專利名稱：一種牛睪丸制備玻璃酸酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種牛睪丸制備玻璃酸酶的方法。
背景技術(shù)：
1928年，Duran Reynals發(fā)現(xiàn)了玻璃酸酶并將其稱為擴(kuò)散因子，1940年Chain和Duthie將其命名為透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase, HAase)。玻璃酸酶為粘多糖的分解酶,能促進(jìn)皮膚對水分、微量元素、維生素等營養(yǎng)成分的吸收，可增加組織的通透性，從而促使皮下注輸液和局部積貯的滲出液或血液的吸收；在生化方面，此酶可用于透明質(zhì)酸、玻璃酸鈉及硫酸軟骨素的鑒定等。

目前市場上使用的玻璃酸酶大多是從哺乳動(dòng)物睪丸中提取的，從牛(羊)睪丸中提取玻璃酸酶通用工藝為牛睪丸絞成糜漿后，用冰醋酸溶液提取，吊濾得到粗提液，之后用硫酸銨溶液分級鹽析，得到精制液，再將其裝入透析袋中透析，經(jīng)磷酸鈉、醋酸鈣溶液，抽濾，冷凍干燥，得玻璃酸酶精品。該工藝繁瑣，質(zhì)量不穩(wěn)定，收率低，且堿、鹽易對環(huán)境造成污染；此外，部分玻璃酸酶的生產(chǎn)應(yīng)用發(fā)酵法，主要工藝為鏈霉菌發(fā)酵、發(fā)酵液濃縮、沉淀粗品過色譜柱、分離得精制品、冷凍干燥，得凍干制劑成品，該工藝提取效率相對提高，但有機(jī)溶劑的引入使產(chǎn)品質(zhì)量大打折扣。玻璃酸酶用途廣泛，市場需求量大，國外眾多科學(xué)家專注于玻璃酸酶的提取，并申請了相關(guān)專利。Arat等人于1999年申請專利“透明質(zhì)酸酶的制備方法”，其采用的技術(shù)是將牲畜睪丸制成勻漿，用冰醋酸以重量/體積比為I : I. 5提取，之后采用切向流超濾系統(tǒng)進(jìn)行純化分離，選擇性膜包為截留分子量從15KD-20KD，最后使用乳酸和活性炭連續(xù)吸附雜質(zhì)，得到純化玻璃酸酶，所得產(chǎn)品產(chǎn)量有所增加。Kulakova E B等人于2002年申請發(fā)明專利“透明質(zhì)酸酶的制備方法”，其方法是先磨碎睪丸，用醋酸溶液提取，濃縮，濃縮液經(jīng)活性炭吸附雜質(zhì)，之后在O. 5-1. O摩爾/升氯化鈉，2-5%氯仿的溶液中純化，在2-4%氯化鈉溶液中活性炭吸附純化，得到玻璃酸酶，所得產(chǎn)品產(chǎn)量增加，純度提高。上述發(fā)明專利中所采用的工藝都對玻璃酸酶的產(chǎn)量和純度有一定提高，但提取步驟較繁瑣，雜質(zhì)去除不徹底，對產(chǎn)品純度有較大影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過工藝優(yōu)化，提供一種牛睪丸制取玻璃酸酶的方法，以克服現(xiàn)有工藝提取步驟繁瑣、時(shí)間長、收率低等問題。本發(fā)明提供的一種牛睪丸制取玻璃酸酶的方法，包括以下步驟I)牛睪丸預(yù)處理以新鮮牛睪丸為原料，除去內(nèi)外副睪，蒸餾水洗凈，絞成糜漿；2)超聲波提取將濃度為5 8%的NaCl提取液裝入超聲提取儀的容器內(nèi)，加入牛睪丸糜漿，使牛睪丸與提取液比例為I : 8 I : 12，調(diào)節(jié)pH為4 5. 5，溫度為30 35°C，超聲波強(qiáng)度為30 45W下提取30 40min，提取的玻璃酸酶的比活可達(dá)285. 3U/mg ；3)離心超聲波處理后的提取液在3000r/min下離心15 20min,除去雜質(zhì),取上清液；4)葡聚糖凝膠層析葡聚糖凝膠Sephadex G_75溶脹后裝柱,從層析柱頂部加入玻璃酸酶清液,洗脫，控制洗脫溫度為25 30°C，洗脫流速為25 40mL/h，洗脫時(shí)間為4 5h后，可有效去除雜質(zhì)；5)冷凍干燥層析液經(jīng)冷凍干燥，得到玻璃酸酶成品，純度達(dá)到99. 5%。 