專利名稱：一種用于白僵菌群落結(jié)構(gòu)分析的dgge引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于白僵菌群落結(jié)構(gòu)分析的DGGE引物，可用于白僵菌群落結(jié)構(gòu)的DGGE鑒定分析。
背景技術(shù)：
白僵菌(Beauveria)屬半知菌綱叢梗孢目叢梗孢科，是自然界廣泛存在的一類真菌，其中包含非常優(yōu)良的昆蟲病原真菌，如球孢白僵菌(Beauveria bassiana Vuillemin)、布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)等，已被成功開發(fā)成多種商品制劑用于農(nóng)林害蟲的生物防治。我國是生產(chǎn)和應(yīng)用白僵菌殺蟲劑的第一大國，每年施用面積約50萬hm2，白僵菌已在南方大面積用于防治林區(qū)松毛蟲，并且在東北地區(qū)防治玉米螟取得了顯著效果。白僵 菌的防效與其在田間土壤中的存活和優(yōu)良菌株在白僵菌群落中所占的比例有很大關(guān)系，對土壤中白僵菌的研究，傳統(tǒng)方法依賴于選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)或大蠟螟誘集法，這兩種方法耗時又費力?；赑CR的分子檢測技術(shù)可對土壤中白僵菌的種類、數(shù)量和分布進(jìn)行研究，卻無法對白僵菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。變性梯度電泳(DGGE)技術(shù)由Fischer和Lerman于1979年最先提出，是用于檢測DNA突變的一種電泳技術(shù)。Myers于1985年首次在DGGE中使用GC發(fā)夾技術(shù)，可防治DNA片段在DGGE膠中完全解鏈，DNA片段中每個堿基處的序列差異基本都能被區(qū)分開，使DGGE技術(shù)日臻完善。與傳統(tǒng)的微生物研究方法相比，DGGE的一大優(yōu)點是能夠快速、準(zhǔn)確的鑒定各種樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律和種群動態(tài)，無需對所研究的微生物進(jìn)行純種培養(yǎng)。DGGE的另一優(yōu)點是能夠同時對比分析大量的樣品，既可比對分析不同微生物群落間的差異，也可研究同一微生物群落隨時間和外部環(huán)境壓力的變化過程。因此，DGGE技術(shù)已成為微生物群落遺傳多樣性和動態(tài)分析的強有力工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決目前缺乏引物用于白僵菌群落結(jié)構(gòu)DGGE分析的問題，而提供一種用于白僵菌群落結(jié)構(gòu)DGGE分析的引物。本發(fā)明用于白僵菌群落結(jié)構(gòu)DGGE分析的引物為正向引物dBeaF(5’-TAACCCTTCTGTGAACCTACCTATC-3，)和反向引物 dBeaR-gc (5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCGCCACTCCATTTCAG-3，)。本發(fā)明的引物是根據(jù)白僵菌屬真菌核糖體rDNA的序列堿基存在差異的特點而設(shè)計的。應(yīng)用本發(fā)明的引物dBeaF/R-gc可擴增出長度為378bp的目的片段，通過DGGE分析PCR擴增產(chǎn)物可提供樣品中白僵菌群落結(jié)構(gòu)的信息。


圖I為采用引物dBeaF/R-gc對樣品的PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜。M泳道為BM2000,1-3號泳道為樣品PCR擴增產(chǎn)物，4號泳道為空白對照。
圖2為圖I中PCR擴增產(chǎn)物的DGGE電泳圖譜。
具體實施例方式土壤樣品DNA提取稱取5g土壤樣品和Ig玻璃珠至50mL離心管，加入13. 5mL DNA提取液(O. ImoI/L Tris base,O. lmol/L EDTA，0. lmol/L磷酸鈉，I. 5mol/L NaCl, 1%CTAB,ρΗ8· 0)混合，加入 100 μ L 蛋白酶 K(10mg/mL)，置搖床，225r/min，37。。搖 30min ;加入 I. 5mLSDS (20% )，置水浴鍋，65°C水浴2h，每隔15 30min緩慢顛倒離心管數(shù)次；取出后室溫，3000rpm離心5min,收集上清液至新的50mL離心管；土壤樣品沉淀繼續(xù)加4. 5mL DNA提取液和O. 5mL SDS (20%),渦旋10s，置水浴鍋，65°C水浴lOmin，收上清液，與前一次上清液合并，重復(fù)上述操作，收集上清液與前兩次上清合并；上清液加入等體積氯仿-異戊醇(體積比為24 : I), 12000rpm離心5min ;將水相轉(zhuǎn)至5OmL離心管,加入O. 6倍體積的異丙醇，室溫沉淀Ih,室溫16000rpm離心20min ;收核酸沉淀,加入70%乙醇(冷)，洗漆沉淀兩次，重懸于TE緩沖液，最終體積500 μ L0
