Klf9基因在抑制肝癌中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了KLF9基因在抑制肝癌中的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及KLF9(Krüppel-like factor9，KLF9)基因、蛋白或其促進(jìn)劑的用途，用于制備p53的促效劑；和/或用于制備治療肝癌的藥物組合物。此外，本發(fā)明還提供了來(lái)源于KLF9的ZNF結(jié)構(gòu)域，其作為KLF9蛋白的活性片段，在抑制肝癌中起到重要作用。
【專利說(shuō)明】KLF9基因在抑制肝癌中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤治療領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及KLF9基因在促進(jìn)p53表達(dá)和/或 活性，從而抑制肝癌中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著近年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及人類基因譜的不斷完善，人們對(duì)肝癌發(fā)病原 因及發(fā)病機(jī)制又有了新的認(rèn)識(shí)，即肝癌相關(guān)的癌基因的激活及抑癌基因的失活與突變是導(dǎo) 致肝細(xì)胞癌變的根本原因。細(xì)胞內(nèi)的癌基因與抑癌基因?qū)?xì)胞的增殖與分化起著正負(fù)調(diào)節(jié) 作用。所以說(shuō)，在分子水平上與肝癌相關(guān)癌基因與抑癌基因的變化是肝癌發(fā)生的根本原因。
[0003] 與此同時(shí)，人們提出了一個(gè)全新的概念：基因治療，為癌癥的治療帶來(lái)了新的希 望。所謂癌癥的基因治療就是指以遺傳學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，將克隆的正常基因序列導(dǎo)入該基因 缺陷的患者體內(nèi)，使導(dǎo)入的基因發(fā)揮作用而糾正基因缺陷，或設(shè)計(jì)出已經(jīng)突變的癌基因的 反義序列導(dǎo)入患者體內(nèi)，阻止突變的癌基因發(fā)揮其效應(yīng)。癌癥的基因治療最終目的是通過(guò) 不同途徑殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤生長(zhǎng)使腫瘤消退。所以，癌癥的基因治療是對(duì)腫瘤細(xì)胞惡 變過(guò)程的逆轉(zhuǎn)，對(duì)正常細(xì)胞并沒(méi)有影響。
[0004] 目前，抑癌基因的產(chǎn)物主要包括：①轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，如Rb、P53 ;②負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因 子，如WT ;③周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI)，如pl5、pl6、p21 ;④信號(hào)通路的抑制因 子，如ras GTP酶活化蛋白（NF-1)，磷脂酶（PTEN);⑥D(zhuǎn)NA修復(fù)因子，如BRCAUBRCA2。⑥ 與發(fā)育和干細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)途徑組分，如：APC、Axin等。
[0005] 此外，隨著越來(lái)越多的潛在抑癌基因被發(fā)現(xiàn)，在癌癥與抑癌平衡中龐大、復(fù)雜的細(xì) 胞通路也逐漸暴露。人們甚至發(fā)現(xiàn)，在相似的細(xì)胞通路中，同一個(gè)基因所起到作用也不盡相 同。因此，本領(lǐng)域迫切需要研究對(duì)各種腫瘤尤其是肝癌具有特異性的影響基因，并明確其作 用機(jī)制，以開(kāi)發(fā)更有效的基因治療藥物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了 KLF9基因及其表達(dá)產(chǎn)物在促進(jìn)p53表達(dá)和或活性從而抑制肝癌中 的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種KLF9(Kriippel-like factor9，KLF9)基因、蛋白或 其促進(jìn)劑的用途，用于制備P53的促效劑；和/或
[0008] 用于制備預(yù)防和/或治療肝癌的藥物組合物。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述的KLF9基因核苷酸序列如SEQ ID NO. :1所示，其編碼的蛋 白序列如SEQ ID NO. : 2所示。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的KLF9基因來(lái)自哺乳動(dòng)物，較佳地，來(lái)自嚙齒動(dòng)物（大鼠、 小鼠）和靈長(zhǎng)動(dòng)物（例如人），更佳地，來(lái)自人。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的促效劑包括P53表達(dá)促進(jìn)劑和/或p53蛋白活性穩(wěn)定劑。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述促效劑用于促進(jìn)p53的表達(dá)和/或促進(jìn)p53蛋白的穩(wěn)定。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述的KLF9蛋白包括全長(zhǎng)KLF9蛋白、成熟的KLF9蛋白、KLF9的 與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域ZNF、或含所述ZNF結(jié)構(gòu)域的KLF9活性片段。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述來(lái)源于KLF9的ZNF結(jié)構(gòu)域序列如SEQ ID NO. :4所示。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，編碼所述來(lái)源于KLF9的ZNF結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列如SEQ ID NO. : 3所示。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的促進(jìn)劑包括KLF9基因表達(dá)產(chǎn)物、促進(jìn)型miRNA、促進(jìn)型轉(zhuǎn) 錄調(diào)控因子、或促進(jìn)型靶向小分子化合物。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物包括（i)KLF9基因、蛋白或其促進(jìn)劑；和（ii) 藥學(xué)上可接受的載體。
