專利名稱：用于檢測原發(fā)性肝癌的癌組織及癌旁組織的基因標志物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥學領域；更具體地，本發(fā)明涉及用于檢測原發(fā)性肝癌的癌組織及癌旁組織的基因標志物。
背景技術：
任何事物的發(fā)生發(fā)展都處于內外因共同作用之下，內因為主，外因為輔?；蜃鳛樯倪z傳介質，在生物體的生、老、病、死中處于基礎內因的地位。絕大部分基因通過轉錄生成核糖核酸mRNA，再翻譯生成蛋白質而發(fā)揮生物學功能?；虻墓δ茈m然主要是通過蛋白質的來體現，但仍可以通過基因的轉錄產物mRNA的含量而部分反映。全基因組表達譜芯片含2萬余個探針，利用DNA雙鏈同源互補的原理在全基因組水平上檢測樣本中所含各種mRNA的含量，因此可在同一時間對待測樣本中全基因組范圍內的基因的轉錄水平進行檢測，進而推測基因功能。原發(fā)性肝癌是中國最常見的惡性腫瘤之一，每年新發(fā)病例約占全球50%。肝癌的惡性程度高，發(fā)展迅速，治療困難，病死率高。因此，肝癌的盡早診斷就愈發(fā)顯得迫切。然而，迄今為止，本領域對于與原發(fā)性肝癌密切相關的基因了解甚少，因此本領域迫切需要進一步地分離各種與原發(fā)性肝癌密切相關的基因，找到對于診斷肝癌的發(fā)生、轉移、復發(fā)或檢測有關的基因標志物。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的 在于提供用于檢測、區(qū)分原發(fā)性肝癌的癌組織及癌旁組織的基因標志物。在本發(fā)明的第一方面，提供一種多核苷酸集，所述的多核苷酸集包括編碼以下蛋白的多核苷酸(較佳地，由編碼以下蛋白的多核苷酸組成)纖維膠凝蛋白3，⑶209分子，雌激素受體1，⑶5類分子，犬尿酸3_羥化酶，N-?；D移酶，載酯蛋白F，鐵調素抗菌肽，糖原合成酶2，類固醇-5-alpha-還原酶2，促腎皮質素激素結合蛋白，乙醇脫氫酶4，細胞色素P450家族2亞家族C多肽19，細胞色素P450家族2亞家族C多肽8，凝結因子9，細胞色素P450家族2亞家族C多肽9，金屬硫蛋白1G，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，成膠原結構的巨噬細胞受體，金屬硫蛋白1H，Afamin，甘氨酸-N-酰基轉移酶，視黃醇脫氫酶16，甘氨酸-N-甲基轉移酶，甲銨乙內酯-高半胱氨酸甲基轉移酶，酪氨酸氨基轉移酶，載脂蛋白A5，絲氨酸脫水酶，分泌型磷蛋白2，丙氨酸-乙醛酸氨基轉移酶2樣蛋白1，細胞色素P450家族26亞家族A多肽1，17-beta羥留類脫氫酶6同源蛋白和分泌型憐蛋白I。在一個優(yōu)選例中，所述的多核苷酸集中，編碼所述的纖維膠凝蛋白3，CD209分子，雌激素受體I，CD5類分子，犬尿酸3-羥化酶，N-?；D移酶，載酯蛋白F，鐵調素抗菌肽，糖原合成酶2，類固醇-5-alpha-還原酶2，促腎皮質素激素結合蛋白，乙醇脫氫酶4，細胞色素P450家族2亞家族C多肽19，細胞色素P450家族2亞家族C多肽8，凝結因子9，細胞色素P450家族2亞家族C多肽9，金屬硫蛋白1G，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，成膠原結構的巨噬細胞受體，金屬硫蛋白1H，Af amin，甘氨酸-N-?；D移酶，視黃醇脫氫酶16，甘氨酸-N-甲基轉移酶，甲銨乙內酯-高半胱氨酸甲基轉移酶，酪氨酸氨基轉移酶，載脂蛋白A5，絲氨酸脫水酶，分泌型磷蛋白2，丙氨酸-乙醛酸氨基轉移酶2樣蛋白I，細胞色素P450家族26亞家族A多肽1，17-beta羥留類脫氫酶6同源蛋白和分泌型磷蛋白I的多核苷酸分別是序列如 GenBank 登錄號 ΝΜ_003665· 2，ΝΜ_021155. 3，ΝΜ_021155. 3，ΝΜ_005894. 2，ΝΜ_003679. 