專利名稱：一種與男性生殖功能障礙相關(guān)的精漿微小核糖核酸組合及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種與男性生殖功能障礙相關(guān)的精漿微小核糖核酸(microRNA，簡稱miRNA)組合及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
據(jù)WHO統(tǒng)計，不育(孕)夫婦約占育齡夫婦的10% 15%，其中男性因素約占 30% 40% [1’2]。近年來，男性不育的比例呈上升趨勢，而人們對優(yōu)生優(yōu)育的要求越來越高， 因此為了有效診斷和治療男性不育，尋找臨床價值更高的男性不育標志物迫在眉睫。目前國內(nèi)臨床實驗室通過檢測精液中精子的密度和活力、精漿生化指標、血液中性激素水平、染色體核型和Y染色體微缺失等方法來判斷男性睪丸的生精功能。但目前的臨床檢測手段對許多無、少精子癥的病因無法作出解釋和判斷，給臨床治療帶來了極大的困擾。精液中除精子外，絕大部分是精漿。精漿由附睪、精囊、前列腺、睪丸網(wǎng)及尿道旁腺的分泌物組成，其化學成分中除90 %的水外，還有糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、肽類激素、胺類、有機酸、有機堿以及無機離子等多種成分。研究表明，相對于正常男性，男性生殖功能障礙患者的精液，特別是精漿中的化學成分往往會發(fā)生一定程度的改變。目前開展的常規(guī)精漿檢測項目包括果糖、α -葡糖苷酶、酸性磷酸酶、鋅和肉毒堿以及一些免疫學指標，包括抗精子抗體和抗弓行蟲抗體等， 這些檢測項目僅有助于診斷有限的幾種男性附屬性腺功能異常及個別免疫學因素，不能直接反映睪丸的生精功能和全面評價精液質(zhì)量^。因此亟待找到一種比現(xiàn)有方法更可靠同時又簡單易行的新方法來鑒定男性睪丸的生精功能以及判斷附屬性腺的病理。miRNA是真核生物中一類長約22個核苷酸并參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼單鏈小核糖核酸分子。miRNA通過與靶mRNA的3’端非翻譯序列完全或部分互補結(jié)合，導致靶mRNA降解或轉(zhuǎn)錄后翻譯抑制來調(diào)控靶基因的表達M。它們在進化上高度保守，廣泛存在于動植物細胞中。近五年來，在人類、小鼠、大鼠等多種生物物種中鑒別出數(shù)百種miRNA分子。miRNA存在于幾乎每一種組織細胞中，對各種生命過程包括生殖、發(fā)育都會產(chǎn)生潛在影響，人體30%的蛋白質(zhì)編碼基因都由miRNA調(diào)控[5’6]。睪丸是男性的主要生殖器官，睪丸的精子中也存在miRNA。在各級生精細胞中一些特定的miRNA高度表達，表明這些miRNA參與精子的發(fā)生，對精原細胞的增殖和精子生成起著重要作用[h]。因此，對這些miRNA進行研究就有可能尋找到一些與男性生殖功能，特別是與睪丸生精功能密切相關(guān)的miRNA作為標志物，進而用于男性生殖功能障礙的臨床診斷和預(yù)測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種與男性生殖功能障礙相關(guān)的精漿微小核糖核酸組合。本發(fā)明的另一個目的是提供上述精漿微小核糖核酸組合的應(yīng)用。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)精漿中能夠檢測到高表達豐度的miRNA，特別是發(fā)現(xiàn)其中一組 miRNA的表達異常與生殖功能有關(guān)，例如它們在精漿中的表達水平與睪丸的生精功能密切相關(guān)。因此，本發(fā)明通過研究男性生殖功能障礙過程中精漿miRNA的特異性變化，篩選出在不育及正常生育狀態(tài)下表達差異顯著的精漿miRNA，通過檢測這些miRNA，為診斷男性生殖功能障礙提供新的信息和標志物，對提高男性生殖功能障礙的發(fā)現(xiàn)率，病程監(jiān)控、預(yù)后和藥效評價過程中的針對性以及療效都具有積極的意義。本發(fā)明的上述目的是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種與男性生殖功能障礙相關(guān)的精漿微小核糖核酸組合，該miRNA組合包括下列 miRNA :miR-34c-5p, miR_181a，miR_374b 和 miR-509_5p。所述的精漿微小核糖核酸組合，該miRNA組合還包括miR-146-5p和miR-513a-5p， 進一步，該miRNA組合還包括miR-122。所述的精漿微小核糖核酸組合，其中男性生殖功能障礙是指無精、少精和/或弱 Ib ο所述的精漿微小核糖核酸組合，其中與無精和/或弱精相關(guān)的精漿微小核糖核酸組合包括miR-3^-5p，miR-181a, miR_374b和miR-509_5p。進一步地，該組合為 miR-34c-5p, miR-181a, miR-374b, miR-509_5p，miR-122, miR-146_5p 禾口 miR-513a_5p。所述的精漿微小核糖核酸組合，其中與少精相關(guān)的精漿微小核糖核酸組合包括 miR-34c-5p，miR-181a, miR-374b 和 miR-509_5p。進一步地，該組合為 miR-34c_5p， miR-181a, miR_374b，miR-509_5p，miR-146_5p 和 miR-513a_5p。上述的精漿微小核糖核酸組合在制備診斷或監(jiān)測男性生殖功能障礙的試劑中的應(yīng)用，其中男性生殖功能障礙是指無精、少精和/或弱精。上述miRNA組合的篩選方法包括以下步驟(1)收集生育正常男性以及生殖功能障礙男性的精漿，并提取總RNA ；(2)采用高靈敏度、精確性和高重復性的Solexa測序技術(shù)(Solexa sequencing technology)，對上述RNA進行檢測，初篩選出生殖功能障礙與正常男性精漿中表達差異顯著的一組miRNA ；(3)進一步用適時熒光定量PCR方法驗證。具體來說(結(jié)合