[0018] 本發(fā)明第二方面，提供了一種篩選候選化合物的方法，所述化合物可作為KLF9促 進(jìn)劑，包括步驟：
[0019] (a)在測(cè)試組中，向細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入待測(cè)化合物，并測(cè)定p53和KLF9的表達(dá)和 /或活性；在對(duì)照組中，向同樣的培養(yǎng)體系中不加入待測(cè)化合物，并測(cè)定P53和KLF9的表達(dá) 和/或活性；其中所述待測(cè)化合物不是KLF9蛋白；
[0020] 其中，如果對(duì)照組中p53的表達(dá)和/或活性大于對(duì)照組，且對(duì)照組中KLF9的表達(dá) 和/或活性大于對(duì)照組，則說(shuō)明該候選化合物為KLF9促進(jìn)劑。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，還包括步驟：
[0022] (b)對(duì)步驟（a)中獲得的候選化合物進(jìn)一步測(cè)試其抑制肝癌的效果。
[0023] 本發(fā)明第三方面，提供了一種KLF9的ZNF結(jié)構(gòu)域的肽序列或核苷酸序列的用途， 其特征在于，用于制備P53的促效劑；和/或
[0024] 用于制備預(yù)防和/或治療肝癌的藥物組合物。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述ZNF結(jié)構(gòu)域的肽序列如SEQ ID NO. : 3所示；和/或
[0026] 所述ZNF結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列如SEQ ID NO. :4所示。
[0027] 本發(fā)明第四方面，同了一種KLF9基因或其蛋白的用途，用于制備診斷肝癌的試劑 或試劑盒。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑包括KLF9的特異性引物、特異性抗體、探針和/或芯 片。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)KLF9蛋白或mRNA的檢測(cè)試劑包括：
[0030] (a).抗KLF9蛋白的特異性抗體；和/或
[0031] (b) ·特異性擴(kuò)增KLF9的mRNA或cDNA的特異性引物。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測(cè)包括酶聯(lián)免疫反應(yīng)法（ELISA法）檢測(cè)或時(shí)間分辨免 疫熒光法（TRFIA法）檢測(cè)。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述的KLF9蛋白或其特異性抗體偶聯(lián)有或帶有可檢測(cè)標(biāo)記。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述可檢測(cè)標(biāo)記選自下組：生色團(tuán)、化學(xué)發(fā)光基團(tuán)、熒光團(tuán)、同位 素或酶。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述KLF9的特異性抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述檢測(cè)是測(cè)定組織樣品、血液樣品、血清樣品或體液樣品。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的組織樣品包括肝癌組織和癌旁組織。
[0038] 本發(fā)明第五方面，提供了一種診斷肝癌的試劑或試劑盒，所述試劑盒包括一容器， 所述容器中含有檢測(cè)KLF9蛋白或mRNA的檢測(cè)試劑；以及標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)，所述標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū) 注明所述試劑盒用于檢測(cè)肝癌。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)中注明以下內(nèi)容：
[0040] 當(dāng)檢測(cè)對(duì)象的肝癌細(xì)胞或組織中KLF9表達(dá)量El與正常肝細(xì)胞或組織的KLF9表 達(dá)量E2之比< 2,則提示該檢測(cè)對(duì)象肝癌的幾率高于普通人群。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述的E2是正常人群的正常肝細(xì)胞或組織的KLF9表達(dá)量。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述的正常肝細(xì)胞或組織包括癌旁的肝細(xì)胞或組織。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)量是相對(duì)于對(duì)照基因（如β -肌動(dòng)蛋白）的相對(duì)表 達(dá)量。
[0044] 本發(fā)明第六方面，提供了一種體外非治療性的促進(jìn)ρ53表達(dá)和/或活性；和/或抑 制肝癌的方法，其特征在于，向培養(yǎng)體系中加入KLF9基因、蛋白或其促進(jìn)劑，從而促進(jìn)ρ53 表達(dá)和/或活性；和/或抑制肝癌。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述的促進(jìn)劑包括KLF9基因表達(dá)產(chǎn)物、促進(jìn)型miRNA、促進(jìn)型轉(zhuǎn) 錄調(diào)控因子、或促進(jìn)型靶向小分子化合物。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述的KLF9基因核苷酸序列如SEQ ID NO. :1所示，其編碼的蛋 白序列如SEQ ID NO. : 2所示。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，所述的KLF9蛋白為KLF9的ZNF結(jié)構(gòu)域。
[0048] 本發(fā)明第七方面，提供了一種治療肝癌的方法，向需要的對(duì)象施用安全有效量的 KLF9基因、蛋白或其促進(jìn)劑。
