專利名稱：一種美味牛肝菌菌體中水溶性活性多糖的制備方法及應(yīng)用的制作方法
一種美味牛肝菌菌體中水溶性活性多糖的制備方法及應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物工程與技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種美味牛肝菌菌體中水溶性活性多糖的制備方法。還涉及一種美味牛肝菌多糖在抗菌中的用途，多糖可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等工業(yè)上做抗菌劑的原料。
背景技術(shù)：
美味牛肝菌又稱大腳菇、白牛肝菌，是擔(dān)子菌亞門，層菌綱，傘菌目，牛肝菌科的一種，主要分布于我國河南、臺(tái)灣、黑龍江、四川、貴州、云南、西藏、內(nèi)蒙古、福建等地區(qū)。是一種可食用真菌，其營養(yǎng)物質(zhì)豐富，含有多種維生素，氨基酸，多糖和礦物質(zhì)。該菌具有降血脂，提高免疫力等功效。此外，其水提物對(duì)小白鼠肉瘤S-180的抑制率為100%，對(duì)艾氏腹水癌的抑制率為90%。目前部分研究集中在馴化菌種和人工栽培子實(shí)體，但由于人工栽培技術(shù)不足，加上栽培困難，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，易受季節(jié)控制。使得其子實(shí)體活性物質(zhì)產(chǎn)量低，難以推廣。而采用深層發(fā)酵制備菌絲體可以克服以上不足。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種美味牛肝菌菌體中水溶性活性多糖的制備方法， 方法易行，操作簡(jiǎn)便，低溫、短時(shí)、高效，制取的多糖具有較好的抗菌性。
現(xiàn)有的具有抗菌性的多糖多為從植物中所提取的如香菇子實(shí)體，紫莖澤蘭，烏飯樹樹葉，山莓葉，蒲公英，微藻等中提取多糖。與這些植物多糖相比，本發(fā)明通過發(fā)酵法得到的多糖具有周期短、方便生產(chǎn)、不受季節(jié)限制等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種美味牛肝菌菌體中水溶性活性多糖在制備治療或預(yù)防細(xì)菌藥物中的應(yīng)用，其主要優(yōu)點(diǎn)在于該多糖是一種可食用可藥用的水溶性多糖。
一種美味牛肝菌菌體中水溶性活性多糖的制備方法，其步驟是
美味牛肝菌菌體的制備方法
方法A
(1)將美味牛肝菌(編號(hào)ACCC50559，由中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心提供)接種于固體斜面培養(yǎng)基，于25°C恒溫培養(yǎng)6天，得到斜面種子。固體斜面培養(yǎng)基為(％)馬鈴薯18-24，葡萄糖1.0-3.0，酵母粉1.0-2.0，瓊脂1. 5-2. 5，蛋白胨0. 4-0. 6，磷酸二氫鉀0.05-0. 15，七水硫酸鋅 0. 03-0. 07。
(2)取培養(yǎng)后的斜面4-5環(huán)(用接種環(huán)在斜面上取菌種4-5環(huán))接種到一級(jí)液體種子培養(yǎng)基，在250ml三角瓶，裝液量為IOOml，加10顆玻璃珠，于120r/min，25°C培養(yǎng)60小時(shí)。所述的培養(yǎng)基中各組分及其含量分別為(％)馬鈴薯18-24，葡萄糖1.0-3.0，酵母粉1.0-2. 0，瓊脂 1. 5-2. 5，蛋白胨 0. 4-0. 6，磷酸二氫鉀 0. 05-0. 15，七水硫酸鋅 0. 03-0. 07。
(3)將培養(yǎng)60h后的一級(jí)液體種子按10%的接種量接種到二級(jí)液體種子，在250ml 三角瓶，裝液量為100ml，加10顆玻璃珠，于^°C，150r/min培養(yǎng)40h。所述的培養(yǎng)基與一級(jí)液體種子相同。
