。
2.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)的脂肪族聚酯高分子有機(jī)溶液中，所使用的脂肪族聚酯高分子材料為聚羥基乙酸、聚乳酸、聚乙醇酸中一種或從中選取幾種進(jìn)行復(fù)配。
3.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)的脂肪族聚酯高分子有機(jī)溶液中，所使用的溶劑為二氯甲烷。
4.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所使用的生物活性大分子選自明膠、二型膠原、RGD、殼聚糖、硫酸軟骨素、天然軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的活性成分。
5.一種生物活性多孔載體微球，其采用權(quán)利要求1-4所述任一制備方法制備得到。
6.一種權(quán)利要求5所述的生物活性多孔載體微球在定向調(diào)控軟骨細(xì)胞積聚中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種能夠調(diào)控軟骨細(xì)胞定向積聚的生物活性的多孔微球支架材料及其制備方法。其可應(yīng)用于胚胎發(fā)育過程軟骨細(xì)胞積聚、臨床中軟骨缺損修復(fù)過程中的代替物及構(gòu)建軟骨組織修復(fù)等領(lǐng)域的生物活性支架材料。該方法采用多孔聚酯類高分子微球制備-化學(xué)交聯(lián)-干燥步驟完成活性多孔微球的制備。制備得到的微球具有良好的生物相容性和降解性、合理的理化性質(zhì)和微觀拓?fù)湫蚊?、連通性良好的多孔結(jié)構(gòu)以及由內(nèi)向外的生物活性因子濃度梯度，從而能夠在體外調(diào)控軟骨定向積聚，為軟骨細(xì)胞的體外功能表達(dá)提供良好的載體，同時為組織工程化軟骨提供一種良好的生物支架材料。
文檔編號C08L67/00GK102690436SQ20121019073
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月11日
發(fā)明者李超, 葛子鋼 申請人:北京大學(xué)