[0049] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0050] 圖IA-D分別顯示了 KLFIII家族成員（KLF9, KLF10, KLF11，KLF13)在肝癌及癌旁 組織的表達(dá)情況。圖1A，P〈0. 01 ;其余圖1B-D，P〈0. 05。
[0051] 其中，圖IA顯示了 15對(duì)樣本中有10對(duì)癌組織中KLF9的表達(dá)低于其相對(duì)應(yīng)癌旁組 織2倍以上（P〈0. 01)，有4對(duì)高于其癌旁組織0. 5至1. 5倍，1對(duì)無(wú)明顯差異；圖IB顯示了 15對(duì)樣本中KLFlO的表達(dá)有3對(duì)癌組織中高于癌旁組織1. 5至7倍（P〈0. 05)，有4對(duì)癌組 織中表達(dá)低于癌旁組織0.5倍（P〈0. 05)，另外8個(gè)樣本間無(wú)明顯差異；圖IC顯示了 KLFll 的表達(dá)情況同KLF9有所相似，15對(duì)樣本中有12對(duì)癌組織低于癌旁組織（P〈0. 05);圖ID顯 示了 KLF13的表達(dá)情況同KLFlO相似，15對(duì)樣本中有7對(duì)癌組織高于癌旁組織（P〈0. 05)。
[0052] 圖2顯示了 qRT-PCR結(jié)果，KLF9在人肝癌細(xì)胞系及永生化肝細(xì)胞系THLE-2中的 表達(dá)情況，結(jié)果說(shuō)明KLF9在肝癌細(xì)胞系中低表達(dá) ：。
[0053] 圖3顯示了 KLF9過(guò)表達(dá)抑制人肝腫瘤細(xì)胞SK-H印1和H印G2的體外增殖情況，其 中，圖3A和圖3B顯示了 Western blotting檢測(cè)顯示Dox誘導(dǎo)后，細(xì)胞中KLF9 (帶Flag標(biāo) 簽）的表達(dá)情況；圖3C和圖3D中，MTT結(jié)果顯示Dox誘導(dǎo)過(guò)表達(dá)KLF9的SK-H印1和H印G2 細(xì)胞系及對(duì)照組（CTL)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。
[0054] 圖4顯示了 DOX誘導(dǎo)10天后，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)誘導(dǎo)KLF9過(guò)表達(dá)組及對(duì)照組中 細(xì)胞的克隆形成情況。由圖可見(jiàn)，KLF9抑制肝癌細(xì)胞SK-H印1和H印G2的克隆形成。
[0055] 圖5顯示了 DOX誘導(dǎo)24小時(shí)后，PI染色檢測(cè)誘導(dǎo)KLF9過(guò)表達(dá)組及對(duì)照組細(xì)胞的 細(xì)胞周期的影響。
[0056] 圖6A顯示了在SK-H印1細(xì)胞中，Annexin V/7-AAD染色檢測(cè)DOX誘導(dǎo)KLF9表達(dá) 組及對(duì)照組的細(xì)胞凋亡情況；圖6B顯示了在SK-H印1細(xì)胞中，Annexin V/7-AAD染色檢測(cè) DOX誘導(dǎo)KLF9表達(dá)組及對(duì)照組中的細(xì)胞凋亡比率的統(tǒng)計(jì)圖；圖6C顯示了在H印G2細(xì)胞中， Annexin V/7-AAD染色檢測(cè)DOX誘導(dǎo)KLF9表達(dá)組及對(duì)照組的細(xì)胞凋亡情況。圖6D顯示了 在H印G2細(xì)胞中，Annexin V/7-AAD染色檢測(cè)DOX誘導(dǎo)KLF9表達(dá)組及對(duì)照組中的細(xì)胞凋亡 比率的統(tǒng)計(jì)圖。結(jié)果顯示，KLF9過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)人肝腫瘤細(xì)胞凋亡。
[0057] 圖 7 顯示了 Sk-H印l-Tet-〇n-KLF9 以及 H印G2-Tet-〇n-KLF9 細(xì)胞經(jīng) DOX 誘導(dǎo) KLF9 表達(dá)不同時(shí)間后，Western blotting檢測(cè)p53的表達(dá)情況。結(jié)果顯示KLF9過(guò)表達(dá)導(dǎo)致人 肝癌細(xì)胞中P53蛋白水平增高。
[0058] 圖 8 顯示了 Sk-H印l-Tet-〇n-KLF9 以及 H印G2-Tet-〇n-KLF9 細(xì)胞經(jīng) DOX 處理 24 小 時(shí)后，再用轉(zhuǎn)錄抑制劑CHX處理不同時(shí)間，Western blotting檢測(cè)p53、p21、KLF9 (帶Flag 標(biāo)簽）的表達(dá)情況。結(jié)果顯示KLF9穩(wěn)定了 p53的表達(dá)。
[0059] 圖9顯示了通過(guò)免疫共沉淀檢測(cè)KLF9與p53的相互結(jié)合關(guān)系。
[0060] 圖10顯示了通過(guò)細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)KLF9及P53在細(xì)胞中的定位情況。可見(jiàn) KLF9與p53在細(xì)胞核內(nèi)共表達(dá)。
[0061] 圖 11 顯不了 siRNA 干擾 p53 表達(dá)后，Western blotting 檢測(cè) p53、p21、KLF9 (帶 Flag)的表達(dá)情況?？梢?jiàn)siRNA介導(dǎo)的p53表達(dá)的抑制
[0062] 圖12 siRNA干擾p53表達(dá)后，DOX誘導(dǎo)KLF9表達(dá)24小時(shí)，qRT-PCR檢測(cè)p53及 p21的mRNA的表達(dá)情況。
[0063] 圖13顯示了 siRNA干擾p53表達(dá)后，DOX誘導(dǎo)KLF9表達(dá)24小時(shí)，Annexin V/7-AAD 檢測(cè)過(guò)表達(dá)KLF9及對(duì)照組的細(xì)胞凋亡情況?？梢?jiàn)p53抑制能夠部分逆轉(zhuǎn)KLF9過(guò)表達(dá)誘導(dǎo) 的細(xì)胞凋亡。
[0064] 圖14顯示了 DOX誘導(dǎo)KLF9表達(dá)不同時(shí)間后，Annexin V/7-AAD檢測(cè)過(guò)表達(dá)KLF9 及對(duì)照組的H印3B細(xì)胞的凋亡情況?？梢?jiàn)KLF9過(guò)表達(dá)未能有效誘導(dǎo)p53缺陷的H印3B細(xì) 胞的凋亡。
[0065] 圖15顯示了不同p53基因型的肝癌細(xì)胞對(duì)KLF9誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具不同反應(yīng)性： DOX誘導(dǎo)KLF9表達(dá)不同時(shí)間后，Annexin V/7-AAD檢測(cè)過(guò)表達(dá)KLF9及對(duì)照組的各肝癌細(xì)胞 的凋亡情況。
[0066] 圖16顯示了 KLF9結(jié)構(gòu)域刪節(jié)示意圖。