(4)將培養(yǎng)40h后的二級(jí)液體種子按5%的接種量接種發(fā)酵，在250ml三角瓶，裝液量為100!111，于觀1，1801·/!^!!培養(yǎng)98h。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(％ ):馬鈴薯8_12， 蔗糖1-3，蛋白胨0. 4-0. 8，磷酸二氫鉀0. 2-0. 4，七水硫酸鎂0. 1-0. 3，碳酸鈣0. 1-0. 3。
(5)將菌絲體與發(fā)酵液分離，清水沖凈，于50°C烘干后研磨得到菌絲體干粉。以上培養(yǎng)基PH均為自然pH。
方法B
步驟(1)-(3)與方法A中(1)-(3)相同
(4)將培養(yǎng)40h后的二級(jí)液體種子按5%的接種量接種發(fā)酵，在250ml三角瓶， 裝液量為100!111，于觀1，1801·/!^!!培養(yǎng)98h。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(％):酵母膏 0. 8-1. 2，蛋白胨 1. 8-2. 2，葡萄糖 1. 8-2. 2。
(5)將菌絲體與發(fā)酵液分離，清水沖凈，于50°C烘干后研磨得到菌絲體干粉。以上培養(yǎng)基PH均為自然pH。
美味牛肝菌提取方法
方法A
(1)將美味牛肝菌菌絲體磨碎，加入去離子水進(jìn)行超聲，濃縮液體，加入乙醇沉淀收集美味牛肝菌多糖粗沉淀物；
(2)美味牛肝菌粗多糖沉淀物用水溶解，再用sevag法反復(fù)除去游離的蛋白質(zhì)，直到檢測(cè)不到蛋白質(zhì)，濃縮，用乙醇沉淀，得到去蛋白后的美味牛肝菌多糖沉淀物；
(3)去蛋白后的美味牛肝菌多糖沉淀物經(jīng)透析的方法分離，除去小分子雜質(zhì)，得到多糖分子量在2500-8000道爾頓之間的美味牛肝菌多糖精制提取液，濃縮，加入乙醇沉淀， 得到精制沉淀物
(4)美味牛肝菌多糖精制沉淀物經(jīng)干燥得到美味牛肝菌多糖精制提取物；
方法B
(1)將美味牛肝菌菌絲體磨碎，加入去離子水進(jìn)行浸提，濃縮液體，加入乙醇沉淀收集美味牛肝菌多糖粗沉淀物；
(2)美味牛肝菌粗多糖沉淀物用水溶解，再用sevag法反復(fù)除去游離的蛋白質(zhì)，直到檢測(cè)不到蛋白質(zhì)，濃縮，用乙醇沉淀，得到去蛋白后的美味牛肝菌多糖沉淀物；
(3)去蛋白后的美味牛肝菌多糖沉淀物經(jīng)透析的方法分離，除去小分子雜質(zhì)，得到多糖分子量在2500-8000道爾頓之間的美味牛肝菌多糖精制提取液，濃縮，加入乙醇沉淀， 得到精制沉淀物。
(4)美味牛肝菌多糖精制沉淀物經(jīng)干燥得到美味牛肝菌多糖精制提取物；
美味牛肝菌提取方法中
所述方法AB中醇析沉淀使用的醇為75% _95%的醇，醇的用量為濃縮液的2_4倍體積量，所述的醇為乙醇。
所述方法AB中的濃縮為將提取液濃縮至原體積的1/2-1/4，濃縮采用在50_55°C， 0. 08-0. 09MPa下的減壓濃縮。
所述方法AB中使用sevag法除去蛋白質(zhì)的具體方法為=Sevag溶液為三氯乙酸和正丁醇按體積比5 1混合，sevag溶液和粗多糖溶液按體積比1 2混合，震搖20min，去除蛋白沉淀，反復(fù)進(jìn)行3-7次。
所述干燥為加熱恒溫干燥。
通過上述方法制備的一種美味牛肝菌菌體中水溶性活性多糖在制備治療或預(yù)防細(xì)菌藥物中的應(yīng)用，美味牛肝菌多糖在抑制細(xì)菌方面有較好的效果。所述細(xì)菌為金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)、大腸埃希菌(Escherichia coli)、枯草芽孢肝菌(Bacillus subtilis)、腸道沙門氏菌(Salmonella enterica)、巨大芽孢桿菌 (Bacillus magaterium)肺炎雙球桿菌(Pneumococcus)在抗菌的用途中，美味牛肝菌多糖的用量為l-10mg/ml。
