單克隆抗體及其應(yīng)用、試劑盒、檢測(cè)銀杏葉水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物制劑檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及單克隆抗體及其應(yīng)用、試劑盒、檢測(cè)銀杏葉水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法。本發(fā)明提供的銀杏葉水溶性蛋白的單克隆抗體由保藏號(hào)為CGMCC?NO：8654的雜交瘤產(chǎn)生。本發(fā)明提供的Dot-ELISA方法檢測(cè)銀杏葉水溶性蛋白的檢測(cè)限低，檢測(cè)的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ELISA方法，且操作時(shí)間短。
【專利說明】單克隆抗體及其應(yīng)用、試劑盒、檢測(cè)銀杏葉水溶性蛋白含量 的Dot-EL丨SA方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及藥物制劑檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及單克隆抗體及其應(yīng)用、試劑盒、檢測(cè)銀杏 葉水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 腦梗死又稱缺血性卒中，中醫(yī)稱之為卒中或中風(fēng)，它是由各種原因所致的局部腦 組織區(qū)域血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性病變壞死，進(jìn)而產(chǎn)生臨床上對(duì)應(yīng)的神經(jīng)功 能缺失表現(xiàn)。腦梗死依據(jù)發(fā)病機(jī)制的不同分為腦血栓形成、腦栓塞和腔隙性腦梗死等主要 類型。其中腦血栓形成是腦梗死最常見的類型，約占全部腦梗死的60%。腦梗死的臨床表現(xiàn) 主要有偏癱、失語、意識(shí)障礙等，致殘率高，給患者帶來極大的痛苦，給家庭及社會(huì)帶來沉重 的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，如何有效預(yù)防和治療腦梗死依然是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。
[0003] 銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液是用于治療腦梗死的藥物，主要功效為活血通絡(luò)，用于 輕中度腦梗死恢復(fù)期痰瘀阻絡(luò)癥(癥狀如半身不遂，口舌歪斜，言語蹇澀，肢體麻木等)。銀 杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液是以銀杏葉為原料，經(jīng)提取純化后得到，其有效成分為銀杏二萜內(nèi) 酯，銀杏二萜內(nèi)酯包括銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯K等。
[0004] 由于中藥注射制劑中有效成分是經(jīng)過生物提取的方式獲得，具有生物提取物的特 征，在提取的過程中不可避免地帶有一些生物大分子，比如植物蛋白質(zhì)、核酸等，而蛋白質(zhì) 是抗原性最強(qiáng)的常見物質(zhì)，且蛋白質(zhì)的分子量越大抗原性越強(qiáng)，越容易引起過敏反應(yīng)或類 過敏反應(yīng)。如果中藥注射制劑的活性成分在提取過程中純化不完全，中藥注射制劑成品中 帶有蛋白質(zhì)雜質(zhì)，致使中藥注射制劑產(chǎn)品的質(zhì)量不合格，注射入患者體內(nèi)易引起過敏反應(yīng)。 因此，控制銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液中水溶性蛋白含量，對(duì)于提高銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射 液的質(zhì)量至關(guān)重要。目前，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液的質(zhì)量控制方面多以高效液相色譜法 (HPLC)和磺基水楊酸沉淀法檢測(cè)為主。高效液相色譜法需使用精密儀器，費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，不適合 大批量樣品的快速測(cè)定；磺基水楊酸沉淀法對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生可見沉淀(混濁）的檢測(cè)限約為 25 μ g/mL，而低于此限量的蛋白質(zhì)也能夠引發(fā)過敏反應(yīng)。