[0067] 圖17顯示了野生型KLF9及其SID、ZNF突變體的表達(dá)驗(yàn)證：Western blotting檢 測(cè)轉(zhuǎn)有 KLF9-flag wt、KLF9-flag Λ SID、KLF9-flag Λ ZNF 的細(xì)胞中各 KLF9 突變體的表達(dá) 情況。
[0068] 圖18顯示了 DOX處理10天后，過(guò)表達(dá)各KLF9突變體的肝癌細(xì)胞的細(xì)胞克隆形成 情況?？梢?jiàn)KLF9缺失了 SID結(jié)構(gòu)域仍可抑制細(xì)胞增殖，而缺失了 ZNF結(jié)構(gòu)域則失去了抑 制細(xì)胞增殖的功能。
[0069] 圖 19Α 顯示了在 SK-H印1 細(xì)胞中，DOX 誘導(dǎo) KLF9wt, KLF9 Λ SID and Λ ZNF 表達(dá)后，Annexin V/7-AAD染色檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況；圖19B顯示了 DOX誘導(dǎo) KLF9wt, KLF9ASID andAZNF 表達(dá)不同時(shí)間后，Annexin V/7-AAD 染色檢測(cè)的各組 SK-Ifepl 細(xì)胞的凋亡細(xì)胞比率統(tǒng)計(jì)圖；圖19C顯示了在H印G2細(xì)胞中，DOX誘導(dǎo)KLF9wt，KLF9 Λ SID and Λ ZNF表達(dá)后，Annexin V/7-AAD染色檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況；圖19D顯示了 DOX誘 導(dǎo)KLF9wt、KLF9 Λ SID及KLF9 Λ ZNF表達(dá)不同時(shí)間后，Annexin V/7-AAD染色檢測(cè)的各組 !fepG2細(xì)胞的凋亡細(xì)胞比率統(tǒng)計(jì)圖。由此可見(jiàn)，KLF9誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡依賴ZNF功能域。
[0070] 圖20A顯示了在SK-H印1細(xì)胞中，DOX誘導(dǎo)表達(dá)不同時(shí)間后，qRT-PCR檢測(cè)Noxa的 mRNA表達(dá)情況；圖20B顯示了在SK-H印1細(xì)胞中，DOX誘導(dǎo)表達(dá)不同時(shí)間后，qRT-PCR檢測(cè) Puma的mRNA表達(dá)情況；圖20C顯示了在H印G2細(xì)胞中，DOX誘導(dǎo)表達(dá)不同時(shí)間后，qRT-PCR 檢測(cè)Noxa的mRNA表達(dá)情況；圖20D顯示了在HepG2細(xì)胞中，DOX誘導(dǎo)表達(dá)不同時(shí)間后， qRT-PCR檢測(cè)Puma的mRNA表達(dá)情況。由此可見(jiàn)，KLF9誘導(dǎo)noxa和puma的表達(dá)依賴其ZNF 功能域。
[0071] 圖21顯示了 DOX誘導(dǎo)表達(dá)24小時(shí)后,Western blotting檢測(cè)p53以及p21的表 達(dá)情況?？梢?jiàn)，KLF9提高p53和p21蛋白水平依賴其ZNF功能域。
[0072] 圖22A顯示了 DOX誘導(dǎo)KLF9及各突變體表達(dá)組及對(duì)照組的成瘤情況。第一組左側(cè) 為CTL，右側(cè)為KLF9-WT ;第二組左側(cè)為Λ ZNF，右側(cè)為Λ SID ;圖22B顯示了 DOX誘導(dǎo)KLF9 及各突變體表達(dá)組及對(duì)照組所形成的腫瘤大小統(tǒng)計(jì)圖。可見(jiàn)，KLF9可抑制人肝癌細(xì)胞在體 內(nèi)的生長(zhǎng)。
[0073] 圖23顯示了 Tet-on-control-SK-Hepl及對(duì)照細(xì)胞皮下荷瘤，當(dāng)所形成的腫瘤達(dá) 至Ij 120-150mm3大小后，分組給DOX誘導(dǎo)KLF9表達(dá)或給水作為對(duì)照。其中，圖23A顯示了給 DOX或給水后，各組腫瘤的生長(zhǎng)狀況統(tǒng)計(jì)。圖23B顯示了給DOX或給水18天后，各組小鼠的 成瘤情況。結(jié)果表明KLF9過(guò)表達(dá)抑制已發(fā)生腫瘤的生長(zhǎng)。

【具體實(shí)施方式】
[0074] 本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，通過(guò)大量篩選，首次意外地發(fā)現(xiàn)，對(duì)于一種在多 種組織中廣泛存在的蛋白即KLF9蛋白，雖然該蛋白在不同組織中呈現(xiàn)了高低不同的表達(dá)， 但在肝癌細(xì)胞中KLF9卻呈現(xiàn)出肝癌相關(guān)的特異性低表達(dá)。試驗(yàn)證明，通過(guò)特異性提高KLF9 蛋白的表達(dá)或其活性，能夠有效抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡。此外，本發(fā)明 人還發(fā)現(xiàn)，KLF9蛋白可通過(guò)提高p53的表達(dá)或增強(qiáng)p53蛋白的穩(wěn)定性，從而達(dá)到抑制肝癌 的效果。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
[0075] KLF9基因和蛋白
[0076] Kriippel-Iike因子（KLFs)是一組與真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)的鋅指蛋白。 KLFs有17個(gè)家族成員，其羧基末端高度保守，含有3個(gè)串聯(lián)的Cys2/His2鋅指狀結(jié)構(gòu)，用 于結(jié)合DNA ;其氨基末端在不同的家族成員間存在較大差異，主要是通過(guò)結(jié)合輔助因子發(fā) 揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。KLFs不同成員表達(dá)具組織分布特異性和分化、發(fā)育上的階段性；KLFs調(diào) 控多種富含GC或CACCC啟動(dòng)子的基因表達(dá)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡的生理過(guò)程，與心血 管疾病、代謝異常疾病、腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。
[0077] KLF9是KLFIII類亞家族成員，最初被命名為基本轉(zhuǎn)錄元件結(jié)合蛋白I(BTEBl)，在 不同細(xì)胞內(nèi)對(duì)靶基因發(fā)揮抑制或激活等不同功能。已有報(bào)道表明，KLF9在腫瘤中出現(xiàn)異常 表達(dá)，如在腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)；但在不同種類的子宮內(nèi)膜癌中卻呈現(xiàn)高低各不 相同的表達(dá)。
