專利名稱：一種貝萊斯芽孢桿菌及其在番茄枯萎病拮抗中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物防治技術領域，具體的說，本發(fā)明涉及一種貝萊斯芽孢桿菌及其在番茄枯萎病拮抗中的應用的技術領域。
背景技術：
番茄枯萎病是一種嚴重危害蔬菜品質(zhì)和產(chǎn)量的土傳性病害，番茄的幼苗期到成株期期間均受到枯萎病菌的侵染。病菌在土壤中越冬，隨灌溉水及土壤傳播，嚴重時給番茄生產(chǎn)帶來嚴重的損失。以農(nóng)藥為主的防治措施，不僅土壤生態(tài)結構遭到嚴重破壞，而且對人們的身體健康和環(huán)境構成了極大危害，與施用化學農(nóng)藥帶來了的環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留問題相比，生物防治方法具有安全、經(jīng)濟、高效等優(yōu)勢。本研從番茄枯萎病的生物防治方面著手，通過拮抗菌的篩選、應用，進一步減少農(nóng)藥的使用量、提高番茄品質(zhì)，使我區(qū)紅色番茄產(chǎn)業(yè)能夠朝著健康、可持續(xù)的方向發(fā)展。番茄枯萎病是由枯萎病菌引起的一種維管束素疾病，病原菌為Fusarium oxysporum(Schl)f. sp lycopersici[sacc]snyderet et Hansen，稱番茄尖鐮孢菌番茄?；?，屬半知菌亞門真菌，病菌生長發(fā)育適溫27°C 、最高38°C、最低5°C，番茄枯萎病菌的?；詷O強，只危害番茄，為半知菌亞門、鐮孢屬的番茄萎蔫病菌。近年來，番茄枯萎病生物防治及拮抗菌的篩選應用受到關注，張琴芳等利用非致病性鐮刀菌銖(F047)對番茄枯萎病進行防治，發(fā)現(xiàn)F047液體培養(yǎng)的過濾液能有效抑制番茄枯萎病菌孢子的萌發(fā)，抑制萌發(fā)率為81. 7%。田連生等利用木霉菌株T4對番茄枯萎病的防效達93. 3 %，田間直觀效果表現(xiàn)為木霉菌劑處理的植株粗壯，葉片深綠，根系發(fā)達，鮮根重、株高比多菌靈處理的分別增加2. 5,22cm ；而對照番茄苗在接入枯萎病菌后25天全部死亡。郝曉娟等對短短芽孢桿菌JK-2菌株的防治效果進行了測定，結果表明，JK-2對番茄枯萎病的盆栽防效和田間防效分別可達到83. 82%和74. 70%。新疆土地遼闊，光熱資源豐富，是世界上少數(shù)幾個特別適宜種植番茄的地區(qū)，新疆加工番茄種植規(guī)模逐年擴大，總產(chǎn)量逐年提高。新疆番茄加工業(yè)利用這一獨特的資源優(yōu)勢逐步發(fā)展，已成為中國乃至世界番茄加工業(yè)主要的生產(chǎn)地區(qū)，番茄醬成為新疆重要的出口創(chuàng)匯產(chǎn)品。中國成為繼美國、意大利之后世界第三個番茄醬生產(chǎn)及出口大國。但加工番茄在多年種植中仍然受到多種病害的危害，其中番茄枯萎病是發(fā)病較為嚴重的病害之一，嚴重時造成大面積減產(chǎn)。通過農(nóng)田土壤樣品進行拮抗菌的篩選，獲得具有拮抗作用的細菌對于番茄枯萎病菌的解決具有重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術國內(nèi)外還未有針對貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)作為番茄枯萎病拮抗菌的研究的現(xiàn)狀，本發(fā)明旨在提供一種貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)及其作為番茄枯萎病拮抗菌中的應用，通過試驗驗證，采用本發(fā)明提供的貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)具有拮抗作用的細菌對于番茄枯萎病菌的解決具有突
3出的技術效果。本發(fā)明的技術方案通過新疆阜康多年種植番茄的農(nóng)田土壤樣品進行拮抗菌的篩選，獲得具有較強抑菌活性的的菌株，經(jīng)過進一步篩選、馴化選育，獲得一株編號為LYT-5。 通過對所獲菌株進行形態(tài)特征及16S rRNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析，初步確定了其分類地位；同時對該細菌LYT-5的發(fā)酵液的抑菌率、穩(wěn)定性等特性進行了深入研究，為生物防治番茄枯萎病原菌提供看了新的選擇，其拮抗作用對于番茄枯萎病菌的解決具有突出的技術效果。