本發(fā)明提供的上述以牛睪丸制取玻璃酸酶的工藝，其特點(diǎn)在于I)超聲波提取超聲波在生物活性物質(zhì)的提取方面廣泛應(yīng)用，主要是利用超聲波在溶液中產(chǎn)生的空穴效應(yīng)作用，利用超聲波提取具有提取時(shí)間短，原料提取充分，提取效率高的特點(diǎn)。本發(fā)明采用超聲波提取玻璃酸酶，酶比活可達(dá)270U/mg以上，與通用提取方法相比，產(chǎn)品活性和產(chǎn)量明顯提高。2)葡聚糖凝膠過濾層析純化凝膠層析(gel chromatography)又稱為凝膠排阻層析、分子篩層析、凝膠過濾、凝膠滲透層析等，它是以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小順序分離樣品中各個(gè)組分的液相色譜方法。凝膠層析法已廣泛用于酶、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、激素、生物堿等物質(zhì)的分離提純。本發(fā)明采用葡聚糖凝膠S^hadex G-75純化玻璃酸酶，有效去除雜質(zhì)，可得到純度達(dá)99. 5%的產(chǎn)品。本發(fā)明以新鮮牛睪丸為原料，采用清潔生產(chǎn)工藝，所得玻璃酸酶純度高(> 700U/mg)、提取收率高(> 9. 2% )、安全無污染、節(jié)省時(shí)間，適合于工業(yè)化生產(chǎn)，符合國際研究開發(fā)的潮流。
具體實(shí)施例方式提出以下實(shí)例來具體說明，以更好地理解本發(fā)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。實(shí)施例I以新鮮牛睪丸為原料，除去內(nèi)外副睪，蒸餾水洗凈，絞成糜漿；加入濃度為6%的NaCl提取液，牛睪丸與提取液比例為I : 10，調(diào)節(jié)pH為4. 5，溫度為35°C，40W超聲波強(qiáng)度下提取40min，玻璃酸酶比活達(dá)283U/mg ;提取液在3000r/min下離心15min，除去雜質(zhì)；葡聚糖凝膠溶脹后裝柱，去離子水洗脫，洗脫溫度30°C，洗脫流速25mL/h，洗脫5h ;層析液經(jīng)冷凍干燥，得到成品。玻璃酸酶產(chǎn)品活性874. 3U/mg，收率9. 28%。實(shí)施例2以新鮮牛睪丸為原料，除去內(nèi)外副睪，蒸餾水洗凈，絞成糜漿；加入濃度為7%的NaCl提取液，牛睪丸與提取液比例為I : 11，調(diào)節(jié)pH為4. 5，溫度為35°C，40W超聲波強(qiáng)度下提取40min，玻璃酸酶比活達(dá)279. 3U/mg ;提取液在3000r/min下離心15min，除去雜質(zhì)；葡聚糖凝膠溶脹后裝柱，去離子水洗脫，洗脫溫度30°C，洗脫流速25mL/h，洗脫5h ;層析液經(jīng)冷凍干燥，得到成品。玻璃酸酶產(chǎn)品活性869U/mg，收率9. 25%。
實(shí)施例3以新鮮牛睪丸為原料，除去內(nèi)外副睪，蒸餾水洗凈，絞成糜漿；加入濃度為6%的NaCl提取液，牛睪丸與提取液比例為I : 10，調(diào)節(jié)pH為4. 5，溫度為35°C，45W超聲波強(qiáng)度下提取40min,玻璃酸酶比活達(dá)286. 8U/mg ;提取液在3000r/min下離心15min,除去雜質(zhì)；葡聚糖凝膠溶脹后裝柱，去離子水洗脫，洗脫溫度30°C，洗脫流速25mL/h，洗脫5h ;層析液經(jīng)冷凍干燥，得到成品。玻璃酸酶產(chǎn)品活性892. lU/mg,收率9. 31 %。實(shí)施例4以新鮮牛睪丸為原料，除去內(nèi)外副睪，蒸餾水洗凈，絞成糜漿；加入濃度為6%的NaCl提取液，牛睪丸與提取液比例為I : 10，調(diào)節(jié)pH為4. 5，溫度為35°C，45W超聲波強(qiáng)度下提取40min，玻璃酸酶比活達(dá)282. 5U/mg ;提取液在3000r/min下離心20min，除去雜質(zhì)；葡聚糖凝膠溶脹后裝柱，去離子水洗脫，洗脫溫度30°C，洗脫流速30mL/h，洗脫5h ;層析液