[0078] 可用于本發(fā)明的KLF9蛋白序列包括各種來(lái)源和物種的KLF9,并且包括野生型、突 變型的KLF9,或其活性片段。一種代表性的人KLF9蛋白如SEQ ID NO. : 2所示，編碼該蛋白 的核苷酸序列如SEQ ID NO. : 1所示。（請(qǐng)給出具體序列或genbank登錄號(hào)）
[0079] ZNF結(jié)構(gòu)域
[0080] KLFIII家族成員在結(jié)構(gòu)上具有多個(gè)相似的結(jié)構(gòu)域。包括羧基端的鋅指狀結(jié)構(gòu) (Zinc finger domain, ZNF)，是主要的 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA Binding Domain)、還包括氨基 端包含了一個(gè)與SIN3A復(fù)合體相互作用的結(jié)構(gòu)域（SIN3A Interaction Domain, SID)。
[0081] 本發(fā)明通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)，對(duì)KLF9各結(jié)構(gòu)域依次進(jìn)行缺失，并最終發(fā)現(xiàn)了 KLF9的ZNF 結(jié)構(gòu)域?qū)LF9抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡起到?jīng)Q定性作用，可見(jiàn)ZNF結(jié)構(gòu)域?yàn)?KLF9蛋白的抑癌活性片段。
[0082] 本發(fā)明中，所述ZNF結(jié)構(gòu)域的蛋白序列如SEQ ID NO. :3所示，編碼該蛋白的核苷 酸序列如SEQ ID NO. :4所示。
[0083] ZNF結(jié)構(gòu)域蛋白或其核酸序列的獲得同KLF9基因或其核苷酸的獲得方法。
[0084] p53 基因
[0085] 人體抑癌基因。該基因編碼一種分子量為53kDa的蛋白質(zhì)，命名為P53。p53基 因的失活對(duì)腫瘤形成起重要作用。由這種基因編碼的蛋白質(zhì)（protein)是一種轉(zhuǎn)錄因子 (transcriptional factor)，其控制著細(xì)胞周期的啟動(dòng)。許多有關(guān)細(xì)胞健康的信號(hào)向p53 蛋白發(fā)送。關(guān)于是否開(kāi)始細(xì)胞分裂就由這個(gè)蛋白決定。如果這個(gè)細(xì)胞受損，又不能得到修 復(fù)，則p53蛋白將參與啟動(dòng)過(guò)程,使這個(gè)細(xì)胞在細(xì)胞凋亡（apoptosis)中死去。
[0086] 人類P53基因定位于17P13. 1，鼠 P53定位于11號(hào)染色體，并在14號(hào)染色體上發(fā) 現(xiàn)無(wú)功能的假基因。
[0087] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)（如果是天然的物 質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境）。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純 化的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化 的。
[0088] 如本文所用，"分離的KLF9蛋白或多肽"是指KLF9蛋白基本上不含天然與其相關(guān) 的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化 KLF9蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。在本發(fā)明中， KLF9蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。
[0089] 本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多 肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
[0090] 本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA 或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
[0091] 編碼KLF9的成熟多肽的多核苷酸包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的 編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列（和任選的附加編碼序列）以及非編 碼序列。術(shù)語(yǔ)"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括 附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
[0092] 本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多 肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或 非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本 領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、 缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼多肽的功能。
[0093] 本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段，包括正義和反義的核酸片段。如本 文所用，"核酸片段"的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè) 核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)（如PCR)以確定 和/或分離編碼KLF9蛋白的多核苷酸。
[0094] 本發(fā)明的人KLF9核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工 合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序 列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù) 作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再 將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0095] 一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。 [0096] 此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通 過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