因此，提供一種檢測(cè)限低，靈敏度 高，準(zhǔn)確性好，操作簡(jiǎn)便，適于大批量樣品檢測(cè)的檢測(cè)方法，用于銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液 中水溶性蛋白的檢測(cè)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明提供了單克隆抗體及其應(yīng)用、試劑盒、檢測(cè)銀杏葉水溶性蛋白含 量的Dot-ELISA方法。該Dot-ELISA方法檢測(cè)銀杏葉水溶性蛋白的最低檢出量為9. 75ng， 檢測(cè)的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ELISA方法，且操作時(shí)間短。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了一種銀杏葉水溶性蛋白的單克隆抗體，由保藏號(hào)為CGMCC NO :8654 的雜交瘤產(chǎn)生。
[0008] 該雜交瘤于2013年12月23日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生 物中心（CGMCC)，保藏中心地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研 究所，保藏號(hào)為CGMCC N0 :8654。
[0009] 本發(fā)明還提供了該單克隆抗體在制備檢測(cè)銀杏葉水溶性蛋白含量的試劑盒中的 應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)銀杏葉水溶性蛋白含量的試劑盒，包括本發(fā)明提供的單 克隆抗體；該單克隆抗體由保藏號(hào)為CGMCC NO :8654的雜交瘤產(chǎn)生。
[0011] 本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)銀杏葉水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法，包括如下步 驟：
[0012] 獲得待測(cè)樣品；
[0013] 獲得銀杏葉水溶性全蛋白；
[0014] 取硝酸纖維素膜，劃分出第一陰性對(duì)照區(qū)、第一陽性對(duì)照區(qū)和第一檢測(cè)區(qū)，經(jīng)飽 和、第一干燥，獲得第二陰性對(duì)照區(qū)、第二陽性對(duì)照區(qū)和第二檢測(cè)區(qū)；
[0015] 以磷酸鹽緩沖液、銀杏葉水溶性全蛋白、待測(cè)樣品作為抗原，取磷酸鹽緩沖液、銀 杏葉水溶性全蛋白、待測(cè)樣品分別包被于第二陰性對(duì)照區(qū)、第二陽性對(duì)照區(qū)、第二檢測(cè)區(qū)， 經(jīng)第二干燥、封閉、洗滌、第三干燥，獲得抗原膜片；銀杏葉水溶性全蛋白的最低包被量為 9. 75ng ；
[0016] 以本發(fā)明提供的單克隆抗體作為第一抗體，以酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG作為第二抗 體，取第一抗體與抗原膜片結(jié)合，獲得第一抗體-抗原膜片；取第二抗體與第一抗體-抗原 膜片結(jié)合，顯色，終止顯色，觀察檢測(cè)區(qū)是否出現(xiàn)斑點(diǎn)用以檢測(cè)待測(cè)樣品中銀杏葉水溶性蛋 白含量；
[0017] 檢測(cè)區(qū)出現(xiàn)斑點(diǎn)，則待測(cè)樣品中銀杏葉水溶性蛋白含量大于或等于9. 75ng ;
[0018] 檢測(cè)區(qū)未出現(xiàn)斑點(diǎn)，則待測(cè)樣品中銀杏葉水溶性蛋白含量小于9. 75ng。
[0019] 在制備抗原膜片的過程中，取磷酸鹽緩沖液、銀杏葉水溶性全蛋白、待測(cè)樣品分別 包被于第二陰性對(duì)照區(qū)、第二陽性對(duì)照區(qū)、第二檢測(cè)區(qū)，具體為：取磷酸鹽緩沖液包被于第 二陰性對(duì)照區(qū)，取銀杏葉水溶性全蛋白包被于第二陽性對(duì)照區(qū)，取待測(cè)樣品包被于第二檢 測(cè)區(qū)。
[0020] 利用Dot-ELISA方法對(duì)待測(cè)樣品檢測(cè)的結(jié)果需要肉眼觀察，如果硝酸纖維素膜上 的斑點(diǎn)擴(kuò)散的面積過大，則易造成串孔，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的觀察帶來困難。經(jīng)過試驗(yàn)條件的優(yōu) 化，抗原的點(diǎn)樣量為1 μ L時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果易觀察。