3，ΝΜ_000015.2， ΝΜ_001638.2， ΝΜ_021175.2， ΝΜ_021957.3， ΝΜ_000348.3， ΝΜ_001882.3，ΝΜ_000670.3, ΝΜ_000769.1, ΝΜ_000770.3, ΝΜ_000133.3, ΝΜ_000771.3, ΝΜ_005950.1,ΝΜ_002591.3， ΝΜ_006770.3， ΝΜ_005951.2， ΝΜ_001133.2， ΝΜ_201648.2， ΝΜ_003708.3，ΝΜ_018960.4， ΝΜ_001713.2， ΝΜ_000353.2， ΝΜ_052968.3， ΝΜ_006843.2， ΝΜ_006944.2，ΝΜ_031279. 2，ΝΜ_000783. 3，ΝΜ_003725. 2 和 ΝΜ_001040058· I 所示的多核苷酸。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的多核苷酸集的用途，用于制備測定(或區(qū)分)原發(fā)性肝癌的癌組織及癌旁組織的檢測試劑或試劑盒。在一個優(yōu)選例中，所述的試劑是特異性擴增所述的多核苷酸集中各多核苷酸的引物對；或是特異性識別所述的多核苷酸集中各多核苷酸的探針。在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于測定(或區(qū)分)原發(fā)性肝癌的癌組織及癌旁組織的試劑，其是特異性識別序列如GenBank登錄號NM_003665. 2，ΝΜ_021155.3，ΝΜ_021155.3, ΝΜ_005894.2, ΝΜ_003679.3, ΝΜ_000015.2, ΝΜ_001638.2, ΝΜ_021175.2,ΝΜ_021957.3， ΝΜ_000348.3， ΝΜ_001882.3， ΝΜ_000670.3， ΝΜ_000769.1， ΝΜ_000770.3，ΝΜ_000133.3, ΝΜ_000771.3, ΝΜ_005950.1, ΝΜ_002591.3, ΝΜ_006770.3, ΝΜ_005951.2,ΝΜ_001133.2， ΝΜ_201648.2， ΝΜ_003708.3， ΝΜ_018960.4， ΝΜ_001713.2， ΝΜ_000353.2，ΝΜ_052968. 3，ΝΜ_006843. 2，ΝΜ_006944. 2，ΝΜ_031279. 2，ΝΜ_000783. 3，ΝΜ_003725. 2 或ΝΜ_001040058.1所示 的多核苷酸的探針，所述的探針的核苷酸序列如SEQ ID N0:l_33任一所示。在本發(fā)明的另一方面，提供一種基因芯片，所述的基因芯片包括固相載體；以及有序固定在所述固相載體上的探針，所述的探針特異性地對應于序列如GenBank 登錄號 ΝΜ_003665· 2，ΝΜ_021155. 3，ΝΜ_021155. 3，ΝΜ_005894. 2，ΝΜ_003679. 3，ΝΜ_000015.2， ΝΜ_001638.2， ΝΜ_021175.2， ΝΜ_021957.3， ΝΜ_000348.3， ΝΜ_001882.3，ΝΜ_000670.3, ΝΜ_000769.1, ΝΜ_000770.3, ΝΜ_000133.3, ΝΜ_000771.3, ΝΜ_005950.1,ΝΜ_002591.3， ΝΜ_006770.3， ΝΜ_005951.2， ΝΜ_001133.2， ΝΜ_201648.2， ΝΜ_003708.3，ΝΜ_018960.4， ΝΜ_001713.2， ΝΜ_000353.2， ΝΜ_052968.3， ΝΜ_006843.2， ΝΜ_006944.2，ΝΜ_031279. 2，ΝΜ_000783. 3，ΝΜ_003725. 2 或 ΝΜ_001040058· I 所示的多核苷酸。在一個優(yōu)選例中，所述的探針的核苷酸序列如SEQ ID NO :1_33任一所示。在另一優(yōu)選例中，所述的探針含有互補結合區(qū)和/或與固相載體相連的連接區(qū)。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的基因芯片的用途，用于制備測定(或區(qū)分)原發(fā)性肝癌的癌組織及癌旁組織的試劑盒。在本發(fā)明的另一方面，提供一種測定(或區(qū)分)原發(fā)性肝癌的癌組織及癌旁組織的試劑盒，所述的試劑盒中含有所述的基因芯片。
