專利名稱：一種利用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸鈉的微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種利用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸是一種廣泛存在于動(dòng)物結(jié)締組織和某些微生物莢膜中，具有獨(dú)特分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的大分子酸性粘多糖，因其很高的粘彈性和極強(qiáng)的保水性，可以起到諸如潤滑關(guān)節(jié)，調(diào)節(jié)血管壁的通透性，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、水、電解質(zhì)擴(kuò)散及運(yùn)轉(zhuǎn)，促進(jìn)創(chuàng)傷愈合以及改善皮膚營養(yǎng)代謝，使皮膚柔嫩、光滑、去皺、增加彈性、防止衰老等作用，目前已被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、制藥及化妝品工業(yè)。早期透明質(zhì)酸是以動(dòng)物組織如人臍帶、雞冠、牛眼玻璃體等為原料，經(jīng)提取、除雜、沉淀和分級(jí)分離后制得的，這種方法因原材料來源有限，分離純化復(fù)雜、成本高昂而逐漸被微生物發(fā)酵法所代替。后者具有產(chǎn)量不受動(dòng)物原料資源限制，成本較低，分離純化工藝簡捷，易于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。但是野生的透明質(zhì)酸生產(chǎn)菌株普遍產(chǎn)量較低，由此造成的高成本問題使其不適用于規(guī)?；a(chǎn)，為此，我們綜合采用了多種誘變選育方法對(duì)一株野生菌進(jìn)行了優(yōu)選，最終得到了一株高產(chǎn)菌，其產(chǎn)量最高可達(dá)10g/L，由此大大降低了生產(chǎn)成本。后續(xù)的分離純化工藝較之采用離子交換等方法來說大為簡捷，提高了分離效率，最高收率可達(dá) 80%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種通過對(duì)菌體的改造使其在優(yōu)化后的條件下高表達(dá)量的發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸，并運(yùn)用過濾、吸附、絡(luò)合等分離純化技術(shù)將目的產(chǎn)物與發(fā)酵液分離，最終制成滿足市場需求的合格產(chǎn)品。使用本發(fā)明生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉可大幅度提高生物表達(dá)量，有效的降低生產(chǎn)成本，從而取得較好的市場收益的利用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)工藝。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):一種利用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)工藝，包括以下步驟:(1)以馬鏈球菌獸疫亞種為出發(fā)菌，經(jīng)過亞硝基胍誘變及原生質(zhì)體紫外誘變，選育得到不產(chǎn)β-溶血素及透明質(zhì)酸酶且產(chǎn)透明質(zhì)酸能力大大提高的遺傳特性穩(wěn)定的突變株，將其在斜面種子培養(yǎng)基上于32 38°C的溫度培養(yǎng)18 24h后，接種至一級(jí)種子培養(yǎng)基中；(2)將培養(yǎng)好的一級(jí)種子培養(yǎng)液接種至二級(jí)種子培養(yǎng)液中，于32 38°C下培養(yǎng)6 12h至該培養(yǎng)液中的菌群處于指數(shù)生長期的前期；(3)將培養(yǎng)好的種子液接種至營養(yǎng)度較高的發(fā)酵培養(yǎng)基中，使菌體在下列條件下進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn):采用補(bǔ)料分批發(fā)酵，發(fā)酵液PH為5.0 9.0，溫度為32 38°C，攪拌轉(zhuǎn)速150 600rev/min，通氣量 1.0 15.0vvm，培養(yǎng)時(shí)間 18 24h ；(4)結(jié)束發(fā)酵，將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至提取儲(chǔ)罐中，邊攪拌邊用20%三氯乙酸調(diào)pH值至3.0，靜置過夜，用板框進(jìn)行過濾并收集濾出液，然后用去離子水調(diào)節(jié)溶液中透明質(zhì)酸的含量約為5g/L，測定該溶液的pH值，用2N的NaOH溶液將該溶液的pH調(diào)節(jié)至6.0 9.0 ;(5)以10 100g/L的添加量加入特定型號(hào)的硅藻土并攪拌2h，用不銹鋼板框進(jìn)行過濾,收集濾出液；(6)將另一種特定型號(hào)的硅藻土按照10 100g/L的添加量加入到上述濾出液中，攪拌2h，用不銹鋼板框過濾，并收集濾出液；(7)將I 10g/L的活性炭加入上述濾出液中，攪拌2h后用板框過濾并收集濾出液；(8)取樣測定單位體積的濾出液中透明質(zhì)酸的含量，然后按照2: 1(質(zhì)量比)的比例添加一定濃度的氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液，邊加邊攪拌，全部加完后，繼續(xù)攪拌2h ；(9)將上述混懸液進(jìn)行板框過濾并得到沉淀；(10)配置0.2 1.0mol/L的NaCl溶液，然后將上述沉淀用該氯化鈉溶液溶解，溶解過程要不斷攪拌，以加速溶解速率；(11)將上述完全溶解后的溶液加入I 10g/L濃度的活性炭，攪拌2h后板框過濾并收集濾出液；(12)將上述濾出液通過孔徑為0.22 μ m的濾膜過濾除菌，收集濾出液；(13)往上述濾出液中加入2 3倍體積的95%乙醇溶液，攪拌使原溶液中的透明質(zhì)酸沉淀出來，至不再有沉淀產(chǎn)生時(shí)進(jìn)行板框過濾，收集沉淀至潔凈容器中，用95%乙醇洗2 3次，然后將沉淀放置于真空干燥箱內(nèi)進(jìn)行干燥；

(14)收集干燥后的產(chǎn)品并進(jìn)行粉碎即得到最終的產(chǎn)品透明質(zhì)酸鈉。步驟(I)中的選育方法為:以一株馬鏈球菌獸疫亞種為出發(fā)菌株，采用在平板培養(yǎng)基中添加I 10%無菌綿羊血或0.01 0.1 %透明質(zhì)酸鈉的篩選手段，經(jīng)過亞硝基胍誘變及原生質(zhì)體紫外誘變育種技術(shù)，篩選得到表達(dá)量高、不產(chǎn)β-溶血素及透明質(zhì)酸酶且遺傳特性穩(wěn)定的突變菌株。步驟(I)中馬鏈球菌獸疫亞種的突變株的選育方法為:(I)按照下述方法配制血瓊脂平板培養(yǎng)基:稱量葡萄糖5.0g，牛肉膏10g，酵母粉5g, MgSO4L Og,瓊脂20g,加水1L,高溫高壓滅菌后,冷卻至45°C時(shí)加入20ml無菌綿羊血,混合均勻，放置于45 °C水浴中，備用。(2)對(duì)出發(fā)菌馬鏈球菌獸疫亞種進(jìn)行亞硝基胍誘變:將斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后的新鮮菌種接種至液體種子培養(yǎng)基中，于32°C下震蕩培養(yǎng)12h，將該液體培養(yǎng)液離心后丟棄上清，得到的菌體沉淀物用無菌生理鹽水懸浮，并用脫脂棉過濾，適當(dāng)稀釋制得IO8個(gè)/ml的菌懸液，得到的菌懸液置于小三角燒瓶中，并加入200μ g/ml的亞硝基胍溶液，混勻后于32°C下震蕩培養(yǎng)30min，然后用稀釋法終止反應(yīng)，并將誘變后的菌液加入液體培養(yǎng)基中于32°C下震蕩培養(yǎng)lh，取Iml經(jīng)過中間培養(yǎng)的菌液加入上述血瓊脂平板培養(yǎng)基中，混勻后傾倒入平皿中，培養(yǎng)48h，挑取平板上不產(chǎn)生透明圈的單菌落進(jìn)行保藏，得到不產(chǎn)β -溶血素的突變株。(3)配制與(I)中所述成分相同的平板培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌后，加入無菌透明質(zhì)酸鈉使其濃度為0.02%，但不加入綿羊血，放入45°C水浴中，備用。