[0021] 如果封閉時(shí)間過長(zhǎng)，可導(dǎo)致陰性對(duì)照顏色顯著，使試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確率下降。經(jīng)過試 驗(yàn)條件的優(yōu)化，封閉的時(shí)間為lh時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確率較高。
[0022] 為了保證能夠獲得最佳的反應(yīng)效果，在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，第一抗體的 稀釋倍數(shù)為1:3200?1:6400。
[0023] 為了保證能夠獲得最佳的反應(yīng)效果，在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，第二抗體的 稀釋倍數(shù)為1:5000。
[0024] 為了保證能夠獲得最佳的反應(yīng)效果，在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，顯色的時(shí)間 為 15min ?20min〇
[0025] 為了保證硝酸纖維素膜平整，有利于點(diǎn)樣操作的進(jìn)行，在本發(fā)明提供的一些實(shí)施 例中，第一干燥為在通風(fēng)櫥中干燥。
[0026] 膜濕潤(rùn)時(shí)點(diǎn)樣，易流淌，結(jié)果判斷時(shí)易造成陽性值下降，且影響結(jié)果美觀性。膜半 干時(shí)點(diǎn)樣，擴(kuò)散程度最小。膜完全干燥時(shí)點(diǎn)樣，極易擴(kuò)散，結(jié)果判斷時(shí)易造成陽性值判斷失 誤，且影響結(jié)果美觀性。在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，經(jīng)第一干燥的硝酸纖維素膜的含水 量為10%?30%，試驗(yàn)結(jié)果的陽性值較高。
[0027] 本發(fā)明提供了單克隆抗體及其應(yīng)用、試劑盒、檢測(cè)銀杏葉水溶性蛋白含量的 Dot-ELISA方法。本發(fā)明提供的銀杏葉水溶性蛋白的單克隆抗體由保藏號(hào)為CGMCC N0: 8654的雜交瘤產(chǎn)生。通過對(duì)銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液中銀杏葉水溶性蛋白含量的檢測(cè)試 驗(yàn)，結(jié)果顯示該方法最低檢出量為9. 75ng，而同法操作的間接ELISA方法最低檢出量為 156ng，表明本發(fā)明提供的Dot-ELISA方法的靈敏性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ELISA方法；Dot-ELISA方法 操作時(shí)間短，比ELISA方法節(jié)約2h ;密封后的硝酸纖維素膜片在4°C條件下可保存至少3周 時(shí)間而不影響試驗(yàn)結(jié)果的觀察。由此可見，本發(fā)明提供的Dot-ELISA方法檢測(cè)銀杏葉水溶 性蛋白的檢測(cè)限低，檢測(cè)的靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ELISA方法，且操作時(shí)間短。
[0028] 生物保藏說明
[0029] 分類命名：抗銀杏葉蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，于2013年12月23日保藏在 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC)，保藏中心地址為北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為CGMCC N0 :8654。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1示實(shí)施例5中經(jīng)過顯色的硝酸纖維素膜；其中，A示陰性對(duì)照區(qū)，B示陽性對(duì) 照區(qū)1、C示陽性對(duì)照區(qū)2、D示陽性對(duì)照區(qū)3、E示陽性對(duì)照區(qū)4、F示陽性對(duì)照區(qū)5、G示陽 性對(duì)照區(qū)6、Η示檢測(cè)區(qū)1、I示檢測(cè)區(qū)2、J示檢測(cè)區(qū)3。