經(jīng)冷凍干燥，得到成品。玻璃酸酶產(chǎn)品活性913U/mg，收率9. 35%。實(shí)施例5以新鮮牛睪丸為原料，除去內(nèi)外副睪，蒸餾水洗凈，絞成糜漿；加入濃度為6%的NaCl提取液，牛睪丸與提取液比例為I : 10，調(diào)節(jié)pH為4. 5，溫度為35°C，45W超聲波強(qiáng)度下提取40min，玻璃酸酶比活達(dá)283U/mg ;提取液在3000r/min下離心20min，除去雜質(zhì)；葡聚糖凝膠溶脹后裝柱，去離子水洗脫，洗脫溫度30°C，洗脫流速35mL/h，洗脫5h ;層析液經(jīng)冷凍干燥，得到成品。玻璃酸酶產(chǎn)品活性895U/mg，收率9. 32%。實(shí)施例6以新鮮牛睪丸為原料，除去內(nèi)外副睪，蒸餾水洗凈，絞成糜漿；加入濃度為7%的NaCl提取液，牛睪丸與提取液比例為I : 12，調(diào)節(jié)pH為5，溫度為35°C，45W超聲波強(qiáng)度下提取40min，玻璃酸酶比活達(dá)295. 7U/mg ;提取液在3000r/min下離心20min，除去雜質(zhì)；葡聚糖凝膠溶脹后裝柱，去離子水洗脫，洗脫溫度30°C，洗脫流速35mL/h，洗脫5h ;層析液經(jīng)冷凍干燥，得到成品。玻璃酸酶產(chǎn)品活性936U/mg，收率9. 38%。
權(quán)利要求
1.ー種牛睪丸制取玻璃酸酶的方法，其特征在于，包含以下步驟 1)牛睪丸預(yù)處理 以新鮮牛睪丸為原料，除去內(nèi)外副睪，蒸餾水洗凈，絞成糜漿； 2)超聲波提取 將濃度為5 8%的NaCl提取液裝入超聲提取儀的容器內(nèi)，加入牛睪丸糜漿，使牛睪丸與提取液比例為I : 8 I : 12，調(diào)節(jié)pH為4 5. 5，溫度為30 35°C，超聲波強(qiáng)度為30 45W下提取30 40min ； 3)離心 超聲波處理后的提取液在3000r/min下離心15 20min,除去雜質(zhì),取上清液； 4)葡聚糖凝膠層析 葡聚糖凝膠溶脹后裝柱，從層析柱頂部加入玻璃酸酶清液，洗脫，控制洗脫溫度為25 30°C，洗脫流速為25 40mL/h，洗脫時(shí)間為4 5h后，可有效去除雜質(zhì)； 5)冷凍干燥 層析液經(jīng)冷凍干燥，得到玻璃酸酶成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的牛睪丸制取玻璃酸酶的方法，其特征在于，步驟2)所述的超聲波提取中，NaCl提取液濃度為5 8%，牛睪丸與提取液比例為I : 8 I : 12，pH為4 5. 5，溫度為30 35°C，超聲波強(qiáng)度為30 45W，提取時(shí)間為30 40min。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的牛睪丸制取玻璃酸酶的方法，其特征在于，步驟4)所述的葡聚糖凝膠為Sephadex G-75。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的牛睪丸制取玻璃酸酶的方法，其特征在于，步驟4)所述的洗脫液為去離子水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種牛睪丸制備玻璃酸酶的方法，其工藝步驟如下以新鮮牛睪丸為原料，除去內(nèi)外副睪，絞成糜漿，超聲波提取，離心，提取液經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex G-75層析，冷凍干燥，得到玻璃酸酶純品。本產(chǎn)品活性達(dá)700U/mg以上，收率高達(dá)9.2％，產(chǎn)品質(zhì)量大為改善。該工藝具有產(chǎn)品純度高、提取收率高、安全無污染、節(jié)省時(shí)間等特點(diǎn)，適合于工業(yè)化生產(chǎn)，符合國際研究開發(fā)的潮流。
文檔編號C12N9/26GK102851265SQ20111017636
公開日2013年1月2日 申請日期2011年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月28日
發(fā)明者高聚霞 申請人:西藏金稞集團(tuán)有限責(zé)任公司