本發(fā)明提供的一株作為番茄枯萎病拮抗菌的貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)，通過在新疆阜康城郊多年種植番茄的農(nóng)田土壤中分離、篩選和培養(yǎng)，獲得一批作為番茄枯萎病拮抗菌的微生物菌株，從中篩選出一株編號為LYT-5的菌株，對于番茄枯萎病具有穩(wěn)定而顯著的拮抗效果，經(jīng)微生物學分類與鑒定，屬于貝萊斯芽孢桿菌 (Bacillus velezensis)。具體的，本發(fā)明提供的一種作為番茄枯萎病拮抗菌的貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)，命名為LYT-5。該菌株已于申請日前保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101。保藏日期是2011年6月27日，保藏號是CGMCC No. 4992。經(jīng)微生物學鑒定為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)。該菌株最適生長條件為溫度30°C，培養(yǎng)基(LB)為蛋白胨(W/V)，酵母膏0.5% (W/V)，氯化鈉1% (W/V)，瓊脂2% (W/V)，ρΗ7· 0-7. 2，121°C滅菌20分鐘；在LB平板上30°C恒溫培養(yǎng)14-16小時，菌落中等大小，呈乳白色，不透明，邊緣不整齊，扁平，表面干燥；顯微觀察其菌體呈短桿狀，芽孢中生；依照第九版《伯杰氏系統(tǒng)細菌學鑒定手冊》(《Bergey，s Manual of Systematic Bacterio-logy》)和《常用細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對LYT-5菌株進行形態(tài)學測定，生理生化檢測確定LYT-5菌株為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)中的成員。 通過 BLAST 同源比對，菌株 LYT-5 的 16S rRNA 序列與 Bacillus velezensis 的 16S rRNA 序列的相似性最高，因而將菌株LYT-5確定為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)。進一步，本發(fā)明一種貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)作為番茄枯萎病拮抗菌的應用。本發(fā)明進一步提供了菌種的保存條件，采用培養(yǎng)基(LB)成分蛋白胨(W/V)， 酵母膏 0.5% (W/V)，氯化鈉 (W/V)，瓊脂 2% (W/V)，pH 7. 0-7. 2，121°C滅菌 20 分鐘。 在其LB培養(yǎng)基斜面上30°C條件下，培養(yǎng)14-16小時，后采用無菌的脫脂牛奶為保護劑，真空冷凍干燥后低溫保存；平時使用保存在LB培養(yǎng)基的斜面上，4°C冰箱保存?zhèn)溆?。通過實施本發(fā)明具體的發(fā)明內(nèi)容，可以達到以下有益效果本發(fā)明提供了分離得到的貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis) CGMCC No. 4992，是一種芽孢桿菌，在番茄枯萎病菌防治方面有較高的應用價值，尤其是能夠針對本地生境分離出的適應本地氣候及生長環(huán)境的拮抗菌對于提高作物產(chǎn)量，減少農(nóng)藥使用量，構建良好的生態(tài)環(huán)境具有積極作用。


圖1所示為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)CGMCC No. 4992的菌落形態(tài)圖。
圖2所示為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis) CGMCC No. 4992的拮抗菌16S rRNA片段PCR擴增結果圖，圖中，M是指標準DNA序列片段大小。圖 3 所示為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)CGMCC No. 4992 的 16S rRNA 系統(tǒng)發(fā)育樹圖。圖4所示為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)CGMCC No. 4992菌懸液對番茄枯萎病菌的抑制作用圖。下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。