在一個優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括核酸抽提液、顯色液或雜交液。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1、以MDS算法轉換后的癌樣本(紅色點或淺色點)和癌旁樣本(藍色點或深色點)在三維空間內的散點圖。其中，Cancer表示癌樣本，Pericancerous表示癌旁樣本。
具體實施例方式本發(fā)明人通過檢測同一原發(fā)性肝癌患者來源的癌組織樣本和癌旁組織樣本的全基因組表達譜，用統計學方法，首次從中篩選出33個特異性的基因。經檢驗證明，這些特異性的基因標志物可非常有效地用于區(qū)分原發(fā)肝癌患者的癌組織和癌旁組織?；驑酥疚锛捌溆猛驹l(fā)性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。本發(fā)明人采用芯片雜交的方法得到原發(fā)肝癌的癌組織樣本和癌旁組織樣本的全基因組表達譜，通過比較兩種組織的表達譜，得到癌與癌旁組織間差異表達的基因。在這些差異基因中挑選出差異尤為顯著的一部分，使用C-SVC分類器(高斯核函數)算法篩選得到分類準確度為95%的一組分類器(含33個基因)。由這33個基因組成的分類器，可預測樣本是來自癌組織還是癌旁組織，其預測準確度達到87%?？梢园堰@33個基因開發(fā)成小型基因芯片或RT-PCR試劑盒用于肝癌的鑒別診斷。所述的33 個基因如下FCN3, CD209, ESRl, CD5L, KMO, NAT2, APOF，HAMP, GYS2,SRD5A2, CRHBP, ADH4, CYP2C19, CYP2C8, F9, CYP2C9, MT1G, PCKl，MARCO, MT1H, AFM, GLYAT,RODH-4, GNMT, BH MT, TAT, AP0A5, SDS, SPP2, AGXT2L1, CYP26A1, RODH, SPPl?；诒景l(fā)明人的新發(fā)現，可以以上述33個基因作為測定(或區(qū)分)原發(fā)性肝癌的癌組織及癌旁組織的標志物(標記物)。通過分析這些基因的表達情況，從而得知確定待測組織的類型，為疾病的診斷或預后提供依據。可采用各種技術來檢測上述基因的表達情況，這些技術均包含在本發(fā)明中。基因水平上，檢測可以針對cDNA，也可針對基因組DNA，或針對mRNA ;可用的已有技術如(但不限于)基因芯片技術、探針雜交技術、聚合酶鏈反應(PCR)、Southern印跡法、DNA序列分析等。作為本發(fā)明的一種選擇方式，通過定量或半定量的聚合酶鏈反應(PCR)法來分析樣品中上述基因的表達情況以及表達量，從而可做出判斷。較佳地，通過RT-PCR實現檢測?；蛐酒鳛楸景l(fā)明的一種優(yōu)選方式，采用基因芯片技術來檢測上述基因的表達情況。所述的基因芯片上包含針對上述基因的探針；更優(yōu)選的，所述的基因芯片上包含針對兩種或兩種以上所述基因的探針；最優(yōu)選的，所述的基因芯片上包含針對所述33種基因的探針。本發(fā)明所述的基因芯片，包括固相載體和有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針由10-100個(更特別的為20-80個；更特別的為30-70個)連續(xù)核苷酸組成。所述探針還可以在其5’端包含一段氨基修飾的1-30聚的聚脫氧胸苷酸(聚dT)。所述固相載體可采用基因芯片領域的各種常用材料，例如但不限于尼龍膜，經活性基團(如醛基、氨基、異硫晴酸基等)修飾的玻片或硅片、未修飾的玻片、塑料片等。本發(fā)明的基因芯片的制備可采用生物芯片的常規(guī)制造方法。例如，如果固相載體采用的是修飾玻片或硅片，探針的5’端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡核苷酸探針配制成溶液，然后點樣儀將其點在修飾玻片或硅片，排列成預定的序列或陣列，然后通過放置過夜來固定，就可得到本發(fā)明的基因芯片。