專利名稱：一種用于擴增球孢白僵菌的特異性引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于擴增球孢白僵菌的特異性引物，可用于對土壤樣品中球孢白僵菌的分子檢測。
背景技術(shù)：
球抱白僵菌(Beauveria bassiana Vuillemin)屬半知菌綱叢梗抱目叢梗抱科白 僵菌屬，是最常見的昆蟲病原真菌之一，寄主范圍廣、致病力強，對人、畜、林木作物無毒害，不傷害天敵，不污染環(huán)境，已被成功開發(fā)成多種商品制劑用于農(nóng)林害蟲的生物防治。目前，我國是生產(chǎn)和應(yīng)用白僵菌殺蟲劑的第一大國，每年施用面積約50萬hm2，球孢白僵菌已在南方大面積用于防治林區(qū)松毛蟲，并且在東北地區(qū)防治玉米螟取得了顯著效果。球孢白僵菌的防效與其田間土壤中的存活有很大關(guān)系，對土壤中球孢白僵菌的研究，傳統(tǒng)方法依賴選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)或大蠟螟誘集法，但是這兩種方法耗時費力。隨著分子生物學的飛速發(fā)展，基于PCR的分子檢測技術(shù)已在農(nóng)業(yè)微生物研究中應(yīng)用越來越普遍。利用PCR檢測技術(shù)對土壤中球孢白僵菌進行種類、數(shù)量和分布的研究將極大地促進該蟲生真菌在害蟲綜合防治體系中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決目前缺乏引物從土壤樣品DNA中擴增出球孢白僵菌靶標序列的問題，而提供一種用于擴增球孢白僵菌的特異性引物。本發(fā)明用于擴增球孢白僵菌的特異性引物為正向引物5，-TCAACTCCCTAACCCTTC-3 ’和反向引物 5 ’ -GCTGGAATACAAGAGTTTGA-3 ’。將本發(fā)明所用引物對命名為qBeaF/BeaR。本發(fā)明的引物是根據(jù)真菌核糖體rDNA的序列堿基存在差異的特點而設(shè)計的。應(yīng)用本發(fā)明的引物BeaF/BeaR可從各類樣品DNA中直接擴增出長度為115bp的球孢白僵菌目的片段。


圖I為實施例I中qBeaF/BeaR弓丨物對6種屬真菌DNA擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。圖2為實施例2中qBeaF/BeaR弓丨物對土壤樣品DNA擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。
具體實施例方式實施例I分別以球抱白僵菌(Beauveria bassiana)、布氏白僵菌(Beauveriabrongniartii)、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)、玫煙擬青霉(Paecilomycesfumosoroseus)、臘階輪枝菌(Verticillium Iecanii)、尖鍵抱菌(Fusarium oxysporum)和鏈格孢菌(Alternaria alternata) 6個屬真菌DNA為模板進行引物BeaF/BeaR的特異性驗證試驗。 PCR擴增體系為25 μ L由O. 5 μ L DNA模板(約IOng)、0. 5 μ L正向引物qBeaF(lOyM)、0· 5 μ L反向引物 qBeaR(10 μ Μ)、0· 5μ L dNTPs (10mmol/L)、2· 5μ L IOXPCRbuffer (with MgC12) ,0. 2μ I TaqDNA 聚合酶(5U/μ L)，滅菌雙蒸水補足 25 μ L。PCR 擴增反應(yīng)條件為預(yù)變性94°C 3min,變性94°C 30s,退火55°C 30s,延伸72°C 30s，共35個循環(huán)，72°C 延伸 5min，4°C 保存。將本實施方式擴增出的序列進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖I所示，圖I中M泳道為標準BM2000，I號泳道為不含DNA空白對照的擴增結(jié)果，2-8號泳道分別為含有球抱白僵菌(Beauveria bassiana)、布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)、玫煙擬青霉(Paecilomyces fumosoroseus)、臘階輪枝菌(Verticillium Iecanii)、尖鍵抱菌(Fusarium oxysporum)和鏈格抱菌(Alternariaalternata)DNA的擴增結(jié)果。從圖I中可以看出本實施方式用于擴增球孢白僵菌的特異性引物BeaF/BeaR能夠準確的擴增出球孢白僵菌的靶標序列片段，而未能從近緣真菌DNA和空白對照中擴增出核酸片段。將2號泳道對應(yīng)的序列片段與T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞測序，測序結(jié)果為序列長度為115bp，并且經(jīng)blast分析，為球孢白僵菌(Beauveria bassiana)的特異序列。實施例2應(yīng)用引物qBeaF/BeaR對6份土樣(采自河北廊坊市)DNA進行PCR擴增試驗。PCR擴增體系為25yL 由 0.5yL DNA 模板(約 IOng)、0· 5 μ L 正向引物 BeaF(10 μ Μ)、0· 5 μ L反向引物 BeaR(10yM)、0.5yL dNTPs (10mmol/L)、2· 5 μ L 10XPCR buffer (with MgCl2)、0. 2μ I TaqDNA聚合酶(5U/μ L)，滅菌雙蒸水補足25 μ L。PCR擴增反應(yīng)條件為預(yù)變性940C 3min，變性 94°C 30s，退火 55°C 30s，延伸 72°C 30s，共 35 個循環(huán)，72°C延伸 5min，4°C保存。將本實施方式擴增出的序列進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖2所示，圖2中M泳道為標準BM2000，16號泳道分別為河北廊坊市土壤樣品DNA的擴增結(jié)果，7號泳道為不含DNA空白對照的擴增結(jié)果。從圖2中可以看出本實施方式用于擴增球孢白僵菌的特異性引物BeaF/BeaR能夠準確的從所有土壤樣品DNA中擴增出球孢白僵菌的靶標序列片段。隨機挑選I和4號泳道對應(yīng)的序列片段分別與T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞測序，測序結(jié)果為序列長度為115bp,并且經(jīng)blast分析,為球孢白僵菌(Beauveriabassiana)的特異序列。
權(quán)利要求
1.一種用于擴增球孢白僵菌的特異性引物，其特征在于用于擴增球孢白僵菌的特異性引物為 正向引物 qBeaF :5’ -TCAACTCCCTAACCCTTC-3’ 反向引物 qBeaR :5’ -GCTGGAATACAAGAGTTTGA-3’
全文摘要
一種用于擴增球孢白僵菌的特異性引物，它涉及一對用于擴增球孢白僵菌的特異性引物。本發(fā)明解決了目前缺乏引物從土壤樣品DNA中擴增出球孢白僵菌靶標序列的問題。本發(fā)明用于擴增球孢白僵菌的特異性引物為qBeaF(5’-TCAACTCCCTAACCCTTC-3’)和qBeaR(5’-GCTGGAATACAAGAGTTTGA-3’)。本發(fā)明的引物能夠準確擴增出球孢白僵菌目的片段。
文檔編號C12Q1/68GK102925539SQ20111022677
公開日2013年2月13日 申請日期2011年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月9日
發(fā)明者謝明, 張艷軍 申請人:謝明