具體實施例方式下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。本發(fā)明中涉及到的主要原輔材料、試劑和儀器設備供試病原菌采用番茄枯萎病菌株(Fusarium oxysporumf. sp. radicis-lycopersici)，由 ACCC(中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心)提供；土壤樣品采自新疆阜康城郊多年種植番茄的農(nóng)田土壤，取樣后低溫保存，至實驗室立即進行分離；培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)，LB培養(yǎng)基；MSSPX-250型生化培養(yǎng)箱，MLS-3020高壓蒸汽滅菌鍋，Sff-CJ-IF B型單人雙面凈化工作臺，E360K離心機， 恒溫搖床 HWY-100。PCR 儀 Eppendorf No :5；345，電泳儀 Bio-Rad Mode 200/2. 0，凝膠成像儀United-Bio，GK-330C plus，PCR預混液(TaKafei Biotechnology)，其余試劑均為分析純。本發(fā)明中選用的所有原輔材料、試劑和儀器都為本領域熟知的，其他本領域熟知的一些試劑和設備都可適用于本發(fā)明以下實施方式的實施。實施例一貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)CGMCC No. 4992的分離、篩選及鑒定(1)拮抗菌的分離和篩選梯度稀釋分離法稱取番茄根際土樣IOg放入裝有90mL無菌水并放有玻璃珠的三角瓶中，振蕩20min后靜置20-30S，即為10—1稀釋液，然后利用梯度法分別稀釋成10_2到 10_6的稀釋液。各取0. ImL的稀釋液(10_3、10_4、10_5、10_6)分別涂布于LB培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)，待其長出分離物，對平板上長出的菌落進行劃線分離純化，最后斜面劃線保存?zhèn)溆?。平板對峙法篩選拮抗菌采用平板對峙法略作修改，將番茄枯萎病病原菌在PDA 培養(yǎng)基斜面上活化，待長出菌絲后，打孔器打孔菌餅置于另一新鮮PDA培養(yǎng)基平板中央，
下繼續(xù)培養(yǎng)2d。將分離出的待選拮抗菌株點種于病原菌菌片周圍，每皿接種4個，28°C 恒溫下培養(yǎng)，根據(jù)有無抑菌圈及抑菌帶的大小判斷其拮抗效果。同時對具有拮抗作用的菌株進行二次對峙實驗，篩選出拮抗能力較強的菌株以備后續(xù)實驗。從番茄根際土樣中分離出多株細菌，采用平板對峙法，根據(jù)有無抑菌圈判斷其是否具有拮抗作用，初步篩選出對番茄枯萎病原菌具有一定拮抗能力的菌株。對具有拮抗作用的菌株進行二次對峙實驗，篩選出拮抗能力較強的菌株以備后續(xù)實驗。復篩獲得具有良好拮抗番茄枯萎病菌作用的細菌分離物，命名為LYT-5，培養(yǎng)72 小時其能夠明顯的抑制番茄枯萎病原菌菌絲的生長(見圖1)，經(jīng)多次實驗驗證其抑菌效果較為穩(wěn)定。參見附圖1，獲得的LYT-5菌在LB培養(yǎng)基平板上30°C條件下，培養(yǎng)14_16小時，菌落中等大小，呈乳白色，不透明，邊緣不整齊，扁平，表面干燥；顯微觀察其菌體呈短桿狀，芽孢中生；依照第九版《伯杰氏系統(tǒng)細菌學鑒定手冊》(《Bergey，s Manual of Systematic Bacterio-Iogy)))和《常用細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對LYT-5菌株進行形態(tài)學測定，并對菌株 LYT-5的形狀、大小、生理生化反應進行檢測，本發(fā)明的LYT-5菌株生物學特性如表1所示。(2) PCR擴增拮抗菌16S rRNA序列及其測序挑取少量單菌落，放入盛有25 μ L無菌水的EP管中，100°C煮沸8-lOmin，后迅速放入冰水混合物中5min。離心10000r/min、5min，4°C保存，用時取表1 菌株LYT-5的生理生化特性
項目結果項目結果(NH4)2HPO4+糖、醇發(fā)酵實驗+KNO3一甲基紅實驗一甘露糖+V-P實驗一麥芽糖+淀粉水解實驗+蔗糖一產(chǎn)糊精結晶實驗一可溶性淀粉+纖維素分解實驗+檸檬酸鹽一>酮基乳糖測定實驗+酒石酸鹽一硝酸鹽還原實驗一接觸酶實驗+亞硝酸還原實驗+葡萄糖發(fā)酵實驗發(fā)酵型反硝化實驗一吲哚測定實驗+產(chǎn)氨實驗+氧化酶+脲酶實驗一Tween 20一Tween 80精氨酸二水解酶脂酶實驗+硫化氫實驗+‘牛奶分解實驗胨化苯丙氨酸脫氨酶實驗+注“+”表示陽性；“一”表示陰性。上清。PCR擴增16S rRNA序列。引物 1 (27F) 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘引物 2(1492R) 5' -CAAACTTGGTCATTAGAGGA-3‘PCR擴增反應體系為50 μ L,含有MyL premix 板 2μ L，無菌水 22 μ L。擴增條件94°C 4min,94°C 55s