如果寡核苷酸探針不含氨基修飾，則其制備方法也可參照王申五主編的《基因診斷技術-非放射性操作手冊》J. L. erisi, V. R.1yer,P. O. BROWN. Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on agenomic scale. Science. 1997 ；278 :680和馬立人，蔣中華主編.生物芯片.北京化學工業(yè)出版社,2000，1-130。另一個方面，本發(fā)明還提供了一種通過基因芯片檢測人組織中所述基因表達譜的方法，包括步驟(I)提供分離自人組織的RNA樣品，在所述的RNA上設置標記物；(2)將⑴的RNA與所述的芯片接觸，使所述的RNA與固相載體上的寡核苷酸探針發(fā)生雜交反應，從而在固相載體上形成“寡核苷酸探針-RNA” 二元復合物；(3)檢測(2)形成的二元復合物的標記物，從而確定人組織中相應的基因的表達
-1'TfeP曰。本發(fā)明所述的RNA與芯片之間的固相雜交按照本領域的經典方法進行，本領域一般人員依據經驗容易確定有關緩沖液、探針和樣本濃度、預雜交溫度、雜交溫度以及時間等的最適條件?；蛘咭部梢?參照《分子克隆實驗指南》中所述的。然后根據標記信號在芯片上的位置、強度等信息獲取待測信息。若擴增產物用熒光基團標記，也可直接用熒光檢測設備(如激光共聚焦掃描儀Scanarray3000等)獲取待測信息。對核酸樣本進行標記的標記基團包括但不限于地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、熒光素及其衍生生物分子(FITC等)、其他熒光分子(如Cy3、Cy5等)、堿性磷酸酶(AP)、辣根過氧化物酶(HRP)等。這些標記及其標記方法都已是本領域眾所周知的常規(guī)技術，也可以參照王申五主編的《基因診斷技術-非放射性操作手冊》J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾主編，《分子克隆實驗指南》，科學出版社，2002年；馬立人，蔣中華主編.生物芯片.北京化學工業(yè)出版社，2000，1-130。將上述核酸樣本與基因芯片進行雜交時，可以先將基因芯片與預雜交緩沖液進行預雜交。核酸樣本與基因芯片之間的固相雜交按照本領域的經典方法進行，本領域一般人員依據經驗容易確定有關緩沖液、探針和樣本濃度、預雜交溫度、雜交溫度以及時間等的最適條件。然后根據標記信號在基因芯片上的位置、強度等信息獲取待測信息。若擴增產物用熒光基團標記，也可直接用熒光檢測設備(如激光共聚焦掃描儀Scanarray3000等)獲取待測信息。檢測試劑盒本發(fā)明還提供一種用于檢測所述基因的表達情況的試劑盒。所述的試劑盒可用于測定(或區(qū)分)原發(fā)性肝癌的癌組織及癌旁組織。所述的試劑盒中包括本發(fā)明所述的芯片。更優(yōu)選的，所述的試劑盒中還含有用于標記RNA樣品的標記物，以及與所述標記物相對應的底物。此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取RNA、PCR、雜交、顯色等所需的各種試劑，包括但不限于抽提液、擴增液、雜交液、酶、對照液、顯色液、洗液、抗體等。此外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書和/或芯片圖像分析軟件。所述的芯片圖像分析軟件比如BaiO公司的BaiO ArrayDoctor 2. O, Media Cybernetics公司的Arraypro 4.0。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1、RNA樣本的制備組織樣本49對癌和癌旁組織來自于原發(fā)性肝癌患者的手術切除標本，這些標本來自于啟東肝癌研究所和浙江大學第一附屬醫(yī)院。10例正常肝來自于意外死亡者。上述所有標本的取得均通過上海市政府授權的WHO合作組織倫理委員會的同意。組織樣本的臨床資料包括性別、年齡、腫瘤大小、病理 分級(Edmonson)、肝硬化與否、轉移與否、復發(fā)與否、HBV和HCV感染情況等。