專利名稱：花粉特異性啟動子的分離、鑒定及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物花粉特異性啟動子及其應(yīng)用。具體地，涉及一個Δ8鞘脂脫氫酶基因啟動子的獲得和植物表達(dá)載體的構(gòu)建，以及其在培育植物雄性不育系、花粉消除或大幅度減少的園林綠化植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在高等植物的發(fā)育過程中，雄配子的發(fā)育是個非常復(fù)雜的過程，其調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜。它包括一系列器官分化及嚴(yán)格控制的細(xì)胞及生化變化，同時伴隨著大量基因的協(xié)同表達(dá)。在花粉發(fā)育過程中，大約涉及20000種基因的表達(dá)，其中大約10%為花粉特異表達(dá) [1]，而花粉特異表達(dá)的啟動子對于這些基因在花粉中的特異表達(dá)起到了十分重要的作用。啟動子是RNA聚合酶能夠識別并與之結(jié)合，從而起始基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。啟動子通常位于基因上游，是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件，它基本決定一個基因是否表達(dá)、何時表達(dá)和何處表達(dá)。組織特異性基因的啟動子對該基因的組織特異性表達(dá)起重要作用。利用雜種優(yōu)勢可以顯著的提高作用的產(chǎn)量，改善其品質(zhì)。近十幾年來，雜種優(yōu)勢育種已成為許多作物的主要育種方法。雜交繁育是傳統(tǒng)的將兩種植物的所需遺傳性狀導(dǎo)入一種植物以培育植物新品種的方法。無論對于自花授粉作物或異花授粉作物雜交，為了獲得可靠的性狀一致的雜種，應(yīng)確保親本系之一為雄性不育。產(chǎn)生雄性不育目前有多種技術(shù)，一種方法是人工地或機(jī)械化地除去雌性親本植物的花藥或穗狀雄花，該植物只有通過雄性親本的花粉才具有可育性，然而該方法費(fèi)時費(fèi)力而且不完全可靠。另外一種方法是利用化學(xué)去雄制種，即選用某種化學(xué)藥劑，在植物生長發(fā)育的某一時期噴灑母本，直接殺傷或抑制雄性器官及花粉，造成生理雄性不育，以達(dá)到去雄的目的。但這種方法因去雄不徹底，易受環(huán)境影響，效果不穩(wěn)定，或價(jià)格太昂貴等，在應(yīng)用上也受到限制。基因工程提供了另一種替代方法，來獲得植物雄性不育系。例如在花藥或花粉特異表達(dá)損害細(xì)胞的基因，導(dǎo)致花粉敗育，從而獲得雄性不育系。轉(zhuǎn)基因雄性不育及其恢復(fù)的一個關(guān)鍵是花藥或花粉特異表達(dá)的啟動子，花藥或花粉特異表達(dá)啟動子可以直接驅(qū)動人工雄性不育基因在花粉或花藥中特異表達(dá)而對雌蕊和其它器官沒有影響。對于花粉特異性啟動子的研究不僅有助于在理論上研究花粉發(fā)育過程中基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，而且為創(chuàng)造植物轉(zhuǎn)基因雄性不育奠定了基礎(chǔ)。目前僅從番茄[2’3]、 矮牽牛[4]、玉米[5’6’7]、煙草[8’9]、金魚草_、擬南芥[11]、小麥[12]和大小麥[13]、水稻[14]等少數(shù)植物中分離鑒定了花粉特異表達(dá)的啟動子。利用花藥或花粉特異的啟動子通過基因工程創(chuàng)造雄性不育的方法主要有以下幾種1，借助編碼細(xì)胞毒素基因的特異表達(dá)導(dǎo)致植物的雄性不育。例如，Zhan等利用水稻花粉特異表達(dá)的啟動子與核糖核苷酸酶基因Barnase連接構(gòu)建嵌合基因轉(zhuǎn)化煙草，得到了雄性不育的轉(zhuǎn)基因植株[14]。2，利用反義RNA技術(shù)獲得雄性不育植株。Van der Meei^fchsA 基因的反義RNA基因與花藥特異表達(dá)的啟動子串聯(lián)，轉(zhuǎn)化矮牽牛得到了雄性不育的矮牽牛植株[15]。3，通過提早降解胼胝質(zhì)獲得雄性不育植株。Worrall等將經(jīng)過修飾的β_1，3_葡聚糖酶基因與擬南芥絨氈層特異表達(dá)的啟動子A3和A9重組，使轉(zhuǎn)基因植株在減數(shù)分裂時期表達(dá)過量的β_1，3-葡聚糖酶，從而出現(xiàn)了不同程度的雄性不育現(xiàn)象[16]。在這些方法中，第一種方法的應(yīng)用最為廣泛，而其中用的幾乎都是細(xì)胞毒素基因Barnase基因，該基因已在水稻[14’2°]、煙草[17]、小麥[18]、玉米[19]和油菜[2°_22]等植物上得到了應(yīng)用。油菜(蕓苔屬，十字花科)是世界上最重要的油料作物之一，通過分離油菜花藥或花粉特異性啟動子來創(chuàng)建雄性不育系進(jìn)行雜種優(yōu)勢利用是提高油菜產(chǎn)量和品質(zhì)的有效方法之一，該方面研究不僅有助于深入理解啟動子調(diào)控油菜中基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控機(jī)制及花藥或花粉特異表達(dá)方式的本質(zhì)，同時更重要的是其潛在的巨大農(nóng)業(yè)生產(chǎn)價(jià)值。