【具體實(shí)施方式】
[0031] 本發(fā)明公開了單克隆抗體及其應(yīng)用、試劑盒、檢測(cè)銀杏葉水溶性蛋白含量的 Dot-ELISA方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指 出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括 在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫 離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí) 現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0032] 本發(fā)明提供的單克隆抗體及其應(yīng)用、試劑盒、檢測(cè)銀杏葉水溶性蛋白含量的 Dot-ELISA方法中所用試劑均可由市場(chǎng)購(gòu)得。其中，含高糖的DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自GIBC0公司； 次黃嘌呤（H) (U^yg/mL)、胸腺嘧啶核苷（Τ) (3·88μ8/πιυ購(gòu)自Sigma公司；L-谷氨酰 胺（L.G)(0. 29mg/mL)購(gòu)自華美生物工程公司；雙抗(青霉素 G100U/mL，硫酸鏈霉素 100μ g/ mL)購(gòu)自AMERSC0公司；HAT培養(yǎng)基：在HT培養(yǎng)基中加入氨基蝶呤（A) (1. 76 μ g/mL)購(gòu)自 Sigma公司；辣根過氧化物酶（HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG (全分子)、堿性磷酸酶（AP)標(biāo)記羊 抗鼠 IgG、氨基碟呤（A)、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT)購(gòu)自Sigma公司；McAb亞類鑒定試 劑盒購(gòu)自Thermo公司；50%聚乙二醇4000 (PEG1500)購(gòu)自Sigma公司；新生小牛血清為蘭 州民海生物工程有限公司產(chǎn)品；顯色液BCIP/NBT購(gòu)自AMERSC0公司；TMB (四甲基聯(lián)苯胺)、 十二烷基磺酸鈉 （SDS)、丙烯酰胺等購(gòu)自上海生工生物公司；普通蛋白質(zhì)Marker、預(yù)染的蛋 白質(zhì)Marker購(gòu)自Fermentas公司；考馬斯亮藍(lán)R-250購(gòu)自上海思吉生物制品有限公司；硝 酸纖維素膜（NC膜)購(gòu)自WHATMAN公司；蛋白酶抑制劑購(gòu)自羅氏公司；脫脂乳購(gòu)自伊利公司； 其它有關(guān)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?br> [0033] 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7. 4) :Na2HP04l. 44g，ΚΗ2Ρ040· 24g，NaC18. 0g，KC10. 2g，加蒸 餾水定容至l〇〇〇mL。1M Tris-Hcl (pH8.0):12.11g Tris，加入80mL雙蒸水，充分?jǐn)嚢枞?解，緩慢加入 4.2mL 濃 HC1，定容至 100mL，4°C保存。TBS:NaC18.8g，lM Tris-Hcl (ρΗ8·0) 20mL，加入適量雙蒸水，充分?jǐn)嚢枞芙猓ㄈ葜?L。TBST :TBS+0. 05%Tween-20。5%TBST脫脂 乳：5g脫脂乳粉，加入適量TBST，充分?jǐn)嚢枞芙?，定容?00mL。
[0034] 小鼠骨髓瘤細(xì)胞系（SP2/0)細(xì)胞由揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；6周 齡雌性BALB/C小鼠、8周齡以上雄性ICR小鼠由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。
[0035] C02恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱（-70°C )均為REVC0公司產(chǎn)品，4°C冷凍離心機(jī)為 Eppendorf公司產(chǎn)品；紫外分光光度計(jì)為美國(guó)Nanodrop公司產(chǎn)品；SW-CJ-2F型醫(yī)用凈化工 作臺(tái)為蘇州安泰空氣技術(shù)公司產(chǎn)品。
[0036] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0037] 實(shí)施例1銀杏葉水溶性全蛋白（抗原）的制備