所有患者術前都沒有接受化療，術后隨訪最長達60個月?；蛐酒蚪M表達譜芯片，采用博奧生物有限公司(http://www.capitalbio.com)的晶芯 人類全基因組寡核苷酸微陣列芯片V1. O (雙通道芯片)，含22000余個基因探針。RNA樣本(組織總RNA提取)1.樣品的收集和保存離體組織切割成小塊后立即置于液氮中速凍，然后移至-80°C冰箱保存。2.組織塊破碎組織塊放于液氮中研磨成粉，每克組織加入ImlTrizol (Invitrogen 公司)。3.總RNA抽提按每毫升Trizol加O. 2ml的氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫孵育2_3分鐘；4°C，10，000g離心15分鐘；將無色上清液移入新的離心管中，加O. 5ml異丙醇，室溫孵育10分鐘，IOOOOg 4°C離心10分鐘;倒掉上清，O. 75ml75%乙醇洗滌，4°C，7，500g離心5分鐘；倒掉上清，室溫干燥RNA沉淀5-10分鐘(勿使RNA完全干燥)，用DEPC處理后的無RNA酶H20溶解沉淀。4.分光光度計法定量RNA，并取少量Total RNA進行電泳，檢查RNA是否降解。實施例2、篩選差異顯著的基因49例癌樣本與正常樣本(10例混合)、49例癌旁樣本與正常樣本(10例混合)分別用cy3和cy5兩種熒光染料標記，與全基因組表達譜芯片上的探針競爭性雜交。雜交后的芯片用晶芯 LuXScan 10K微陣列芯片掃描儀掃描獲得結果圖像，再通過其隨機附帶的LuxScan 3. 0通用微陣列圖像分析軟件對雜交結果定量。由此，得到49對癌樣本對正常樣本(癌/正常，Cancer/Normal,C/N)和癌旁樣本對正常樣本(癌旁/正常,Pericancerous/Normal, P/N)的表達譜數據。將上述49張癌/正常芯片結果和49張癌旁/正常的芯片結果首先用LOWESS (局部加權回歸分析)歸一化。經歸一化后的癌/正常(C/N)、癌旁/正常(P/N)的芯片結果取以2為底的對數(log2X)，使用經配對T檢驗方法(因為癌組織和癌旁組織來源于同一個病人)校正后的隨機方差模型(RVM)篩選得到癌/癌旁(C/P)的顯著性差異基因。為驗證基因差異的顯著性不是由巧合引起的，本發(fā)明人引入上述T檢驗方法后再對數據隨機重排1000次，檢測一個基因在通過前述方法篩選后被檢定為顯著性差異基因的假陽性率(FDR, False Discovery Rate)。在上述統計學方法中，只有P值< 0. 05的基因才會被篩選為顯著性差異基因。分類器(可區(qū)分兩類組織的基因)的篩選與驗證為尋找可區(qū)分兩類樣本(癌與癌旁)的基因，本發(fā)明人使用Matlab軟件的Lib-SVM工具包，使用C-SVC (參數C的支持矢量分類器)和V-SVC (參數V的支持矢量分類器)兩種方法，并各自米用四種核函數(linear kernel,ploy kernel, gauss kernel, tanhkernel),共計8種方法構建SVM分類器。SVM(support vector machine,支持矢量機)分類器是兩類樣本間差異基因的差異倍數的對數值的非線性函數，它尋找能最大化兩類樣本間距離的超平面，因而可以最好地區(qū)分兩類樣本。為檢驗分類器的分類準確度，本發(fā)明人選用在所有的交叉檢驗方法中最穩(wěn)定的10乘10折交叉檢驗法。10折交叉檢驗法，是將樣本總體分成10個子份，每次選I個子份作為測試數據集，其余9個子份作為訓練數據集，重復10次(每次以不同的一個子份作為測試數據集)。如此得到的10個檢驗結果相結合形成對分類器分類準確度的一個評估值。再由8種算法中選擇分類準確度最高的一種作為最佳分類器。為直觀地顯示同組樣本間的相似以及不同組樣本間的相異，本發(fā)明人在3維視效中引入多維標度法(multidimensional scaling,MDS)。MDS算法以被分類器(一組基因)定義的樣本-樣本間相似度矩陣為基礎，確定每一個樣本在低維空間內的位置，并使之適應于3維視效。在此3維空間中，兩樣本越接近，則它們越相似；反之，若兩樣本相距越遠，則它們之間越不同。