(4)按照(2)中所述方法取不產(chǎn)β_溶血素的突變株作為出發(fā)菌制備菌懸液并用亞硝基胍處理，然后取經(jīng)過中間培養(yǎng)Ih的菌液Iml加入(3)中所述的平板培養(yǎng)基中，混勻后傾倒入平皿中，培養(yǎng)48h后，將I %濃度的無菌氯化十六烷基吡啶溶液均勻的倒在平板上，放置IOmin后，挑取平板上菌落周圍有渾濁帶的單菌落進(jìn)行保藏，得到既不產(chǎn)β-溶血素同時(shí)也不產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的突變株。(5)取(4)中所述得到的突變菌株作為出發(fā)菌，進(jìn)行原生質(zhì)體紫外誘變選育高產(chǎn)透明質(zhì)酸的變異株。原生質(zhì)體制備與再生的最佳條件為:將出發(fā)菌用液體種子培養(yǎng)基培養(yǎng)Ilh后離心得到菌體，加入高滲緩沖液溶解的蝸牛酶及纖維素酶，在35°C恒溫處理lh，離心，用高滲緩沖液洗滌得到原生質(zhì)體懸液，在15w紫外燈下，于30cm處，照射300s，然后將處理過的菌液混入軟瓊脂再生培養(yǎng)基，傾倒至再生培養(yǎng)基平板上。培養(yǎng)48h后，以出發(fā)菌作為對(duì)照組，挑取平板上長勢良好，粘性大且菌落大于對(duì)照組菌的單菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，于32°C振蕩培養(yǎng)24h后，測定發(fā)酵液中的透明質(zhì)酸含量。上述軟瓊脂再生培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖5.0g，牛肉膏10g，酵母粉5g，MgSO4L Og,瓊脂4g,加水IL ;再生培養(yǎng)基的成分為；葡萄糖5.0g,牛肉膏IOg,酵母粉5g,MgSO4LOg,瓊脂 20g，加水 IL0可以反復(fù)進(jìn)行紫外誘變選育，以期得到產(chǎn)量更高的正突變菌株。我們共進(jìn)行了 6次紫外誘變，最終得到一株既不產(chǎn)生溶血素同時(shí)也不產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶的高產(chǎn)菌SY-121，經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)，最終發(fā)酵液中透明質(zhì)酸的濃度為10g/L。經(jīng)過10次傳代培養(yǎng)，產(chǎn)透明質(zhì)酸能力沒有下降。所述的斜面種子培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖1.0 10g/L,牛肉膏10 50g/L,酵母粉 5 15g/L, Na2HPO4 0.5 2.0g/L, MgSO4 0.2 1.0g/L。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:葡萄糖10 70g/L，酵母粉10 50g/L，Na2HPO4I 5g/L，MgSO4 I 5g/L，消泡劑 0.5 1.5g/L。所述的補(bǔ)料分批發(fā)酵是將總糖為70g/L，初糖為10g/L，剩余的葡萄糖按照1:3:5: 7的量分四次分別于發(fā)酵的第8h，9h，10h，14h添加到發(fā)酵液中，發(fā)酵過程中不斷調(diào)節(jié)進(jìn)氣量及攪拌轉(zhuǎn)速，使發(fā)酵液的溶氧維持在10 70%的范圍內(nèi)，攪拌轉(zhuǎn)速不可大于600rev/mino步驟(5)中所述的特定型號(hào)的硅藻土為型號(hào)為⑶10的硅藻土。步驟(6)中所述的特定型號(hào)的硅藻土為型號(hào)為⑶3的硅藻土。步驟(7)中所述的活性炭為針形活性炭。步驟(8)中所述的一定濃度的氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液是將CPC溶于去離子水得到濃度為100g/L的溶液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方法，通過小試、中試，已建立起一套成熟的生產(chǎn)工藝，可以用于規(guī)?；a(chǎn)，最后制得的產(chǎn)品符合國際通用標(biāo)準(zhǔn)，滿足市場需求。具體的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可達(dá)到:
權(quán)利要求
1.一種利用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)工藝，其特征在于，該工藝包括以下步驟: (1)以馬鏈球菌獸疫亞種為出發(fā)菌，經(jīng)過亞硝基胍誘變及原生質(zhì)體紫外誘變，選育得到不產(chǎn)β-溶血素及透明質(zhì)酸酶且產(chǎn)透明質(zhì)酸能力大大提高的遺傳特性穩(wěn)定的突變株，將其在斜面種子培養(yǎng)基上于32 38°C的溫度培養(yǎng)18 24h后，接種至一級(jí)種子培養(yǎng)基中； (2)將培養(yǎng)好的一級(jí)種子培養(yǎng)液接種至二級(jí)種子培養(yǎng)液中，于32 38°C下培養(yǎng)6 