[0097] 應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引 物可根據(jù)本文所公開(kāi)的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方 法如通過(guò)凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
[0098] 通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組 的KLF9蛋白。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟：
[0099] (1).用本發(fā)明的編碼人KLF9蛋白的多核苷酸（或變異體），或用含有該多核苷酸 的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；
[0100] (2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；
[0101] (3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
[0102] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人KLF9編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄 /翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技 術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá) 載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
[0103] 此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的 宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋 白（GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
[0104] 包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適 當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0105] 宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高 等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞 如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲(chóng)細(xì)胞；CHO、C0S、或293細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。
[0106] 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl 2法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的 方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方 法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
[0107] 獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用 的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下 進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法（如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)） 誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
[0108] 在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如 果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這 些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用 蛋白沉淀劑處理（鹽析方法）、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析（凝膠過(guò)濾）、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析（HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié) 合。
[0109] 促進(jìn)劑和藥物組合物
[0110] 利用本發(fā)明蛋白，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與KLF9蛋白發(fā)生相互作用的 物質(zhì)，尤其是促進(jìn)劑等。
[0111] 本發(fā)明KLF9蛋白的促進(jìn)劑，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用（給藥）時(shí)，可促進(jìn)KLF9蛋白的 表達(dá)和/或活性，進(jìn)而促進(jìn)P53的表達(dá)和/或活性，從而抑制肝癌。在另一優(yōu)選例中，所述 的KLF9促進(jìn)劑包括的KLF9基因表達(dá)產(chǎn)物、促進(jìn)型miRNA、促進(jìn)型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、或促進(jìn)型靶 向小分子化合物。
[0112] 通常，可將這些促進(jìn)劑配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中， 其中pH通常約為5-8,較佳地pH約為6-8,盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的 病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括（但并不限 于）：瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