結果篩選差異基因時以P值<0.05為界。癌樣本對癌旁樣本(癌/癌旁，Cancer/Paracancerous, C/P),共有1469個顯著差異基因,其中顯著上調(癌高于癌旁)的有621個基因，顯著下調(癌低于癌旁)的有848個基因。在進行分類器篩選時，為確保達找到的分類器達到最佳分類精度，以差異基因的P值<0. 000001為界進一步選出差異性尤為顯著的基因，作為分類器候選基因。套入8種SVM分類器算法并使用前述的10乘10折的交叉檢驗來驗證分類器的分類準確度。經1000次數據置換的10乘10折交叉驗證得到分類器后，為測試該分類器的預測能力，本發(fā)明人隨機挑選15個樣本作為未知樣本，以該分類器對每個樣本的組織來源(癌或癌旁)進行預測，觀察其預測準確度。綜合8種算法，由C-SVC(gauss kernel,高斯核函數)這一算法得到的分類準確度最高。這一算法得到的用于區(qū)分癌與癌旁樣本的33個基因組成分類器(見表I)。表1:組成分類器的33個基因
權利要求
1.一種多核苷酸集，其特征在于，所述的多核苷酸集包括編碼以下蛋白的多核苷酸 纖維膠凝蛋白3，CD209分子，雌激素受體1，CD5類分子，犬尿酸3-羥化酶，N-?；D移酶，載酯蛋白F，鐵調素抗菌肽，糖原合成酶2，類固醇-5-alpha-還原酶2，促腎皮質素激素結合蛋白，乙醇脫氫酶4，細胞色素P450家族2亞家族C多肽19，細胞色素P450家族2亞家族C多肽8，凝結因子9，細胞色素P450家族2亞家族C多肽9，金屬硫蛋白1G，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，成膠原結構的巨曬細胞受體，金屬硫蛋白1H, Afamin,甘氨酸-N-?；D移酶，視黃醇脫氫酶16，甘氨酸-N-甲基轉移酶，甲銨乙內酯-高半胱氨酸甲基轉移酶，酪氨酸氨基轉移酶，載脂蛋白A5，絲氨酸脫水酶，分泌型磷蛋白2，丙氨酸-乙醛酸氨基轉移酶2樣蛋白1，細胞色素P450家族26亞家族A多肽1，17-beta羥留類脫氫酶6同源蛋白和分泌型磷蛋白I。
2.如權利要求1所述的多核苷酸集，其特征在于，編碼所述的纖維膠凝蛋白3，CD209分子，雌激素受體1，CD5類分子，犬尿酸3-羥化酶，N-?；D移酶，載酯蛋白F，鐵調素抗菌肽,糖原合成酶2，類固醇-5-alpha-還原酶2，促腎皮質素激素結合蛋白，乙醇脫氫酶4，細胞色素P450家族2亞家族C多肽19，細胞色素P450家族2亞家族C多肽8，凝結因子9，細胞色素P450家族2亞家族C多肽9，金屬硫蛋白1G，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，成膠原結構的巨噬細胞受體，金屬硫蛋白1H，Afamin，甘氨酸-N-?；D移酶，視黃醇脫氫酶16，甘氨酸-N-甲基轉移酶，甲銨乙內酯-高半胱氨酸甲基轉移酶，酪氨酸氨基轉移酶，載脂蛋白A5，絲氨酸脫水酶，分泌型磷蛋白2，丙氨酸-乙醛酸氨基轉移酶2樣蛋白1，細胞色素P450家族26亞家族A多肽1，17-beta羥留類脫氫酶6同源蛋白和分泌型磷蛋白I的多核苷酸分別是序列如 GenBank 登錄號 ΝΜ_003665· 2，ΝΜ_021155. 3，ΝΜ_021155. 3，ΝΜ_005894. 2，ΝΜ_003679.3， ΝΜ_000015.2， ΝΜ_001638.2， ΝΜ_021175.2， ΝΜ_021957.3， ΝΜ_000348.3，ΝΜ_001882.3, ΝΜ_000670.3, ΝΜ_000769.1, ΝΜ_000770.3, ΝΜ_000133.3, ΝΜ_000771.3,ΝΜ_005950.1， ΝΜ_002591.3， ΝΜ_006770.3， ΝΜ_005951.2， ΝΜ_001133.2， ΝΜ_201648.2，ΝΜ_003708.3， ΝΜ_018960.4， ΝΜ_001713.2， ΝΜ_000353.2， ΝΜ_052968.3， ΝΜ_006843.2，ΝΜ_006944. 2，ΝΜ_031279. 2，ΝΜ_000783. 3，ΝΜ_003725. 2 和 ΝΜ_001040058· I 所示的多核苷酸。