[0038] 采摘新鮮銀杏葉，-70°C保存；將其剪碎，加入適量液氮研磨成粉末狀；取研磨好 的銀杏葉粉末〇· lg，加入1. 5mL10%的三氯乙酸（TCA)-丙酮，-20°C 2h ;4°C、12000rpm/min， 離心lh，棄掉上清，加入1. 5mL冰浴丙酮，-20°C 2h ;重復(fù)前一步操作直至上清變?yōu)榍辶粒?°C 離心棄掉上清；沉淀置于通風(fēng)廚中風(fēng)干，得到含銀杏葉全蛋白沉淀粉末，-70°C保存。
[0039] 取含銀杏葉全蛋白沉淀粉末0. 15g，用lmL pH7.4磷酸鹽緩沖液（PBS)裂解， 12000rpm/min，離心0. 5h，取上清，得到銀杏葉水溶性全蛋白溶液，為防止蛋白質(zhì)降解，加入 蛋白酶抑制劑，-20°C保存?zhèn)溆?。以Bradford方法對(duì)銀杏葉水溶性全蛋白溶液進(jìn)行蛋白質(zhì) 定量，結(jié)果顯示銀杏葉水溶性全蛋白溶液中蛋白質(zhì)濃度為6. 3mg/mL。
[0040] 實(shí)施例2單克隆抗體的制備
[0041] 選取6周齡雌性BALB/C小鼠，以實(shí)施例1提供的銀杏葉水溶性全蛋白溶液腹腔免 疫注射，間隔14天一次，共免疫三次，免疫的劑量分別為100 μ g/只，200 μ g/只，200 μ g/ 只。三次免疫后再進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫的劑量為300yg/只。首免時(shí)與完全弗氏 佐劑（1:1. 1)混合，再次免疫時(shí)與不完全弗氏佐劑（1:1. 5)混合，之后免疫不加佐劑。
[0042] 取加強(qiáng)免疫后72?96h的小鼠，經(jīng)眼采血，麻醉后頸脫位將小鼠致死，用事先準(zhǔn) 備好的75%酒精浸泡，仰面用針頭固定于事先消毒滅菌好放于超凈臺(tái)的泡沫板上，無菌剪 開小鼠腹部皮膚，取出脾臟，置于含少量無血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基的無菌平皿中，用剪刀和 鑷子將表面的結(jié)締組織去除，用彎頭注射器針頭擠壓脾臟，使得脾細(xì)胞釋放，制成脾細(xì)胞懸 液，備用。
[0043] 選擇7瓶處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，密度在80%?90%的骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0細(xì)胞)，用不含 血清的DMEM培養(yǎng)基吹下計(jì)數(shù)，備用。
[0044] 將上述制備的骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)比例約為5?10:1)混合于一支50mL 的的融合管中，lOOOrpm離心10min，棄去培養(yǎng)基，輕拍管底，使沉淀均勻松散成糊狀，在 42?45s內(nèi)加入lmL37°C預(yù)熱的PEG-4000試劑，并立即由慢到快加入DMEM培養(yǎng)液使融合終 止，于37°C培養(yǎng)箱靜置20min后離心，棄上清加入約lOmL HAT培養(yǎng)基，輕輕吹吸混勻，此時(shí) 不能用力吹打，以免使融合在一起的細(xì)胞散開。再移到約80mL HAT培養(yǎng)基中，取約2mL含巨 噬細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基加入上述含融合細(xì)胞的培養(yǎng)基中，分裝于96孔培養(yǎng)板，置于37°C 5%C02 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，5天后HAT補(bǔ)液，10天后用HT培養(yǎng)基換液，同時(shí)吸出上清檢測(cè)篩選。
[0045] 當(dāng)雜交瘤細(xì)胞的上清開始變黃或細(xì)胞長(zhǎng)滿至孔底1/10以上時(shí)吸取上清進(jìn)行間接 ELISA檢測(cè)。將銀杏葉水溶性全蛋白溶液作為包被抗原（以建立好的間接ELISA篩選方法 確定最佳包被抗原濃度)。包被銀杏葉水溶性全蛋白溶液時(shí)包被液為0. 05M、pH9. 6的碳酸 鈉-碳酸氫鈉緩沖液，100 μ L/ 孔，37°C水浴 2h 包被，PBST (0· 01M ρΗ7· 4, Tween-200. 05%) 洗滌三次，加 5%脫脂乳的PBST于37°C封閉2h，PBST洗滌三次后加入雜交瘤細(xì)胞上清，同 時(shí)分別以高免血清和ICR小鼠血清作陽性、陰性對(duì)照，37°C作用lh ;PBST洗滌三次后，力口 入1:10000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠 IgG，37°C作用lh，PBST洗滌五次后，加入新鮮配制的 lmg/mL的底物顯色液TMB (10mL顯色母液+0· lmL TMB使用液+42J0. 