[0113] 本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明KLF9蛋白或其促 進(jìn)劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括（但并不限于）：鹽水、緩沖液、葡 萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以 被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制 備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶 液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微 克-10毫克/千克體重。
[0114] 篩選藥物的方法
[0115] 本發(fā)明KLF9基因或其蛋白在肝癌抑制中對(duì)P53的依賴，可被用于篩選藥物。一種 優(yōu)選的篩選方法是用于篩選KLF9促進(jìn)劑的候選化合物的方法包括步驟：
[0116] (a)在測(cè)試組中，向細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入待測(cè)化合物，并測(cè)定p53的表達(dá)和/或活 性；在對(duì)照組中，向同樣的培養(yǎng)體系中不加入待測(cè)化合物，并測(cè)定P53的表達(dá)和/或活性；
[0117] 其中，如果對(duì)照組中p53的表達(dá)和/或活性大于對(duì)照組，則說(shuō)明該候選化合物為 KLF9的促進(jìn)劑。
[0118] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括步驟：
[0119] (b)對(duì)步驟（a)中獲得的候選化合物進(jìn)一步測(cè)試其抑制肝癌的效果，若測(cè)試化合 物對(duì)肝癌有顯著的抑制效果，則說(shuō)明該化合物為KLF9促進(jìn)劑。
[0120] 通用方法
[0121] 材料
[0122] 人肝癌細(xì)胞株 H印G2、H印3B、PLC/PRF/5、SK-H印 1、SUN387 以及 THLE-2 人正 常肝細(xì)胞株（CRL-2706)來(lái)自ATCC，人肝癌細(xì)胞株HuH-7購(gòu)自日本Riken，人肝癌細(xì)胞 株SMMC-7721購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)，人肝癌細(xì)胞株HCC-LM3、MHC-97H購(gòu)自中山醫(yī)院肝癌研 究所。pTRIPZ Tet-on表達(dá)質(zhì)粒來(lái)自Thermo公司。細(xì)胞培養(yǎng)液Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)、DMEM:F12(l:l)以及胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自 美國(guó) HyClone 公司。噻唑蘭（Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, MTT)、7_ 氨基放 線菌素0(7-4111；[1103(31:;[1101115^;[110,7-440)、碘化丙陡（?1'(^1(1;[1111110(11(16，？1)、強(qiáng)力霉素 (doxycycline，Dox)購(gòu)自美國(guó)sigma公司。質(zhì)粒小抽提試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自天根 生化科技（北京）公司；LipofetAMINE2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；總RNA提取試劑 TRIzol、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、高保真酶PrimeStar?、RNA反轉(zhuǎn)試劑盒PrimeScript? RT Kit 和 SYBR Premix Ex Taq? 試劑盒購(gòu)自大連 TaKaRa。APC(allophycocyanin)_Annexin V (細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑）抗體購(gòu)于美國(guó)BD公司。兔抗人p53單克隆抗體、鼠抗人p21/CDKNlA 單克隆抗體、鼠抗人ct-Tubulin單克隆抗體、兔抗人GAPDH單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗人Bcl-2多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司；FLAG標(biāo)簽抗體購(gòu)于美國(guó) Sigma公司；兔抗人KLF9多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。肝癌組織樣本來(lái)源于江蘇省啟 東市肝癌防治研究所，用于RNA的提取以及基因表達(dá)檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)所用BALB/c雄性裸鼠，6 周齡，體重20g左右，皆購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于華東師范大學(xué)動(dòng)物 房。
[0123] Tet調(diào)控KLF9及其突變體表達(dá)的載體構(gòu)建
[0124] KLF9全長(zhǎng)cDNA通過(guò)以下引物PCR得到：
[0125] Forword:gacgatgacaagatgtccgcggccgcctac(SEQ ID NO. :5)
[0126] Reverse:tcacaaagcgttggccagcgcctttttc(SEQ ID NO. :6)
[0127] 在進(jìn)一步的PCR中，將Flag序列引入KLF9編碼序列的N短，再將帶有Flag標(biāo)簽 的KLF9全長(zhǎng)cDNA以及兩個(gè)不同結(jié)構(gòu)域缺失的KLF9突變體cDNA克隆入Tet調(diào)控的載體 pTRIPZ-puro中。所用引物分別如下所示：
[0128] pTRIPZ-KLF9-flag-wt
[0129] Forword(AgeI-Flag):