3.權利要求1或2所述的多核苷酸集的用途，其特征在于，用于制備測定原發(fā)性肝癌的癌組織及癌旁組織的檢測試劑或試劑盒。
4.如權利要求3所述的用途，其特征在于，所述的試劑是特異性擴增權利要求1或2所述的多核苷酸集中各多核苷酸的引物對；或是特異性識別權利要求1或2所述的多核苷酸集中各多核苷酸的探針。
5.一種用于測定原發(fā)性肝癌的癌組織及癌旁組織的試劑，其是特異性識別序列如GenBank 登錄號 ΝΜ_003665· 2，ΝΜ_021155. 3，ΝΜ_021155. 3，ΝΜ_005894. 2，ΝΜ_003679. 3，ΝΜ_000015.2， ΝΜ_001638.2， ΝΜ_021175.2， ΝΜ_021957.3， ΝΜ_000348.3， ΝΜ_001882.3，ΝΜ_000670.3, ΝΜ_000769.1, ΝΜ_000770.3, ΝΜ_000133.3, ΝΜ_000771.3, ΝΜ_005950.1,ΝΜ_002591.3， ΝΜ_006770.3， ΝΜ_005951.2， ΝΜ_001133.2， ΝΜ_201648.2， ΝΜ_003708.3，ΝΜ_018960.4， ΝΜ_001713.2， ΝΜ_000353.2， ΝΜ_052968.3， ΝΜ_006843.2， ΝΜ_006944.2，ΝΜ_031279. 2,ΝΜ_000783. 3,ΝΜ_003725. 2 或 ΝΜ_001040058.1 所示的多核苷酸的探針，所述的探針的核苷酸序列如SEQ ID NO 1-33任一所示。
6.一種基因芯片，其特征在于，所述的基因芯片包括 固相載體；以及 有序固定在所述固相載體上的探針，所述的探針特異性地對應于序列如GenBank登錄號 ΝΜ_003665· 2，ΝΜ_021155. 3，ΝΜ_021155. 3，ΝΜ_005894. 2，ΝΜ_003679. 3，ΝΜ_000015. 2，ΝΜ_001638.2， ΝΜ_021175.2， ΝΜ_021957.3， ΝΜ_000348.3， ΝΜ_001882.3， ΝΜ_000670.3，ΝΜ_000769.1, ΝΜ_000770.3, ΝΜ_000133.3, ΝΜ_000771.3, ΝΜ_005950.1, ΝΜ_002591.3,ΝΜ_006770.3， ΝΜ_005951.2， ΝΜ_001133.2， ΝΜ_201648.2， ΝΜ_003708.3， ΝΜ_018960.4，ΝΜ_001713.2， ΝΜ_000353.2， ΝΜ_052968.3， ΝΜ_006843.2， ΝΜ_006944.2， ΝΜ_031279.2，ΝΜ_000783. 3，ΝΜ_003725. 2 或 ΝΜ_001040058.1 所示的多核苷酸。
7.如權利要求6所述的基因芯片，其特征在于，所述的探針的核苷酸序列如SEQIDNO 1-33任一所示。
8.權利要求6或7所述的基因芯片的用途，用于制備測定原發(fā)性肝癌的癌組織及癌旁組織的試劑盒。
9.一種測定原發(fā)性肝癌的癌組織及癌旁組織的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有權利要求6或7所述的基因芯片。
10.如權利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包括核酸抽提液、顯色液或雜交液。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測原發(fā)性肝癌的癌組織及癌旁組織的基因標志物。本發(fā)明人通過分析原發(fā)性肝癌患者的癌組織樣本和癌旁組織樣本的全基因組表達譜，用統計學方法，首次從中篩選出33個特異性的基因。經檢驗證明，這些特異性的基因標志物可非常有效地用于區(qū)分原發(fā)肝癌患者的癌組織和癌旁組織。
文檔編號C12Q1/68GK103060351SQ20111032640
公開日2013年4月24日 申請日期2011年10月24日 優(yōu)先權日2011年10月24日
發(fā)明者何祥火, 魏霖, 梁琳慧, 顧健人 申請人:上海市腫瘤研究所