74%H202，顯色母液： 25. 7mL0. 2MNa2HP04 · 12Η20+0· 1M 檸檬酸，TMB 使用液：10mg TMB+lmL DMS0)顯色 20min，2M H2S04終止后ELISA讀值儀測(cè)定0D45(I。選取上清只與包被抗原反應(yīng)的培養(yǎng)孔細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。
[0046] 采用有限稀釋法對(duì)ELISA檢測(cè)為陽性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化。首先制備小鼠腹 腔飼養(yǎng)細(xì)胞，具體方法為：取一只健康的ICR小鼠，經(jīng)眼采血，麻醉后頸脫位將小鼠致死，體 表消毒和固定后，從胸部剪開皮膚，并將皮膚向尾巴拉，暴露整個(gè)腹膜，酒精棉球消毒腹膜。 用5mL注射器，注射5mL HAT培養(yǎng)基到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球輕輕按摩腹 部，抽回腹腔內(nèi)液體，置于10mL離心管中備用。將篩選得到的疑似陽性孔雜交瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移 至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中擴(kuò)大培養(yǎng)，對(duì)重復(fù)篩選陽性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆，具體操作步驟 如下：將細(xì)胞上清吸去，用lmL的HT生長(zhǎng)液將細(xì)胞輕輕吹起，以血球計(jì)數(shù)板四周的16孔為 準(zhǔn)，共計(jì)數(shù)4個(gè)16孔。結(jié)果得到細(xì)胞總數(shù)為1 X 104。先加 lOmLHT到離心管中，1 X 104/4=2500 個(gè)細(xì)胞/mL，需要三倍稀釋：先20滴HT培養(yǎng)基，再滴加10滴細(xì)胞懸液得到800個(gè)左右細(xì)胞 /mL，吸取2滴此濃度細(xì)胞加入到9. 5mL HT中，再加入0. 5mL巨噬細(xì)胞，充分混勻，每孔2滴 加入96孔板中，再每孔補(bǔ)加1滴(邊緣補(bǔ)加2滴)。然后置37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，期間切 忌移動(dòng)細(xì)胞板。5?6d數(shù)亞克隆，10d后根據(jù)克隆的生長(zhǎng)情況，吸取單克隆細(xì)胞孔的上清 進(jìn)行篩選。每株細(xì)胞克隆2?3次，直至抗體陽性率達(dá)100%，得到單克隆抗體，并采用間接 ELISA檢測(cè)單克隆抗體的0D45Q。
[0047] 腹水型單抗的效價(jià)的檢測(cè)：取8?10周齡的Balb/c小鼠，腹腔注射礦物油0. 5mL， 兩周后，取抗體陽性率達(dá)100%的雜交瘤細(xì)胞100萬稀釋于DMEM培養(yǎng)基，腹腔注射，待小 鼠腹部明顯膨大后多次抽取腹水，將腹水5000rpm離心5min，取上清，得到腹水型單抗， 于-70°C凍存?zhèn)溆?。以?shí)施例1提供的銀杏葉水溶性全蛋白溶液作為抗原，按5 μ g/孔37°C 水浴2h進(jìn)行包被。將腹水型單抗1:200稀釋后再倍比稀釋（1:200、1:400、1:800、1:1600、 1:3200、1:6400、1:25600、1:102400、1:409600、1:1638400)，按照間接 ELISA 方法測(cè)定第一 抗體(一抗）的效價(jià)，以辣根過氧化物酶（HRP)標(biāo)記的羊抗鼠全分子IgG作為二抗，采用TMB 顯色，用2mol/L的硫酸終止反應(yīng)，測(cè)定各孔0D45(I，檢測(cè)細(xì)胞上清的單抗效價(jià)。同時(shí)設(shè)高免血 清為陽性對(duì)照，正常ICR小鼠血清為陰性對(duì)照，稀釋腹水0D 45(/陰性對(duì)照0D45(I彡2. 1為陽 性，對(duì)應(yīng)的抗體最高稀釋倍數(shù)作為該抗體的效價(jià)。