對于蕓苔屬花粉特異性啟動子的研究鮮有報(bào)道，目前僅有Dzelzkalns等研究發(fā)現(xiàn)蕓苔屬SLG基因上游序列的兩個區(qū)域(-415到-291和-117到-8)具有啟動花粉特異性表達(dá)的活性[23]。白菜型油菜Δ8-鞘脂脫氫酶基因BrDSB是一種花器官特異性表達(dá)的基因，我們進(jìn)一步證實(shí)BrDSB基因的啟動子為花粉特異性表達(dá)的啟動子，且特異性強(qiáng)，它的獲得為通過基因工程的方法獲得植物雄性不育創(chuàng)造了有利條件，為外源基因(對花粉或花粉生成有影響有基因)在花粉中特異性表達(dá)提供基礎(chǔ)。理論上，將此啟動子與細(xì)胞毒素基因如Barnase 基因或花粉發(fā)育的重要基因如chsA(查耳酮合成酶)基因的反義基因相連構(gòu)建載體轉(zhuǎn)化植物都可得到雄性不育轉(zhuǎn)基因植物。另外，利用此方法獲得雄性不育在培育無花粉或花粉顯著減少的園林綠化植物上也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，這可能對花粉過敏癥有一定的緩解作用。因此，對于花粉特異性表達(dá)啟動子的研究具有很大的應(yīng)用價(jià)值。白菜型油菜Δ8-鞘脂脫氫酶基因BrDSB啟動子的序列和功能尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一個花粉特異性表達(dá)啟動子proBrDSB，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，這個啟動子來源于白菜型油菜(Brassica rapa)的DNA片段，該啟動子大小1292bp。本發(fā)明還提供了一種花粉特異性表達(dá)的載體，其特性在于轉(zhuǎn)入了前述的白菜型油菜花粉特異性表達(dá)的啟動子。利用前述的白菜型油菜特異性表達(dá)的啟動子置換植物表達(dá)載體PBI121上的CaMV35S啟動子，構(gòu)建成在啟動子下游含有GUS基因的新的植物表達(dá)載體， 命名為pBI-ProBrDSB。通過真空滲透法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，成功獲得轉(zhuǎn)基因植株。GUS 組織化學(xué)染色鑒定BrDSB基因的啟動子為花粉特異性表達(dá)的啟動子，PBI-ProBrDSB為一種花粉特異性表達(dá)的載體。本發(fā)明的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒，植物病毒載體，直接的DNA轉(zhuǎn)化， 微注射，電穿孔等方式導(dǎo)入植物細(xì)胞。可使用本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化的植物宿主選自由煙草、小麥、水稻、玉米、棉花、油菜、 向日葵、大豆、番茄、蓖麻、芝麻和花生等植物組成的組。本發(fā)明提供的花粉特異性表達(dá)的啟動子及其植物表達(dá)載體，可應(yīng)用于利用基因工程的方法獲得植物尤其是油菜雄性不育系以及培育無花粉或花粉大量減少的園林綠化植物等方面。具體地，一方面，本發(fā)明提供花粉特異性啟動子，其特征在于它的核苷酸序列是(a)序列表中序列1所述的核苷酸序列；或
(b)與(a)所述的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。另一方面，本發(fā)明提供含有權(quán)利要求1所述的啟動子的表達(dá)盒。優(yōu)選地，所述的表達(dá)盒特征在于所述花粉特異性啟動子的下游連接結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、結(jié)構(gòu)基因的反義基因、調(diào)節(jié)基因的反義基因或者能夠干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小RNA。優(yōu)選地，所述花粉特異性啟動子的下游連接Barnase基因、花粉發(fā)育的重要基因如ChsA基因的反義基因等。另一方面，本發(fā)明提供含有上述啟動子的重組表達(dá)載體，其特征在于轉(zhuǎn)入了上述的花粉特異性表達(dá)的啟動子。另一方面，本發(fā)明提供含有上述表達(dá)盒的重組表達(dá)載體。優(yōu)選地，所述的重組表達(dá)載體特征在于是由權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)盒與質(zhì)粒、病毒或轉(zhuǎn)運(yùn)載體所構(gòu)建的重組載體。更優(yōu)選地，所述的重組表達(dá)載體為雙元載體或共合載體。另一方面，本發(fā)明提供宿主細(xì)胞，其包含上述任一方面的重組表達(dá)載體。另一方面，本發(fā)明提供所述的花粉特異性啟動子在培育植物雄性不育系、花粉消除或大幅度減少的植物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述植物是油菜、擬南芥、煙草、玉米、水稻、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、棉花、芝麻和花生。另一方面，本發(fā)明提供獲得所述花粉特異性啟動子的方法，其特征在于是以白菜型油菜(Brassica rapa)的基因組DNA為模板，用序列表中序列2和序列3的核苷酸序列作為一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到。