12h至該培養(yǎng)液中的菌群處于指數(shù)生長期的前期； (3)將培養(yǎng)好的種子液接種至營養(yǎng)度較高的發(fā)酵培養(yǎng)基中，使菌體在下列條件下進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn):采用補(bǔ)料分批發(fā)酵，發(fā)酵液pH為5.0 9.0，溫度為32 38°C，攪拌轉(zhuǎn)速150 600rev/min，通氣量 1.0 15.0vvm，培養(yǎng)時(shí)間 18 24h ； (4)結(jié)束發(fā)酵，將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至提取儲(chǔ)罐中，邊攪拌邊用20%三氯乙酸調(diào)pH值至3.0，靜置過夜，用板框進(jìn)行過濾并收集濾出液，然后用去離子水調(diào)節(jié)溶液中透明質(zhì)酸的含量約為5g/L，測定該溶液的pH值，用2N的NaOH溶液將該溶液的pH調(diào)節(jié)至6.0 9.0 ; (5)以10 100g/L的添 加量加入特定型號(hào)的硅藻土并攪拌2h，用不銹鋼板框進(jìn)行過濾，收集濾出液； (6)將另一種特定型號(hào)的硅藻土按照10 100g/L的添加量加入到上述濾出液中，攪拌2h，用不銹鋼板框過濾，并收集濾出液； (7)將I 10g/L的活性炭加入上述濾出液中，攪拌2h后用板框過濾并收集濾出液； (8)取樣測定單位體積的濾出液中透明質(zhì)酸的含量，然后按照2: 1(質(zhì)量比)的比例添加一定濃度的氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液，邊加邊攪拌，全部加完后，繼續(xù)攪拌2h ; (9)將上述混懸液進(jìn)行板框過濾并得到沉淀； (10)配置0.2 1.0mol/L的NaCl溶液，然后將上述沉淀用該氯化鈉溶液溶解，溶解過程要不斷攪拌，以加速溶解速率； (11)將上述完全溶解后的溶液加入I 10g/L濃度的活性炭，攪拌2h后板框過濾并收集濾出液； (12)將上述濾出液通過孔徑為0.22 μ m的濾膜過濾除菌，收集濾出液； (13)往上述濾出液中加入2 3倍體積的95%乙醇溶液，攪拌使原溶液中的透明質(zhì)酸沉淀出來，至不再有沉淀產(chǎn)生時(shí)進(jìn)行板框過濾，收集沉淀至潔凈容器中，用95%乙醇洗2 3次，然后將沉淀放置于真空干燥箱內(nèi)進(jìn)行干燥； (14)收集干燥后的產(chǎn)品并進(jìn)行粉碎即得到最終的產(chǎn)品透明質(zhì)酸鈉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(I)中的選育方法為:以一株馬鏈球菌獸疫亞種為出發(fā)菌株，采用在平板培養(yǎng)基中添加I 10%無菌綿羊血或0.01 0.1 %透明質(zhì)酸鈉的篩選手段，經(jīng)過亞硝基胍誘變及原生質(zhì)體紫外誘變育種技術(shù)，篩選得到表達(dá)量高、不產(chǎn)溶血素及透明質(zhì)酸酶且遺傳特性穩(wěn)定的突變菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的亞硝基胍誘變方法為:稱取IOmg NTG倒入無菌離心管中，加入0.lmol/L、pH 6.0的磷酸緩沖液10mL，暗處振蕩溶解，分裝至無菌小試管中，每管lmL，取ImL菌液加入上述離心管中，充分搖勻，立即置于37°C水浴振蕩處理30min，NTG的終濃度為500 μ g/mL后，離心收集菌體，將含NTG的上清液倒入濃NaOH溶液棄去，用無菌水洗滌菌體3次，用大量稀釋法終止NTG的誘變，最后向離心管中加2mL無菌生理鹽水，涂布無菌羊血瓊脂平板，篩選菌落周圍不產(chǎn)透明圈的變異菌進(jìn)行鑒別并保藏，最終得到一株不產(chǎn)β_溶血素的變異菌株，將其作為出發(fā)菌繼續(xù)進(jìn)行NTG誘變，誘變所用NTG的最終濃度調(diào)節(jié)為600 μ g/mL,涂布含0.01 0.1%透明質(zhì)酸鈉的篩選平板，挑選菌落周圍不產(chǎn)透明圈的單菌落進(jìn)行鑒別并保藏，即可得到既不產(chǎn)β -溶血素，又不產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的變異菌株； 所述的原生質(zhì)體紫外誘變方法為:將上述經(jīng)過亞硝基胍誘變選育得到的既不產(chǎn)溶血素，又不產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的變異菌株作為出發(fā)菌，用種子培養(yǎng)基培養(yǎng)IOh后離心得到菌體，加入2mol/L的蔗糖溶液作為高滲緩沖液，溶解的0.5mg/ml的蝸牛酶及0.2mg/ml纖維素酶溶液5ml，在32°C恒溫處理lh，離心，用高滲緩沖液洗滌得到原生質(zhì)體懸液，在15w紫外燈下，于30cm處，照射lmin，然后將處理過的菌液混入軟瓊脂種子培養(yǎng)基中，瓊脂含量為.0.5%的種子培養(yǎng)基，傾倒至種子培養(yǎng)基平板上。