[0048] 經(jīng)過檢測(cè)后，獲得了 1株能夠產(chǎn)生抗銀杏葉水溶性蛋白的單克隆抗體(單抗）的 雜交瘤細(xì)胞，保藏編號(hào)為CGMCC NO :8654,其產(chǎn)生的單克隆抗體命名為抗銀杏葉蛋白單抗 8cl0。抗銀杏葉蛋白單抗8cl0的間接ELISA檢測(cè)結(jié)果見表1。表1中的結(jié)果顯示抗銀杏葉 蛋白單抗8cl0與包被抗原呈強(qiáng)陽性反應(yīng)。應(yīng)用間接ELISA方法證明，腹水型單抗的效價(jià)可 以達(dá)到1:102400 (陽性血清A450為2. 385,陰性對(duì)照A450為0. 253)。
[0049] 表1銀杏葉蛋白單抗8cl0的間接ELISA檢測(cè)結(jié)果
[0050]

【權(quán)利要求】
1. 一種銀杏葉水溶性蛋白的單克隆抗體，其特征在于，由保藏號(hào)為CGMCC NO :8654的 雜交瘤產(chǎn)生。
2. 如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備檢測(cè)銀杏葉水溶性蛋白含量的試劑盒中的 應(yīng)用。
3. -種檢測(cè)銀杏葉水溶性蛋白含量的試劑盒，其特征在于，包括如權(quán)利要求1所述的 單克隆抗體。
4. 一種檢測(cè)銀杏葉水溶性蛋白含量的Dot-ELISA方法，其特征在于，包括如下步驟： 獲得待測(cè)樣品； 獲得銀杏葉水溶性全蛋白； 取硝酸纖維素膜，劃分出第一陰性對(duì)照區(qū)、第一陽性對(duì)照區(qū)和第一檢測(cè)區(qū)，經(jīng)飽和、第 一干燥，獲得第二陰性對(duì)照區(qū)、第二陽性對(duì)照區(qū)和第二檢測(cè)區(qū)； 以磷酸鹽緩沖液、所述銀杏葉水溶性全蛋白、所述待測(cè)樣品作為抗原，取所述磷酸鹽緩 沖液、所述銀杏葉水溶性全蛋白、所述待測(cè)樣品分別包被于所述第二陰性對(duì)照區(qū)、所述第二 陽性對(duì)照區(qū)、所述第二檢測(cè)區(qū)，經(jīng)第二干燥、封閉、洗滌、第三干燥，獲得抗原膜片；所述銀杏 葉水溶性全蛋白的最低包被量為9. 75ng ; 以權(quán)利要求1所述的單克隆抗體作為第一抗體，以酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG作為第二抗體， 取所述第一抗體與所述抗原膜片結(jié)合，獲得第一抗體-抗原膜片；取所述第二抗體與所述 第一抗體-抗原膜片結(jié)合，顯色，終止顯色，觀察所述檢測(cè)區(qū)是否出現(xiàn)斑點(diǎn)用以檢測(cè)所述待 測(cè)樣品中銀杏葉水溶性蛋白含量； 所述檢測(cè)區(qū)出現(xiàn)斑點(diǎn)，則所述待測(cè)樣品中銀杏葉水溶性蛋白含量大于或等于9. 75ng ; 所述檢測(cè)區(qū)未出現(xiàn)斑點(diǎn)，則所述待測(cè)樣品中銀杏葉水溶性蛋白含量小于9. 75ng。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的Dot-ELISA方法，其特征在于，所述抗原的點(diǎn)樣量為1 μ L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的Dot-ELISA方法，其特征在于，所述封閉的時(shí)間為lh。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的Dot-ELISA方法，其特征在于，所述第一抗體的稀釋倍數(shù)為 1:3200 ?1:6400。
8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的Dot-ELISA方法，其特征在于，所述第二抗體的稀釋倍數(shù)為 1:5000。
9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的Dot-ELISA方法，其特征在于，所述顯色的時(shí)間為15min? 20min〇
10. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的Dot-ELISA方法，其特征在于，所述第一干燥為在通風(fēng)櫥中 干燥。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104140465SQ201310740803
【公開日】2014年11月12日 申請(qǐng)日期:2013年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月27日
【發(fā)明者】蕭偉, 秦愛建, 王振中, 趙妮, 李芳 , 錢琨, 周軍, 劉秋 申請(qǐng)人:江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司, 揚(yáng)州大學(xué)