圖1.含Δ8鞘脂脫氫酶基因BrDSB啟動子的植物表達(dá)載體的構(gòu)建。圖2. BrDSB啟動子驅(qū)動⑶S基因在花藥特異表達(dá)的染色圖(表達(dá)GUS基因的細(xì)胞經(jīng)染色呈藍(lán)色，如箭頭所示)。A 播種7天的擬南芥幼苗；B 成熟擬南芥葉片；C 成熟花朵和未成熟花蕾；D 未成熟果莢和種子。在植株的根、莖、葉和果莢中都檢測不到GUS基因的表達(dá)；在開放花朵中顯示⑶S基因在花藥中表達(dá)。圖3. BrDSB啟動子驅(qū)動⑶S基因在花粉特異表達(dá)的染色圖(表達(dá)GUS基因的細(xì)胞經(jīng)染色呈藍(lán)色，如箭頭所示)。A 單個花藥(箭頭示花粉的位置)；B 單個花粉。
具體實(shí)施例方式下面參考實(shí)施例和附圖詳細(xì)描述本發(fā)明。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解的是， 下述實(shí)施例是舉例說明的目的，其不應(yīng)以任何方式解釋為對本發(fā)明的限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍由后附的權(quán)利要求所限定。實(shí)施例1. Δ8鞘脂脫氫酶基因BrDSB啟動子的獲得1.白菜型油菜基因組DNA的制備以本組種植的白菜型油菜活體植株為材料，取其幼嫩葉片(約IOOmg)，置于研缽中加入液氮充分研磨至材料完全破碎。然后將研磨充分的材料轉(zhuǎn)入1. 5ml離心管中，加入 600 μ 1預(yù)熱的CTAB提提液(參見“精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南” 2001，科學(xué)出版社，顏?zhàn)臃f， 王海林譯)，混勻。65°C水浴30min。加入等體積氯仿，輕柔抽提約5min。于12000rpm室溫離心lOmin。取上清，加入1/2體積異丙醇混勻，室溫放置IOmin沉淀DNA。用槍頭將沉淀出的DNA挑出，加入70%乙醇中洗滌兩次。除去70%乙醇，空氣中吹干。溶于適量滅菌ddH20，-20°C保存。2. Δ8鞘脂脫氫酶基因BrDSB啟動子的克隆設(shè)計(jì)引物從所提取的白菜型油菜DNA中克隆BrDSB啟動子的DNA片段。所用反應(yīng)體系如下PCR 反應(yīng)體系(50 μ 1)DNA 模板1 μ 1 (50ng)Pfu聚合酶(購自全式金公司)0· 5 μ 1IOXbuffer :5 μ 1正向引物2·5μ1反向引物2·5μ1dNTP :2μ 1H2O 36. 5μ 1PCR 程序預(yù)變性 95°C 4min,變性 94°C 30s,退火 50°C 40s,延伸 72°C 2min 30s, 35個循環(huán)，延伸72°C IOmin0PCR產(chǎn)物電泳(1%瓊脂糖凝膠濃度)后切膠回收目的片段(BrDSB啟動子，約 1. 3kb)，連入pEASY-Blunt載體(購自Transgen公司)，進(jìn)行測序。測序結(jié)果為該啟動子長 1292bp，序列參照序列表SEQ ID NO 1中。通過軟件分析，該啟動子具有高等植物啟動子所應(yīng)具有的調(diào)控元件，如TATA盒、CAAT盒等。BrDSB啟動子DNA片段的克隆所用引物見序列表 SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO :3。實(shí)施例2. Δ8鞘脂脫氫酶基因BrDSB啟動子植物表達(dá)載體的構(gòu)建從pEASY-Blunt載體上使用限制性內(nèi)切酶Hind III和BamH I (購自Takara公司)進(jìn)行雙酶切，與同樣雙酶切的pBI121(購自Clontech公司)載體連接，構(gòu)建將pBI121 上的CaMV35S啟動子置換為BrDSB啟動子的植物表達(dá)載體，測序驗(yàn)證，并將其命名為 pBI-proBrD8B，其載體圖見圖2。pBI121載體含有⑶S基因，經(jīng)染色其呈現(xiàn)藍(lán)色，用于檢測啟動子的特異性表達(dá)。實(shí)施例3.轉(zhuǎn)pBI_proBrD8B的擬南芥的獲得1.植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌挑取農(nóng)桿菌GV3101 (Biovector, Inc)單菌落接種在5ml YEP液體培養(yǎng)基(10g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，5g/L NaCl)中，28°C，200rpm，振蕩過夜培養(yǎng)。