專利名稱：利用微生物測(cè)定飼料中煙酸和煙酰胺含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種測(cè)定飼料中煙酸和煙酰胺含量的方法，具體地說，涉及一種利用微生物測(cè)定飼料中煙酸和煙酰胺含量的方法。
背景技術(shù)：
目前維生素預(yù)混料中煙酸及煙酰胺的測(cè)定方法主要為高效液相色譜法，盡管該方法具有快速簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，但該法僅適用于純度高且多為游離狀態(tài)的樣品，比如維生素預(yù)混料。但對(duì)動(dòng)物全價(jià)料及天然飼料原料煙酸及煙酰胺的測(cè)定仍然沒有合適的方法，這是因?yàn)槿珒r(jià)料及天然飼料原料中煙酸含量極低，采用高效液相色譜法測(cè)定時(shí)出峰面積小或樣品峰與雜峰粘連，誤差很大。微生物植物乳桿菌(LactcAacillus plantarum)對(duì)煙酸及煙酰胺具有極高的特異性與靈敏性，缺乏煙酸與煙酰胺時(shí)其生長(zhǎng)受到抑制，故利用植物乳桿菌的這一特性可以測(cè)定樣品中煙酸和煙酰胺的有效含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用微生物測(cè)定飼料中煙酸和煙酰胺含量的方法，以克服采用高效液相色譜法測(cè)定動(dòng)物全價(jià)料及天然飼料原料中煙酸和煙酰胺含量所存在的不足。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種利用微生物測(cè)定飼料中煙酸和煙酰胺含量的方法，其是將植物乳桿菌接種于含有除煙酸和煙酰胺外的植物乳桿菌生長(zhǎng)所用的培養(yǎng)基中，則植物乳桿菌的生長(zhǎng)量與所加入的煙酸和煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品的含量相對(duì)應(yīng)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后對(duì)飼料樣品進(jìn)行水解處理，制備待測(cè)樣品溶液，將等量的植物乳桿菌接種于含有待測(cè)樣品溶液的培養(yǎng)基中，從而根據(jù)植物乳桿菌的生長(zhǎng)量定量計(jì)算出飼料樣品中煙酸和煙酰胺的含量。具體地，前述方法包括以下步驟1)煙酸和煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精確稱取煙酸標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醇配制成已知濃度的溶液，向含有除煙酸和煙酰胺外的植物乳桿菌生長(zhǎng)所用的培養(yǎng)基中加入該煙酸的乙醇溶液，配制成煙酸終濃度為0、2. 5、5、10、15、20、25、30、35、 40,45和50ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液；幻煙酸和煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將定量的植物乳桿菌分別接種于上述不同煙酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中，根據(jù)植物乳桿菌的生長(zhǎng)量與煙酸標(biāo)準(zhǔn)品的含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；幻飼料樣品的水解處理將飼料樣品溶解于lmol/L硫酸溶液中，超聲后滅菌，用NaOH調(diào)節(jié)pH值6. 0-6. 5，然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH值4. 5，將水解液轉(zhuǎn)移至容量瓶中定容， 得到待測(cè)樣品溶液；4)飼料樣品中煙酸和煙酰胺含量的測(cè)定將等量的植物乳桿菌接種于含有待測(cè)樣品溶液的培養(yǎng)基中，根據(jù)植物乳桿菌的生長(zhǎng)量定量計(jì)算出飼料樣品中煙酸和煙酰胺的含量。本發(fā)明的微生物測(cè)定法中所用的微生物為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) ATCC 8014，接種所用的植物乳桿菌為菌液形式，其制備過程如下1)菌種的活化將植物乳桿菌ATCC 8014凍干粉加入盛有MRS肉湯培養(yǎng)基的厭氧管中，置于37士 1°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，首次培養(yǎng)48h，以后每24h傳代一次，傳代10次后用穿刺法轉(zhuǎn)接于MRS瓊脂培養(yǎng)基中，-20°C保存，每周轉(zhuǎn)接一次；幻菌液的制備將轉(zhuǎn)接于MRS肉湯培養(yǎng)基中的菌液倒入IOmL離心管中，2000rpm離心lOmin，棄去上清液，加入IOmL 0. 9%生理鹽水，震蕩混勻如前離心，反復(fù)兩次，再加入IOmL生理鹽水制成菌懸液，以生理鹽水為對(duì)照，用分光光度計(jì)于 550nm波長(zhǎng)下測(cè)定其透光率，透光率為60 80%的菌液為接種時(shí)可以使用的菌液。前述方法中使用的MRS肉湯培養(yǎng)基為葡萄糖30g、胰蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母浸粉5g、檸檬酸銨2g、醋酸鈉5g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸鎂0. 3g、四水硫酸錳0. 12g、 吐溫80 ImL和水lOOOmL，pH6. 7士0. 2 ；MRS瓊脂培養(yǎng)基為向上述MRS肉湯培養(yǎng)基中按 1. 5% 1. 