專利名稱：免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達(dá)載體，及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于基因工程和生物治療的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，自20世紀(jì)90年代以來肝癌的年病死率已上升為城市和農(nóng)村惡性腫瘤病死率的第二和第一位。而對于肝癌的治療，目前仍然以放射療法、化學(xué)療法和手術(shù)治療為主，其中外科治療起了決定性的作用，特別是手術(shù)切除仍占主導(dǎo)地位.但由于肝癌惡性程度高，極易發(fā)生早期播散和轉(zhuǎn)移等原因，上述療法都有一定的局限性。近年來隨著分子生物學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)等基礎(chǔ)研究向肝癌領(lǐng)域的滲透，許多學(xué)者逐漸把基因治療和生物治療引入到肝癌治療中，RNAi技術(shù)就是研究的比較廣泛的一種。近年來，科學(xué)家們采用生物信息學(xué)等技術(shù)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了與肝癌的發(fā)生以及發(fā)展密切相關(guān)的一些原癌基因，但并未見有關(guān)Pim-3這樣一種原癌基因的報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的發(fā)明人尋找到了 Pim-3這樣一種原癌基因，該基因在人的肝癌組織以及癌旁組織中的表達(dá)明顯高于正常肝組織，Pim-3能通過磷酸化一些促凋亡蛋白如Bad使其失活，從而抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，因此采用RNAi技術(shù)去靶向沉默 Pim-3，就會在一定程度上延緩肝癌的發(fā)展進(jìn)程，達(dá)到治療肝癌的目的；而另一方面，在腫瘤的發(fā)生過程中，腫瘤細(xì)胞可以通過許多機(jī)制，比如增加IL-10等抑制性細(xì)胞因子的產(chǎn)生來逃逸免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，使機(jī)體免疫系統(tǒng)處在相對低下的狀態(tài)，本發(fā)明就找到某些RNA序列， 他們能夠激活免疫系統(tǒng)，進(jìn)而引起自身免疫系統(tǒng)對于肝癌細(xì)胞的殺傷以及清除。故設(shè)計并構(gòu)建能夠表達(dá)靶向沉默Pim-3基因的RNA和能夠激活免疫系統(tǒng)的RNA這樣一種雙表達(dá)載體，就能達(dá)到對肝癌雙管齊下的治療作用。基于上述發(fā)現(xiàn)，針對肝癌靶基因Pim-3的特點，本發(fā)明提供了一種免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達(dá)載體，及其在治療肝癌過程中的應(yīng)用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達(dá)載體，是由轉(zhuǎn)錄shRNA 的DNA序列、轉(zhuǎn)錄ssRNA的DNA序列與pTZTO+Ι載體組成的重組載體，其序列如seq. 12所不。所述免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達(dá)載體是通過以下方法構(gòu)建制得(1)針對Pim-3基因的序列，通過shRNA設(shè)計軟件設(shè)計合成shRNA相對應(yīng)的DNA序列，并在序列的兩端添加雙酶切位點Ml I和)(bal I，得seq. 1-8所示的序列；(2)將步驟(1)制得的序列與PTZU6+1載體連接，構(gòu)建pTZU_shRNA重組載體；分別表示為 pTZU-shRNAl、pTZU-shRNA2、pTZU_shRNA3、pTZU_shRNA4 ；(3)通過km-qPCR和Real-Time PCR對步驟O)中四對shRNA的沉默作用進(jìn)行初步篩選，篩選得到沉默作用較明顯的載體，如圖2所示；(4)將步驟(3)中沉默作用較明顯的pTZU-shRNAl載體進(jìn)行EcoR I和Hind III 雙酶切，得到TO+shRNA的表達(dá)框，其序列如seq. 9所示；(5)根據(jù)能夠激活免疫系統(tǒng)的RNA病毒序列，設(shè)計編碼具有潛在免疫刺激作用序列的RNA的DNA序列，并在序列的兩端添加雙酶切位點序列EcoR I和BamH I，得seq. 10、 11所示的序列；(6)將步驟(5)制得的序列與pSIREN載體連接，構(gòu)建pSIREN-ssRNA重組載體；(7)將步驟(6)中制得的重組載體進(jìn)行EcoR I單酶切，得線性片段；(8)將步驟(4)制得的TO+shRNA表達(dá)框和步驟(7)制得的線性片段平端化，連接， 并經(jīng)過菌落PCR篩選同時表達(dá)shRNA和ssRNA的雙表達(dá)載體，序列見seq. 12。本發(fā)明的免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染小鼠肝癌H印al-6細(xì)胞，24h后檢測，通過km-qPCR和flfestern-blot檢測發(fā)現(xiàn)能夠下調(diào)H印al_6 細(xì)胞中Pim-3的表達(dá)；轉(zhuǎn)染!fepal-6細(xì)胞，24h后檢測，發(fā)現(xiàn)能夠明顯增加!fepal-6細(xì)胞的凋亡；轉(zhuǎn)染H印al-6細(xì)胞，能明顯上調(diào)H印al-6細(xì)胞上清中I型干擾素(IFN- α和IFN- β ) 的分泌，由此可見，本發(fā)明的免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達(dá)載體有可能成為治療肝癌的新的生物學(xué)手段。上述實驗方法，如無特別說明，均采用本領(lǐng)域常規(guī)實驗方法，上述實驗試劑均為市