樣品DNA中18S-ITS1-5. 8S-ITS2-28S rDNA部分片段的PCR擴增使用引物對為dBeaF(5，-TAACCCTTCTGTGAACCTACCTATC-3，)和 dBeaR-gc(5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCGCCACTCCATTTCAG-3’)對樣品中的 18S-ITS1-5. 8S-ITS2-28S rDNA 部分片段進(jìn)行PCR擴增。PCR擴增體系為25 μ L由O. 5 μ L DNA模板(約IOng)、0. 5 μ L正向引物 dBeaF(lOyM)、0· 5μ L 反向引物 dBeaR-gc (10 μ Μ)、0· 5μ L dNTPs (I Ommo I/L)、2· 5μ L10XPCR buffer (帶 MgCl2)、O. 2 μ ITaqDNA 聚合酶(5U/μ L)，滅菌雙蒸水補足 25 μ L。PCR擴增反應(yīng)條件為預(yù)變性940C 3min，變性94°C 30s，退火59. 5°C 30s，延伸72°C 45s，共35個循環(huán)，72°C延伸5min，4°C保存。PCR擴增產(chǎn)物見圖I。PCR擴增產(chǎn)物的DGGE分析丙烯酰胺凝膠濃度為8 %，變性梯度為50_70 % (由7mol/L尿素和質(zhì)量濃度40%去離子甲酰胺組成的水溶液作為100%變性劑)，PCR產(chǎn)物上樣量為200ng。DGGE電泳條件為電壓80V，60°C下電泳12h。電泳完畢后用I X SYBR-Green染色30min，通過Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。PCR擴增產(chǎn)物的DGGE見圖2。DGGE凝膠中相關(guān)條帶回收、克隆和測序用滅菌刀片將相關(guān)條帶切下，放入I. 5mL滅菌離心管，搗碎，加入60 μ L無菌水去離子水清洗，后加入60 μ L無菌水去離子于4°C靜置過夜。取上清液2 μ L做DNA模板進(jìn)行PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物與T載體連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行藍(lán)白斑挑選。選擇樣品基因組的PCR產(chǎn)物作為參照，DGGE比對陽性克隆子PCR產(chǎn)物的相對位置，淘汰假陽性克隆子。陽性克隆子送上海生工測序，測序后登錄Genbank進(jìn)行序列比對。
權(quán)利要求
1. 一種用于白僵菌群落結(jié)構(gòu)分析的DGGE引物，其特征在于用于白僵菌群落結(jié)構(gòu)分析的DGGE引物為正向引物 dBeaF :5’ -TAACCCTTCTGTGAACCTACCTATC-3’反向引物 dBeaR-gc :5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCGCCACTCCATTTCAG-3，。
全文摘要
一種用于白僵菌群落結(jié)構(gòu)DGGE分析的引物，它涉及一對用于白僵菌群落結(jié)構(gòu)分析的DGGE引物。本發(fā)明解決了目前缺乏引物用于白僵菌群落結(jié)構(gòu)DGGE分析的問題。本發(fā)明用于白僵菌群落結(jié)構(gòu)DGGE分析的引物為正向引物dBeaF(5’-TAACCCTTCTGTGAACCTACCTATC-3’)和反向引物dBeaR-gc(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCGCCACTCCATTTCAG-3’)。
文檔編號C12R1/645GK102925540SQ201110226779
公開日2013年2月13日 申請日期2011年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月9日
發(fā)明者張艷軍, 謝明 申請人:張艷軍