8%的重量比添加瓊脂。采用上述微生物測(cè)定法可對(duì)天然飼料及動(dòng)物全價(jià)料中煙酸和煙酰胺的含量進(jìn)行測(cè)定，所述動(dòng)物全價(jià)料為雞、鴨、豬、牛、羊全價(jià)料。微生物測(cè)定法的原理是當(dāng)培養(yǎng)基中含有除煙酸及煙酰胺外的所有菌體生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，則在一定范圍內(nèi)植物乳桿菌的生長(zhǎng)量就與標(biāo)準(zhǔn)管中標(biāo)準(zhǔn)溶液的煙酸含量以及未知濃度的待測(cè)溶液中煙酸和煙酰胺的有效含量相對(duì)應(yīng)，從而可定量計(jì)算出樣品中煙酸及煙酰胺的含量。本發(fā)明提供微生物法對(duì)天然飼料原料及動(dòng)物全價(jià)料中煙酸及煙酰胺的含量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)其精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行分析，結(jié)果證明利用該法測(cè)定飼料中煙酸和煙酰胺含量， 重現(xiàn)性好，靈敏性高，準(zhǔn)確性高，為飼料中煙酸及煙酰胺含量的測(cè)定提供參考。


圖1為本發(fā)明植物乳桿菌的生長(zhǎng)量與煙酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實(shí)施例1 10種天然飼料和8種全價(jià)料中煙酸及煙酰胺含量的測(cè)定本實(shí)施例的微生物測(cè)定法中所用的微生物為植物乳桿菌(Lactobacillus ρlantarum)ATCC 8014。植物乳桿菌生長(zhǎng)所用的培養(yǎng)基為MRS肉湯培養(yǎng)基葡萄糖30g，胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，檸檬酸銨2g，醋酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，七水硫酸鎂0. 3g，四水硫酸錳 0. 12g，吐溫80 lmL，加水IOOOmL,調(diào)節(jié)ρΗ6· 7 士0. 2 ；MRS瓊脂培養(yǎng)基將上述MRS肉湯培養(yǎng)基中按照1. 5% 1. 8%比例添加瓊脂。1、菌種的復(fù)活與保存將植物乳桿菌ATCC 8014凍干粉轉(zhuǎn)入裝有MRS肉湯培養(yǎng)基的厭氧管中，37士 1°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，首次培養(yǎng)48h，以后每24h傳代一次，傳代10次后用穿刺法轉(zhuǎn)接于MRS瓊脂培養(yǎng)基中，-20°C保存，每周轉(zhuǎn)接一次。2、菌液的制備將轉(zhuǎn)接于MRS肉湯培養(yǎng)基中的菌液倒于IOmL離心管中，2000轉(zhuǎn)/ 分離心lOmin，棄去上清液，加入IOmL 0. 9%生理鹽水，震蕩混勻如前離心，反復(fù)兩次，再加入IOmL生理鹽水，混勻。吸取適量該菌懸液于IOmL生理鹽水中，以生理鹽水為對(duì)照，用分光光度計(jì)于550nm波長(zhǎng)下測(cè)定其透光率，如在60 80%之間則可使用。3、飼料樣品的處理方法稱取0. 5g樣品(選取10種天然飼料和8種全價(jià)料)于 250mL三角瓶中，加入lmol/L硫酸溶液50mL溶解試樣，充分混合，在超聲波中超聲lOmin， 然后置于高壓滅菌鍋中121°C保存30min，取出冷卻至室溫，用NaOH調(diào)節(jié)pH至6. 5，劇烈震蕩，再用鹽酸調(diào)節(jié)PH至4. 5，將水解液轉(zhuǎn)移至IOOmL棕色容量瓶中，定容，過濾，此水解液可保存于4°C冰箱中儲(chǔ)藏。吸取適量此水解液，加入20mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至6. 8，定容至適當(dāng)刻度。4、煙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制煙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100yg/mL)稱取20mg(精確值 0. Img)煙酸標(biāo)準(zhǔn)品(sigma)，用25%乙醇溶液溶解并定容至200mL，保存于4°C冰箱中，保存期為4個(gè)月。煙酸標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(10 μ g/mL)從煙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中吸取IOmL至IOOmL棕色容量瓶中，用25%乙醇溶液定容，保存于4°C冰箱中，保存期為1個(gè)月。煙酸標(biāo)準(zhǔn)工作液 (100ng/mL)從標(biāo)準(zhǔn)中間液中吸取1. OmL至棕色容量瓶中，用水定容至IOOmL,臨用前配制。標(biāo)準(zhǔn)曲線管的制備標(biāo)準(zhǔn)管中煙酸含量分別為(ng) :0、0、25、50、100、150、200、 250、300、350、400、450、500，以標(biāo)準(zhǔn)管中煙酸含量為橫坐標(biāo)，測(cè)得的OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線管的制備如表1。表1標(biāo)準(zhǔn)曲線管的制備(單位，mL)
權(quán)利要求