于35°C培養(yǎng)24 48h，待平板上菌落長出后，挑取比出發(fā)菌相比菌落面積較大的單菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，并測定透明質(zhì)酸鈉產(chǎn)量，最終得到一株比原始菌產(chǎn)能提高400%的菌株，即為不產(chǎn)β_溶血素及透明質(zhì)酸酶且產(chǎn)透明質(zhì)酸能力大大提高的遺傳特性穩(wěn)定的突變株。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的斜面種子培養(yǎng)基的成分為:葡萄糖1.0 10g/L,牛肉膏10 50g/L,酵母粉5 15g/L, Na2HPO4 0.5 2.0g/L, MgSO4 0.2 1.0g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:葡萄糖10 70g/L,酵母粉10 50g/L, Na2HPO4I 5g/L,MgSO4 I 5g/L，消泡劑 0.5 1.5g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求 1所述的一種利用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述的補(bǔ)料分批發(fā)酵是將總糖為70g/L，初糖為10g/L，剩余的葡萄糖按照1:3:5:7的量分四次分別于發(fā)酵的第8h，9h，10h, 14h添加到發(fā)酵液中，發(fā)酵過程中不斷調(diào)節(jié)進(jìn)氣量及攪拌轉(zhuǎn)速，使發(fā)酵液的溶氧維持在10 70%的范圍內(nèi)，攪拌轉(zhuǎn)速不可大于600rev/min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(5)中所述的特定型號(hào)的硅藻土為型號(hào)為⑶10的硅藻土。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(6)中所述的特定型號(hào)的硅藻土為型號(hào)為⑶3的硅藻土。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟(7)中所述的活性炭為針形活性炭。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)工藝，其特征在于，步驟⑶中所述的一定濃度的氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液是將CPC溶于去離子水得到濃度為100g/L的溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸鈉的生產(chǎn)工藝，該生產(chǎn)工藝以馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus Zooepidemics)為出發(fā)菌株，經(jīng)亞硝基胍誘變及原生質(zhì)體紫外誘變后，采用特定的培養(yǎng)基，先經(jīng)液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)高產(chǎn)量透明質(zhì)酸，再經(jīng)相應(yīng)的分離純化工藝得到高純度透明質(zhì)酸鈉產(chǎn)品。在培養(yǎng)溫度為32～38℃，發(fā)酵液pH值維持在5.0～9.0范圍內(nèi)，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速為150～600rev/min的培養(yǎng)條件下，透明質(zhì)酸的產(chǎn)量有大幅度提高，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/46GK103173507SQ20111043626
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者楊曉輝, 葉昀, 林克, 王洪森 申請(qǐng)人:寧波林葉生物科技有限公司