采用本發(fā)明方法得到的美味牛肝菌多糖呈乳白色，溶于熱水。
由上述方法所制得的美味牛肝菌多糖進(jìn)行以下抗菌實(shí)驗(yàn)具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
—種美味牛肝菌菌體中水溶性活性多糖的制備方法，其步驟是
A將美味牛肝菌(編號(hào)ACCC50559，由中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心提供)接種于固體斜面培養(yǎng)基，于25°C恒溫培養(yǎng)6天，得到斜面種子。固體斜面培養(yǎng)基為(％):馬鈴薯 20，葡萄糖2. 0，酵母粉1. 4，瓊脂2，蛋白胨0. 6，磷酸二氫甲0. 1，七水硫酸鋅0. 05。
B 取培養(yǎng)后的斜面4-5環(huán)接種到一級(jí)液體種子培養(yǎng)基，在250ml三角瓶，裝液量為100ml，加10顆玻璃珠，于120r/min，25°C培養(yǎng)60小時(shí)。所述的培養(yǎng)基中各組分及其含量分別為(％ )馬鈴薯20，葡萄糖2. 0，酵母粉1. 4，蛋白胨0. 6，磷酸二氫甲0. 1，七水硫酸鋅 0. 05。
C將培養(yǎng)60h后的一級(jí)液體種子按10%的接種量接種到二級(jí)液體種子，在250ml 三角瓶，裝液量為100ml，加10顆玻璃珠，于^°C，150r/min培養(yǎng)40h。所述的培養(yǎng)基與一級(jí)液體種子相同。
D將培養(yǎng)40h后的二級(jí)液體種子按5%的接種量接種到IOL發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐裝料系數(shù)為0. 7，罐壓為0. 04或0. 05或0. 06或0. 07MPa。于，180r/min培養(yǎng)72h后放罐。所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(％):馬鈴薯10，蔗糖2，蛋白胨0.6，磷酸二氫鉀0.3，七水硫酸鎂0.2，碳酸鈣0.2。
E將菌絲體與發(fā)酵液分離，清水沖凈，于50°C烘干后研磨得到菌絲體干粉。
F取粉碎的美味牛肝菌菌絲體適量，加入50倍量的去離子水，在53或M或55或 56°C超聲8. 5min。重復(fù)3次，合并3次提取液，將提取液在7000rpm下離心8min。濾液在減壓(0. 08-0. 09MPa)濃縮至原體積的1/3，攪拌下向濃縮提取液中加入3倍體積95% (ν/ν)乙醇，將濃縮提取液中的多糖沉淀出，收集美味牛肝菌菌絲體多糖粗沉淀物；向多糖粗沉淀物中加入去離子水溶解，使之充分復(fù)溶，用sevag法去蛋白，重復(fù)進(jìn)行，直到檢測(cè)不出蛋白質(zhì)。減壓濃縮后，加入3倍體積95% (ν/ν)乙醇沉淀，沉淀用乙醇洗滌，得到去蛋白后的美味牛肝菌多糖沉淀物，將多糖沉淀溶于水，用去離子水透析，得到分子量在3000-8000 道爾頓之間的美味牛肝菌多糖精制液，在攪拌下再加入3倍體積95% (ν/ν)乙醇沉淀，靜置析出沉淀，干燥得到美味牛肝菌精制多糖固體，該多糖顏色為乳白色。
以上培養(yǎng)基ρΗ均為自然ρΗ (ρΗ6-7)。
實(shí)施例2
—種美味牛肝菌菌體中水溶性活性多糖的制備方法，其步驟是
實(shí)施例2步驟A-E與實(shí)施例1中步驟A-E相同