1.一種利用微生物測(cè)定飼料中煙酸和煙酰胺含量的方法，其特征在于，將植物乳桿菌接種于含有除煙酸和煙酰胺外的植物乳桿菌生長(zhǎng)所用的培養(yǎng)基中，則植物乳桿菌的生長(zhǎng)量與所加入的煙酸和煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品的含量相對(duì)應(yīng)，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；然后對(duì)飼料樣品進(jìn)行水解處理，制備待測(cè)樣品溶液，將等量的植物乳桿菌接種于含有待測(cè)樣品溶液的培養(yǎng)基中，從而根據(jù)植物乳桿菌的生長(zhǎng)量定量計(jì)算出飼料樣品中煙酸和煙酰胺的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟1)煙酸和煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精確稱取煙酸標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醇配制成已知濃度的溶液，向含有除煙酸和煙酰胺外的植物乳桿菌生長(zhǎng)所用的培養(yǎng)基中加入該煙酸的乙醇溶液， 配制成煙酸終濃度為0,2. 5、5、10、15、20、25、30、35、40、45和50ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液；2)煙酸和煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制將定量的植物乳桿菌分別接種于上述不同煙酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液中，根據(jù)植物乳桿菌的生長(zhǎng)量與煙酸標(biāo)準(zhǔn)品的含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；3)飼料樣品的水解處理將飼料樣品溶解于lmol/L硫酸溶液中，超聲后滅菌，用NaOH 調(diào)節(jié)PH值6. 0-6. 5，然后用鹽酸調(diào)節(jié)pH值4. 5，將水解液轉(zhuǎn)移至容量瓶中定容，得到待測(cè)樣品溶液；4)飼料樣品中煙酸和煙酰胺含量的測(cè)定將等量的植物乳桿菌接種于含有待測(cè)樣品溶液的培養(yǎng)基中，根據(jù)植物乳桿菌的生長(zhǎng)量定量計(jì)算出飼料樣品中煙酸和煙酰胺的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物乳桿菌為植物乳桿菌 (Lactobacillus ρIantarum)ATCC 8014。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，接種所用的植物乳桿菌為菌液形式，其制備過程如下1)菌種的活化將植物乳桿菌ATCC8014凍干粉加入盛有MRS肉湯培養(yǎng)基的厭氧管中，置于37 士 1°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，首次培養(yǎng)48h，以后每24h傳代一次，傳代10次后用穿刺法轉(zhuǎn)接于MRS瓊脂培養(yǎng)基中，-20°C保存，每周轉(zhuǎn)接一次；2)菌液的制備將轉(zhuǎn)接于MRS肉湯培養(yǎng)基中的菌液倒入IOmL離心管中，2000轉(zhuǎn)/分離心lOmin，棄去上清液，加入IOml 0. 9%生理鹽水，震蕩混勻如前離心，反復(fù)兩次，再加入 IOml生理鹽水制成菌懸液，以生理鹽水為對(duì)照，用分光光度計(jì)于550nm波長(zhǎng)下測(cè)定其透光率，透光率為60 80%的菌液為接種時(shí)使用的菌液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述MRS肉湯培養(yǎng)基為葡萄糖30g、胰蛋白胨log、牛肉膏10g、酵母浸粉5g、檸檬酸銨2g、醋酸鈉5g、磷酸氫二鉀2g、七水硫酸鎂 0. 3g、四水硫酸錳0. 12g、吐溫80ImL和水IOOOmL, pH6. 7 士0. 2 ；所述MRS瓊脂培養(yǎng)基為向上述MRS肉湯培養(yǎng)基中按1. 5% 1. 8%的重量比添加瓊脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述飼料為天然飼料或動(dòng)物全價(jià)料。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述動(dòng)物全價(jià)料為雞、鴨、豬、牛、羊全價(jià)料。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用微生物測(cè)定飼料中煙酸和煙酰胺含量的方法，其是當(dāng)培養(yǎng)基中含有除煙酸及煙酰胺外的所有菌體生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，則在一定范圍內(nèi)植物乳桿菌的生長(zhǎng)量就與標(biāo)準(zhǔn)管中標(biāo)準(zhǔn)溶液的煙酸含量以及未知濃度的待測(cè)溶液中煙酸和煙酰胺的有效含量相對(duì)應(yīng)，從而可定量計(jì)算出飼料樣品中煙酸及煙酰胺的含量。微生物法具有重現(xiàn)性好，靈敏性高，準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確反映飼料中煙酸和煙酰胺的有效含量。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102505038SQ20111035338
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月9日
發(fā)明者董爽, 計(jì)成, 趙麗紅, 馬秋剛 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)