iTaq,引物11 μ L，引物21 μ L，模 ,53 °C 30s, 72 °C 90s, 30 個循環(huán)；
6720C 7min。擴增產(chǎn)物(約1500bp)經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，PCR產(chǎn)物直接進行雙向測序。(3) 16S rRNA序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析將測序得到的16S rRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進行BLAST分析， 從中獲取相近的16S rRNA序列，用Clustal X軟件和MEGA 4. 1中Neighbor-joining法構建系統(tǒng)進化樹。用細菌16S rRNA序列通用引物27F和1492R PCR擴增LYT-5的16S rRNA序列， PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像參見附圖2所示。經(jīng)測序分析LYT-5擴增的16S rRNA序列長約為1500bp。將LYT-5的16S rRNA序列進行BLAST分析，結果顯示，LYT-5與菌株 Bacillus velezensis LMG 22478 的相似性最高，達到了 99%。將LYT-5的16S rRNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST分析后，構建系統(tǒng)進化樹。 參見附圖3所示，菌株LYT-5與Bacillus velezensis LMG 2M78之間進化距離最短，是 Bacillus velezensis的近似種。結合LYT-5的形態(tài)結構特征及生理生化特性，確定其為貝萊斯芽抱桿菌(Bacillus velezensis)。實施例二 貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)CGMCC No. 4992的生長因子參見如下方式，但是應根據(jù)本發(fā)明提供的貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)CGMCC No. 4992特性確定其具體的生長因子。把菌株LYT-5接到含不同鹽(NaCl)濃度、抗生素(氨芐青霉素)濃度、pH的LB培養(yǎng)基上，置入30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)14小時。再把菌株LYT-5接到LB培養(yǎng)基上，分別置入4°C、 10°C、15°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。結果見表 2。由表3得出，菌株LYT-5最適合生長因子。表2 溫度、pH、鹽、抗生素對菌株LYT-5生長的影響
權利要求
1.一種作為番茄枯萎病拮抗菌的貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)，其保藏編號為 CGMCC No. 4992。
2.如權利要求1所述的貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)CGMCC No. 4992在作為番茄枯萎病拮抗菌的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)CGMCC No.4992及其作為番茄枯萎病拮抗菌中的應用。通過新疆阜康多年種植番茄的農(nóng)田土壤樣品進行拮抗菌的篩選，獲得具有較強抑菌活性的的菌株，經(jīng)過進一步篩選、馴化選育，并對所獲菌株進行形態(tài)特征及16S rRNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析，該菌種的發(fā)酵液的拮抗作用對于番茄枯萎病菌的解決具有突出的技術效果，具有廣泛的應用領域。
文檔編號C12R1/07GK102286412SQ201110252628
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月30日 優(yōu)先權日2011年8月30日
發(fā)明者侯敏, 侯新強, 崔衛(wèi)東, 張慧濤, 楊文琦, 楊蓉, 詹發(fā)強, 龍宣杞 申請人:新疆農(nóng)業(yè)科學院微生物應用研究所