售產(chǎn)品。本發(fā)明利用構(gòu)建的shRNA和ssRNA的雙表達(dá)載體能夠誘導(dǎo)細(xì)胞因子的分泌，相較于shRNA的表達(dá)載體，雙表達(dá)載體對H印al-6細(xì)胞具有更好的抑制作用，能夠明顯的抑制 Hepal-6細(xì)胞的增殖，并且能夠增強(qiáng)小鼠脾淋巴細(xì)胞對H印al_6細(xì)胞的殺傷，具有較好的應(yīng)用前景。


圖1為km-qPCR檢測Pim_3基因在小鼠肝癌細(xì)胞H印al_6和H22以及正常的小鼠肝細(xì)胞BNL. cl2中的表達(dá)示意圖。圖2為對shRNA的沉默作用進(jìn)行初步篩選的示意圖，其中A為km-qPCR的檢測結(jié)果，B為Real-time PCR的檢測結(jié)果。圖3為pSIREN-shRNA和雙表達(dá)載體均能夠明顯的下調(diào)H印al_6細(xì)胞Pim_3基因的表達(dá)示意圖。圖4為pSIREN-shRNA和雙表達(dá)載體均能夠明顯的下調(diào)H印al_6細(xì)胞Pim_3蛋白的表達(dá)示意圖。圖5為雙表達(dá)載體能夠明顯上調(diào)!fepal-6細(xì)胞上清中I型干擾素的分泌表達(dá)，其中A為IFN-α的分泌水平，B為IFN-β的分泌水平。圖6為雙表達(dá)載體能夠更明顯的增加H印al-6細(xì)胞的凋亡，其中Armexin V和PI 雙陽性的細(xì)胞即處于晚期凋亡，如圖所示用pSIREN-shRNA和雙表達(dá)載體轉(zhuǎn)染!fepal-6細(xì)胞后，發(fā)生凋亡的細(xì)胞比例明顯增加。
圖7為雙表達(dá)載體能夠更明顯的抑制!fepal-6細(xì)胞的增殖。
具體實施例方式以下實施例將有助于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。實施例中的實驗方法，如無特別說明，均采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)，實驗試劑均為市售產(chǎn)品。實施例1，一種雙表達(dá)載體構(gòu)建(1)針對Pim-3基因的序列，設(shè)計針對Pim_3基因的特異性沉默RNA及相對應(yīng)的 DNA序列，并且在序列的兩端添加雙酶切位點序列Ml I和)(bal I，退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)，序列見 seq. 1-8 ；(2)將pTZU6+l載體進(jìn)行Ml I和)(bal I的雙酶切，并回收載體骨架；(3)將步驟(1)制得的序列與步驟(2)制得的PTZU6+1載體連接構(gòu)建成 pTZU-shRNA ；分別表示為 pTZU-shRNAl、pTZU-shRNA2、pTZU_shRNA3、pTZU_shRNA4。(4)利用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000(購自invitrogen)將步驟(3)中構(gòu)建的pTZU-shRNA轉(zhuǎn)染到小鼠的肝癌細(xì)胞系H印al-6，并檢測Pim_3基因的表達(dá)水平，結(jié)果表明 pTZU-shRNA 1具有更明顯的沉默能力(如圖2所示)。將pTZU-shRNAl進(jìn)行EcoR I和Hind III雙酶切，并回收TO+shRNA的表達(dá)框，其序列見seq. 9 ；(5)根據(jù)能夠激活免疫系統(tǒng)的RNA病毒序列，設(shè)計編碼具有潛在免疫刺激作用序列的RNA的DNA序列，并在序列的兩端添加雙酶切位點序列EcoR I和BamH I，退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)ssRNA，序列見seq. IOUl ；(6)將pSIREN載體進(jìn)行EcoR I和BamH I雙酶切，并回收載體骨架；(7)將步驟(5)制得的ssRNA序列和步驟(6)制得的pSIREN載體鏈接，構(gòu)建成 pSIREN-ssRNA ；(8)將步驟(7)中制得的重組載體進(jìn)行EcoR I單酶切，得線性片段；(9)將步驟(4)制得的pTZU-shRNAl表達(dá)框和步驟(8)制得的線性pSIREN-ssRNA 平端化，連接。篩選得到同時表達(dá)shRNA和ssRNA的雙表達(dá)載體，序列見seq. 12。(10)用陽離子脂質(zhì)體lipofectamine2000(購自invitrogen)將雙表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到小鼠的肝癌細(xì)胞系H印al-6，并檢測細(xì)胞因子I型干擾素的基因水平和蛋白水平，如圖1 和圖5所示，結(jié)果表明其能夠激活免疫系統(tǒng)，具有刺激作用。