F取粉碎的美味牛肝菌菌絲體適量，加入50倍量的去離子水，在53或M或55或 56°C浸提2h。重復(fù)3次，合并3次提取液，將提取液在7000rpm下離心8min。濾液在減壓(0. 08-0. 09MPa)濃縮至原體積的1/3，攪拌下向濃縮提取液中加入3倍體積95% (ν/ν) 乙醇，將濃縮提取液中的多糖沉淀出，收集美味牛肝菌菌絲體多糖粗沉淀物；向多糖粗沉淀物中加入去離子水溶解，使之充分復(fù)溶，用sevag法去蛋白，重復(fù)進(jìn)行，直到檢測(cè)不出蛋白質(zhì)。減壓濃縮后，加入3倍體積95% (ν/ν)乙醇沉淀，沉淀用乙醇洗滌，得到去蛋白后的美味牛肝菌多糖沉淀物，將多糖沉淀溶于水，用去離子水透析，得到分子量在3000-8000道爾頓之間的美味牛肝菌多糖精制液，在攪拌下再加入3倍體積95% (ν/ν)乙醇沉淀，靜置析出沉淀，干燥得到美味牛肝菌精制多糖固體，該多糖顏色為乳白色。
以上培養(yǎng)基ρΗ均為自然ρΗ (ρΗ6-7)。
實(shí)施例3
一種美味牛肝菌菌體中水溶性活性多糖的制備方法，其步驟是
實(shí)施例3步驟A-C與實(shí)施例1中步驟A-C相同
D將培養(yǎng)40h后的二級(jí)液體種子按5%的接種量接種到250mL三角瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)72h，裝液量為100ml，溫度為^°C，轉(zhuǎn)速為180r/min。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(％ ) 酵母膏1，蛋白胨2，葡萄糖2。
E將菌絲體與發(fā)酵液分離，清水沖凈，于50°C烘干后研磨得到菌絲體干粉。
F 取粉碎的美味牛肝菌菌絲體適量，加入50倍量的去離子水，在52或53或M 或55或56°C超聲8. 5min。重復(fù)3次，合并3次提取液，將提取液在7000rpm下離心8min。 濾液在減壓(0. 08-0. 09MPa)濃縮至原體積的1/3，攪拌下向濃縮提取液中加入3倍體積95% (ν/ν)乙醇，將濃縮提取液中的多糖沉淀出，收集美味牛肝菌菌絲體多糖粗沉淀物；向多糖粗沉淀物中加入去離子水溶解，使之充分復(fù)溶，用sevag法去蛋白，重復(fù)進(jìn)行，直到檢測(cè)不出蛋白質(zhì)。減壓濃縮后，加入3倍體積95% (ν/ν)乙醇沉淀，沉淀用乙醇洗滌，得到去蛋白后的美味牛肝菌多糖沉淀物，將多糖沉淀溶于水，用去離子水透析，得到分子量在 3000-8000道爾頓之間的美味牛肝菌多糖精制液，在攪拌下再加入3倍體積95% (ν/ν)乙醇沉淀，靜置析出沉淀，干燥得到美味牛肝菌精制多糖固體，該多糖顏色為乳白色。
以上培養(yǎng)基ρΗ均為自然ρΗ (ρΗ6-7)。
實(shí)施例4
一種美味牛肝菌菌體中水溶性活性多糖的制備方法，其步驟是
實(shí)施例4步驟A-C與實(shí)施例1中步驟A-C相同
D將培養(yǎng)40h后的二級(jí)液體種子按5%的接種量接種到250mL三角瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)72h，裝液量為100ml，溫度為^°C，轉(zhuǎn)速為180r/min。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為(％ ) 酵母膏1，蛋白胨2，葡萄糖2。
E將菌絲體與發(fā)酵液分離，清水沖凈，于50°C烘干后研磨得到菌絲體干粉。
F取粉碎的美味牛肝菌菌絲體適量，加入50倍量的去離子水，在52或53或討或 55或56°C浸提池。重復(fù)3次，合并3次提取液，將提取液在7000rpm下離心8min。濾液在減壓(0. 08-0. 09MPa)濃縮至原體積的1/3，攪拌下向濃縮提取液中加入3倍體積95%(ν/ν)乙醇，將濃縮提取液中的多糖沉淀出，收集美味牛肝菌菌絲體多糖粗沉淀物；向多糖粗沉淀物中加入去離子水溶解，使之充分復(fù)溶，用sevag法去蛋白，重復(fù)進(jìn)行，直到檢測(cè)不出蛋白質(zhì)。減壓濃縮后，加入3倍體積95% (ν/ν)乙醇沉淀，沉淀用乙醇洗滌，得到去蛋白后的美味牛肝菌多糖沉淀物，將多糖沉淀溶于水，用去離子水透析，得到分子量在3000-8000 道爾頓之間的美味牛肝菌多糖精制液，在攪拌下再加入3倍體積95% (ν/ν)乙醇沉淀，靜置析出沉淀，干燥得到美味牛肝菌精制多糖固體，該多糖顏色為乳白色。