將2ml過夜培養(yǎng)的菌液加到含有50ml YEP培養(yǎng)基中，28°C，220rpm，振蕩培養(yǎng)至OD600在0. 5-1. 0之間。5000rpm 離心菌液，棄上清，沉淀懸浮于IOml 0.5M NaCl，4°C，5000rpm離心5min，棄上清，用Iml預(yù)冷的20mM CaCl2重懸細(xì)胞。取0. 2ml加入約0. 5-1 μ gpBI-proBrD8B,輕輕混勻，液氮速凍 lmin，37°C熱激5min，加入Iml YEP溶液，28°C振蕩培養(yǎng)2_4h。5000rpm離心菌液，棄上清， 將細(xì)胞重懸于0.2ml YEP培養(yǎng)基中，均勻涂布在含卡那霉素(Kan，50yg/mL)(鼎國昌盛公司)的YEP平板上，28°C培養(yǎng)48h。隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行PCR和酶切驗(yàn)證，獲得含有目標(biāo)基因⑶S植物表達(dá)載體pBI-proBrD8B的農(nóng)桿菌。2.真空滲透法轉(zhuǎn)化擬南芥將成熟擬南芥(生態(tài)型Col-I)種子(購自美國擬南芥生物資源中心ABRC)于4°C 浸泡1天打破休眠，在20%的Blench消毒水中浸泡10-15min后用無菌水漂洗3遍，播種于裝有MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中。16h光照/8h黑暗條件下22°C下培養(yǎng)至其長出2-3 片真葉后，移栽至裝有蛭石(與營養(yǎng)土按2 1混勻)的培養(yǎng)缽中。約4周后頂端出現(xiàn)花蕾，打頂后約5 7日側(cè)枝產(chǎn)生花蕾。去除已開的花，準(zhǔn)備侵染。用IOml新鮮的添加Kan的YEP培養(yǎng)基28°C過夜培養(yǎng)含有目標(biāo)基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，再取5ml轉(zhuǎn)入IOOml新鮮的YEP+Kan的培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)22h。2500rpm離心農(nóng)桿菌菌液，棄上清后，用IOOml轉(zhuǎn)化Buffer (MS基本培養(yǎng)基+蔗糖5% +Silwet-77, pH5. 8) 重懸至OD6tltl = 1. 0后用真空浸透法[24]浸漬擬南芥花序。3.轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選和鑒定 將收獲的Ttl代種子于4°C浸泡3天打破休眠，在20%的Blench消毒水中浸泡10 15min后用無菌水漂洗3遍，播種于含Kan (50 μ g/mL)抗生素的MS培養(yǎng)基上。16h光照/8h 黑暗下22°C培養(yǎng)10天左右可見子葉伸出，此時可見抗性植株呈深綠色，子葉健康。而未轉(zhuǎn)化植株呈黃色或白色，子葉萎蔫。此時將陽性植株移栽至裝有蛭石和營養(yǎng)土的培養(yǎng)缽中自然培養(yǎng)至收獲。重復(fù)篩選獲得T2代植株及種子。將T2R種子繼續(xù)篩選，后代都為抗性植株的則為純合株系。實(shí)施例4.轉(zhuǎn)基因植株的⑶S檢測將T2代轉(zhuǎn)基因純合植株的組織浸泡于染色緩沖液中(含lOmmol/LEDTA 二鈉鹽， IOOmmol/L NaP04pH 7. 0,0. 5mM K4Fe(CN)6,0. 5mMK3Fe (CN) 6,0. 1% Triton X-100，500 μ g/mL X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid, eyelo-hexylammonium salt)，200mbar抽真空15min，使染液能浸入到組織的內(nèi)部，37°C浸泡過夜。移去染液，用 0. lmol/L的磷酸緩沖液沖洗2-3次。再用70%的乙醇脫色，更換乙醇2_3次。染色的組織或器官4°C下保存于0. lmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)的溶液中。至少對三個以上株系進(jìn)行 ⑶S染色鑒定，圖2和圖3示具有代表性的結(jié)果。