2雙表達(dá)載體的應(yīng)用①沉默作用pSIREN-shRNA和雙表達(dá)載體轉(zhuǎn)染小鼠的肝癌細(xì)胞系H印al-6 24h 后，提取RNA和細(xì)胞的總蛋白，分別檢測Pim-3的基因水平和蛋白水平，發(fā)現(xiàn)兩者均有很好的沉默作用(如圖3和圖4所示)。②免疫刺激作用雙表達(dá)載體轉(zhuǎn)染小鼠的肝癌細(xì)胞系H印al-6 24h后，在基因水平和蛋白水平檢測I型干擾素的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)雙表達(dá)載體能明顯上調(diào)ifepal-6上清中IFN-α 和IFN-β的表達(dá)，如圖1和圖5所示。由此綜合前面兩個結(jié)果，認(rèn)為該載體的構(gòu)建是成功的。
③體外治療利用pTZU-shRNAl和雙表達(dá)載體轉(zhuǎn)染小鼠的肝癌細(xì)胞系!fepal-6 24h后，能夠增加Hepal-6細(xì)胞的凋亡(如圖6所示)，且利用雙表達(dá)載體轉(zhuǎn)染小鼠的肝癌細(xì)胞系H印al-6細(xì)胞24h后能更明顯的抑制H印al_6細(xì)胞的增殖(如圖7所示)；此外，雙表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后能更明顯的增強(qiáng)小鼠脾淋巴細(xì)胞對ifepal-6細(xì)胞的殺傷。
權(quán)利要求
1.一種免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達(dá)載體，其特征在于是由轉(zhuǎn)錄shRNA的DNA序列、轉(zhuǎn)錄ssRNA的DNA序列與pTZTO+Ι載體組成的重組載體，其序列如 seq. 12 所不。
2.權(quán)利要求1所述的免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下(1))針對Pim-3基因的序列，通過shRNA設(shè)計軟件設(shè)計合成shRNA相對應(yīng)的DNA序列， 并在序列的兩端添加雙酶切位點Ml I和)(bal I，得seq. 1-8所示的序列；(2)將步驟(1)制得的序列與PTZU6+1載體連接，構(gòu)建pTZU-shRNA重組載體；分別表示為 pTZU-shRNAl、pTZU-shRNA2、pTZU_shRNA3、pTZU_shRNA4 ；(3)通過km-qPCR和Real-TimePCR對步驟O)中四對shRNA的沉默作用進(jìn)行初步篩選，篩選得到沉默作用較明顯的載體；(4)將步驟(3)中篩選得到的沉默作用較明顯的pTZU-shRNAl載體進(jìn)行EcoRI和Hind III雙酶切，得到TO+shRNA的表達(dá)框，其序列如seq. 9所示；(5)根據(jù)能夠激活免疫系統(tǒng)的RNA病毒序列，設(shè)計編碼具有潛在免疫刺激作用序列的 RNA的DNA序列，并在序列的兩端添加雙酶切位點序列EcoR I和BamH I，得seq. 10、11所示的序列；(6)將步驟(5)制得的序列與pSIREN載體連接，構(gòu)建pSIREN-ssRNA重組載體；(7)將步驟(6)中制得的重組載體進(jìn)行EcoRI單酶切，得線性片段；(8)將步驟(4)制得的TO+shRNA表達(dá)框和步驟(7)制得的線性片段平端化，連接，即得同時表達(dá)shRNA和ssRNA的雙表達(dá)載體，序列見seq. 12。
3.權(quán)利要求1所述的免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達(dá)載體在制備抗HBV的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達(dá)載體，是由轉(zhuǎn)錄shRNA的DNA序列、轉(zhuǎn)錄ssRNA的DNA序列與pTZU6+1載體組成的重組載體，其序列如seq.12所示。本發(fā)明的免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染小鼠肝癌Hepa1-6細(xì)胞，24h后檢測，通過Sem-qPCR和Western-blot檢測發(fā)現(xiàn)能夠下調(diào)Hepa1-6細(xì)胞中Pim-3的表達(dá)；轉(zhuǎn)染Hepa1-6細(xì)胞，24h后檢測，發(fā)現(xiàn)能夠明顯增加Hepa1-6細(xì)胞的凋亡；轉(zhuǎn)染Hepa1-6細(xì)胞，能明顯上調(diào)Hepa1-6細(xì)胞上清中I型干擾素(IFN-α和IFN-β)的分泌，由此可見，本發(fā)明的免疫刺激RNA和肝癌靶基因Pim-3沉默RNA的雙表達(dá)載體有可能成為治療肝癌的新的生物學(xué)手段，具有較好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/66GK102321652SQ201110179548
公開日2012年1月18日 申請日期2011年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月29日
發(fā)明者蘭培祥, 張彩, 田志剛, 郭切 申請人:山東大學(xué)