將上述實(shí)施例1-4所得的多糖進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)
方法利用打孔器將濾紙制成直徑為6mm的圓形紙片，121°0,30πι η滅菌備用，利用去離子水將美味牛肝菌多糖分別配制成l、2、4、8、10mg/ml的溶液，濾膜除菌備用，以不加多糖為空白對(duì)照。用移液槍分別吸取0.2ml各種菌懸液到平皿培養(yǎng)基上，涂布均勻。將濾紙片分別在各濃度的美味牛肝菌多糖溶液中浸泡lOmin，取出晾干5min后貼在各濃度的平皿培養(yǎng)基上，每個(gè)平皿中貼3個(gè)。再置于恒溫培養(yǎng)箱中，細(xì)菌于37°C培養(yǎng)Mh。取出后測(cè)量其抑菌圈直徑，計(jì)算其平均值。其多糖的抗菌性見表1:
本發(fā)明的美味牛肝菌多糖的制備方法和用途已通過具體的實(shí)施例進(jìn)行了描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可借鑒本發(fā)明的內(nèi)容適當(dāng)改變工藝條件來實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的其它目的，都被視為在本發(fā)明之內(nèi)。
本發(fā)明美味牛肝菌多糖的測(cè)定方法如下
準(zhǔn)確稱取IOOmg分析純葡萄糖(預(yù)先在105°C烘干到恒重)置于小燒杯中，用少量去離子水溶解后定量轉(zhuǎn)移到IOOml的容量瓶中，以去離子水定容至刻度，搖勻，其濃度為 lmg/ml。吸取該溶液10ml，用去離子水稀釋至100ml，即為0. lmg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0、1. 2ml，補(bǔ)水至^iil，加入5%苯酚溶液1ml，混勻，迅速加入濃硫酸5ml，25°C保溫25min，冷卻后490nm比色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取美味牛肝菌多糖樣品，按標(biāo)準(zhǔn)液配制的方法配制樣品液，測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。
表1美味牛肝菌多糖對(duì)各種菌的抑制作用
權(quán)利要求
1.一種美味牛肝菌菌體中水溶性活性多糖的制備方法，其步驟是(1)將美味牛肝菌接種于固體斜面培養(yǎng)基，于25°c恒溫培養(yǎng)6天，得到斜面種子，固體斜面培養(yǎng)基為％ 馬鈴薯18-24，葡萄糖1. 0-3. 0，酵母粉1. 0-2. 0，瓊脂1. 5-2. 5，蛋白胨0.4-0. 6，磷酸二氫鉀 0. 05-0. 15，七水硫酸鋅 0. 03-0. 07 ；(2)取培養(yǎng)后的斜面4-5環(huán)接種到一級(jí)液體種子培養(yǎng)基，在250ml三角瓶，裝液量為 100ml，加10顆玻璃珠，于120r/min，25°C培養(yǎng)60小時(shí)，所述的培養(yǎng)基中各組分及其含量分別為％ 馬鈴薯18-24，葡萄糖1. 0-3. 0，酵母粉1. 0-2. 0，瓊脂1. 5-2. 5，蛋白胨0. 4-0. 6，磷酸二氫鉀0. 05-0. 15，七水硫酸鋅0. 03-0. 