參考文獻(xiàn)1. Willing RP, Mascarenhas JP. (1984). Analysis of the complexity and diversity of mRNAs from pollen and shoots of tradescantia. Plant Physiology, 75 865-868.2. Twell D, Yamaguchi J, McCormick S. (1990). Pollen-specific gene expression in transgenic plants !coordinate regulation of two different tomato gene promoters during microsporogenesis. Development, 109(3) :705_713.3.Twell D, Yamaguchi J, Wing RA, Ushiba J, McCormick S. (1991).Promoter analysis of genes that are coordinately expressed during pollen development reveals pollen-specific enhancer sequences and shared regulatory elements. Genes and Development, 5 :496_507.4. van Tunen AJ, Mur LA, Brouns GS, Rienstra JD, Koes RE, Mol JNM. (1990). Pollen—and anther-specific chi promoters from Petunia :tandem promoter regulation of the chiA gene. The Plant Cell, 2 :393-401.5. Hamilton DA,Roy M,Rueda J,Sindhu RK,Sanford J,Mascarenhas JP (1992). Dissection of a pollen-specific promoter from maize by transient transformation assays. Plant Molecular Biology, 18 :211_218.
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權(quán)利要求
1.花粉特異性啟動子，其特征在于它的核苷酸序列是(a)序列表中序列1所述的核苷酸序列；或(b)與(a)所述的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求1所述的啟動子的表達(dá)盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的表達(dá)盒，其特征在于所述花粉特異性啟動子的下游連接結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、結(jié)構(gòu)基因的反義基因、調(diào)節(jié)基因的反義基因或者能夠干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小RNA。
4.含有權(quán)利要求1所述啟動子的重組表達(dá)載體，其特征在于轉(zhuǎn)入了權(quán)利要求1所述的花粉特異性表達(dá)的啟動子。
5.含有權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)盒的重組表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體是由權(quán)利要求2或3所述的表達(dá)盒與質(zhì)粒、病毒或轉(zhuǎn)運(yùn)載體所構(gòu)建的重組載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)載體，其特征在于所述重組表達(dá)載體為雙元載體或共合載體。
8.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求4-7任一所述的重組表達(dá)載體。
9.權(quán)利要求1所述的花粉特異性啟動子在培育植物雄性不育系、花粉消除或大幅度減少的植物中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述植物是油菜、擬南芥、玉米、水稻、煙草、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、棉花、芝麻和花生。
10.一種權(quán)利要求1所述的花粉特異性啟動子的獲得方法，其特征在于是以白菜型油菜(Brassica rapa)的基因組DNA為模板，用序列表中序列2和序列3的核苷酸序列作為一對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種花粉特異性啟動子及其應(yīng)用。該啟動子來源于白菜型油菜(Brassica rapa)，是一個Δ8鞘脂脫氫酶基因的上游序列。本發(fā)明的啟動子是一個穩(wěn)定的特異性高的花粉特異性啟動子。利用本發(fā)明的啟動子可以在花粉中啟動表達(dá)各種基因，可用于培育雄性不育作物品種和培育消除或大幅度減少花粉的園林綠化植物等。
文檔編號C12N15/113GK102286486SQ20111023047
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月12日
發(fā)明者宋麗英, 尹維波, 李書粉, 胡贊民, 陳宇紅 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所