圖1及實施例)，上述篩選方法包括以下步驟(1)分別收集正常生育男性及生殖功能障礙男性的精漿，并提取總RNA，其中所述生殖功能障礙包括無精(非梗阻性)、少精或弱精；( 根據(jù)已知的人全部成熟miRNA，對上述RNA進行測序和檢測，初篩出生殖功能障礙男性與正常男性精漿中表達差異明顯的一組miRNA ； (3)將抽提的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量PCR (TaqMan探針法)方法進一步對初篩出的miRNA進行復篩和驗證，挑選出穩(wěn)定、特異表達的一組miRNA，進行臨床價值評估。本發(fā)明使用的檢測方法可以選自=RT-PCR方法、Solexa測序技術(shù)(Solexa sequencing technology) ,Real-time PCR方法以及生物芯片方法中的一種或幾種，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，采用的試劑均可從商業(yè)途徑得到。例如，精漿中miRNA分子的檢測方法包括以下步驟(1)使用Trizol試劑Gnvitrogen公司)提取精漿總RNA ；(2)通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA ；
(3)根據(jù)人全部成熟體miRNA設(shè)計引物進行PCR反應(yīng)；(4)進行PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳；(5) EB染色后在紫外燈下觀察結(jié)果。在所述步驟( 之后還可以包括下列步驟用TaqMan探針法檢測并比較精漿樣本相對于正常男性精漿中miRNA的量的變化。本發(fā)明提供了一種用于檢測和/或預(yù)測男性生殖功能障礙的miRNA組合，其包括下列miRNA的組合
權(quán)利要求
1.一種與男性生殖功能障礙相關(guān)的精漿微小核糖核酸組合，其特征在于該HiiRNA組合包括下列 miRNA :miR-34c-5p, miR-181a, miR-374b 和 miR-509_5p。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的精漿微小核糖核酸組合，該miRNA組合還包括miR-146_5p和 miR-513a_5p0
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的精漿微小核糖核酸組合，該miRNA組合還包括miR-122。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的精漿微小核糖核酸組合，其特征在于男性生殖功能障礙是指無精、少精和/或弱精。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的精漿微小核糖核酸組合，其特征在于與無精或弱精相關(guān)的精漿微小核糖核酸組合為 miR-34c-5p，miR_181a，miR_374b，miR-509_5p，miR-122, miR-146-5p 和 miR-513a_5p。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的精漿微小核糖核酸組合，其特征在于與少精相關(guān)的精漿微小核糖核酸組合包括 miR-34c-5p，miR-181a, miR-374b 和 miR-509_5p。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的精漿微小核糖核酸組合，其特征在于與少精相關(guān)的精漿微小核糖核酸組合為 miR-34c-5p，miR-181a, miR-374b, miR-509_5p，miR-146_5p 和 miR-513a_5p0
8.權(quán)利要求1、2或3所述的精漿微小核糖核酸組合在制備診斷或監(jiān)測男性生殖功能障礙的試劑中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于男性生殖功能障礙是指無精、少精和/或弱 冃ο
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種與男性生殖功能障礙相關(guān)的精漿微小核糖核酸組合及其應(yīng)用。該miRNA組合包括下列miRNAmiR-34c-5p，miR-181a，miR-374b和miR-509-5p。該組合可用于制備診斷或監(jiān)測男性生殖功能障礙的試劑。
文檔編號C12N15/113GK102286625SQ201110252889
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月30日
發(fā)明者姚兵, 張春妮, 張辰宇, 楊翠華, 王成 申請人:中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院, 南京大學