07 ；(3)將培養(yǎng)60h后的一級(jí)液體種子按10%的接種量接種到二級(jí)液體種子，在250ml三角瓶，裝液量為IOOml，加10顆玻璃珠，于，150r/min培養(yǎng)40h，所述的培養(yǎng)基與一級(jí)液體種子相同；(4)將培養(yǎng)40h后的二級(jí)液體種子按5%的接種量接種發(fā)酵，在250ml三角瓶，裝液量為100ml，于，180r/min培養(yǎng)98h，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為％ 馬鈴薯8_12，蔗糖1_3， 蛋白胨0. 4-0. 8，磷酸二氫鉀0. 2-0. 4，七水硫酸鎂0. 1-0. 3，碳酸鈣0. 1-0. 3，或?qū)⑴囵B(yǎng)40h 后的二級(jí)液體種子按5%的接種量接種發(fā)酵，在250ml三角瓶，裝液量為100ml，于^°C， 180r/min培養(yǎng)98h，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為％ 酵母膏0. 8-1. 2，蛋白胨1. 8-2. 2，葡萄糖1.8-2. 2 ；(5)將菌絲體與發(fā)酵液分離，清水沖凈，于50°C烘干后研磨得到菌絲體干粉；(6)將菌絲體干粉加入去離子水40-70°C進(jìn)行浸提或加入去離子水40-70°C進(jìn)行超聲浸提，濃縮液體，加入乙醇沉淀收集美味牛肝菌多糖粗沉淀物；美味牛肝菌粗多糖沉淀物用水溶解，再用sevag法反復(fù)除去游離的蛋白質(zhì)，濃縮，用乙醇沉淀，沉淀物干燥得到去蛋白后的美味牛肝菌胞內(nèi)多糖沉淀物。
2.權(quán)利要求1所述的一種美味牛肝菌水溶性胞內(nèi)多糖在制備治療或預(yù)防細(xì)菌藥物中的應(yīng)用，所述的細(xì)菌為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢肝菌、腸道沙門氏菌、巨大芽孢桿菌、肺炎雙球桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種美味牛肝菌水溶性胞內(nèi)多糖在制備治療或預(yù)防細(xì)菌藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的細(xì)菌藥物中的應(yīng)用中美味牛肝菌多糖溶液的濃度為 1. 0-10. Omg/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種美味牛肝菌菌體中水溶性活性多糖的制備方法及應(yīng)用，其制備步驟為其步驟是(1)將美味牛肝菌接種于固體斜面培養(yǎng)基，得到斜面種子；(2)取培養(yǎng)后的斜面接種到一級(jí)液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(3)將培養(yǎng)的一級(jí)液體種子接種到二級(jí)液體種子中培養(yǎng)；(4)將培養(yǎng)的二級(jí)液體種子接種發(fā)酵；(5)將菌絲體與發(fā)酵液分離，得到菌絲體干粉；(6)將菌絲體干粉進(jìn)行超聲浸提，濃縮液體，收集美味牛肝菌多糖粗沉淀物；美味牛肝菌粗多糖沉淀物用水溶解，除去游離的蛋白質(zhì)，濃縮，用乙醇沉淀，沉淀物干燥得到去蛋白后的美味牛肝菌胞內(nèi)多糖沉淀物，所述的一種美味牛肝菌水溶性胞內(nèi)多糖在制備治療或預(yù)防細(xì)菌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明方法易行，操作簡(jiǎn)便，低溫、短時(shí)、高效，制取的多糖具有較好的抗菌性。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102517354SQ20111043710
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者張華山, 王偉平, 陳維 申請(qǐng)人:湖北工業(yè)大學(xué)