[0130] ataccggtgccaccatggactacaaggacgacgatgacaag(SEQ ID NO. :7)
[0131] Reverse (EcoRI):gcgaattctcacaaagcgttggccagcgc(SEQ ID NO. :8)
[0132] pTRIPZ-KLF9-flag-SID deletion ：
[0133] Forward (AgeI) :tacaaggacgacgatgacaagatggagcggctgcgactacctg(SEQ ID NO. :9)
[0134] Reverse (EcoRI):gcgaattctcacaaagcgttggccagcgc(SEQ ID NO. :10)
[0135] pTRIPZ-KLF9-flag-ZNF deletion ：
[0136] Forword (AgeI) :ataccggtgccaccatggactacaaggacgacgatgacaag(SEQ ID NO. :11)
[0137] Reverse (EcoRI);gcgaattctcacctcttttcggaggcgtg(SEQ ID NO. :12)
[0138] MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖
[0139] 按常規(guī)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，利用分光光度計(jì)于540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（D) 值。
[0140] 細(xì)胞凋亡檢測(cè)
[0141] 按照Annexin V染色試劑盒（BD Biosciences)的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)胞收集及染色，然 后上流式細(xì)胞儀（FACSCalibur?流式細(xì)胞儀，Becton Dickinson)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
[0142] 細(xì)胞周期檢測(cè)
[0143] 按照常規(guī)的PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期的方法處理細(xì)胞及PI染色，然后上流式細(xì)胞儀 檢測(cè)細(xì)胞檢測(cè)周期。
[0144] qRT-PCR檢測(cè)目的基因 mRNA的表達(dá)
[0145] 利用TRIzol試劑提取目的細(xì)胞或組織樣本總RNA，逆轉(zhuǎn)錄mRNA得到cDNA。所用 引物如下表（引物均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成）：

【權(quán)利要求】
1. 一種Kriippel樣因子9 (Kriippel-likefactor9，KLF9)基因、蛋白或其促進(jìn)劑的用 途，其特征在于，用于制備P53的促效劑；和/或 用于制備預(yù)防和/或治療肝癌的藥物組合物。
2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的促效劑包括p53表達(dá)促進(jìn)劑；和/或 p53蛋白活性穩(wěn)定劑。
3. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的KLF9蛋白包括全長(zhǎng)KLF9蛋白、成熟 的KLF9蛋白、KLF9的與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域ZNF、或含所述ZNF結(jié)構(gòu)域的KLF9活性片段。
4. 如權(quán)利要求1所述用途，其特征在于，所述的促進(jìn)劑包括KLF9基因表達(dá)產(chǎn)物、促進(jìn)型 miRNA、促進(jìn)型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、或促進(jìn)型靶向小分子化合物。
5. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的藥物組合物包括（i)KLF9基因、蛋白 或其促進(jìn)劑；和（ii)藥學(xué)上可接受的載體。
6. -種篩選候選化合物的方法，所述化合物可作為KLF9促進(jìn)劑，其特征在于，包括步 驟： (a) 在測(cè)試組中，向細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入待測(cè)化合物，并測(cè)定p53和KLF9的表達(dá)和/或 活性；在對(duì)照組中，向同樣的培養(yǎng)體系中不加入待測(cè)化合物，并測(cè)定P53和KLF9的表達(dá)和/ 或活性；其中所述待測(cè)化合物不是KLF9蛋白； 其中，如果對(duì)照組中p53的表達(dá)和/或活性大于對(duì)照組，且對(duì)照組中KLF9的表達(dá)和/ 或活性大于對(duì)照組，則說(shuō)明該候選化合物為KLF9促進(jìn)劑。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，還包括步驟： (b) 對(duì)步驟（a)中獲得的候選化合物進(jìn)一步測(cè)試其抑制肝癌的效果。
8. -種KLF9的ZNF結(jié)構(gòu)域的肽序列或核苷酸序列的用途，其特征在于，用于制備p53 的促效劑；和/或 用于制備預(yù)防和/或治療肝癌的藥物組合物。
9. 一種KLF9基因或其蛋白的用途，其特征在于，用于制備診斷肝癌的試劑或試劑盒。
10. -種診斷肝癌的試劑或試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括一容器，所述容器中 含有檢測(cè)KLF9蛋白或mRNA的檢測(cè)試劑；以及標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)，所述標(biāo)簽或說(shuō)明書(shū)注明所述試 劑盒用于檢測(cè)肝癌。
11. 一種體外非治療性的促進(jìn)P53表達(dá)和/或活性；和/或抑制肝癌的方法，其特征在 于，向培養(yǎng)體系中加入KLF9基因、蛋白或其促進(jìn)劑，從而促進(jìn)p53表達(dá)和/或活性；和/或 抑制肝癌。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK104511028SQ201310465246
【公開(kāi)日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2013年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月8日
【發(fā)明者】劉永忠, 楊兆娟, 王博石, 劉昀, 孫佳彬 申請(qǐng)人:上海市腫瘤研究所