水牛睪丸曲精細(xì)管總蛋白樣品的制備方法和雙向電泳分離方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水牛睪丸曲精細(xì)管總蛋白樣品的制備方法，該法屬于裂解液提取-丙酮沉淀方法，且方法簡單易行、快速可靠，結(jié)合使用組合酶有效消化和去除了睪丸肌肉組織、結(jié)締組織等多種組織成分以及DNA等，最終將大量白色的睪丸曲精細(xì)管富集出來，獲得的曲精細(xì)管較純且不含其它雜質(zhì)，提取的總蛋白質(zhì)量較好，適合于雙向電泳分析。據(jù)此，發(fā)明人通過不斷摸索和優(yōu)化雙向電泳技術(shù)體系，從而建立了一套水牛睪丸曲精細(xì)管總蛋白樣品的雙向電泳分離方法，該法可獲得質(zhì)量較好、分辨率較高的雙向電泳圖譜，對(duì)于后續(xù)的質(zhì)譜分析和蛋白鑒定具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】水牛睪丸曲精細(xì)管總蛋白樣品的制備方法和雙向電泳分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)提取和蛋白質(zhì)組學(xué)分離【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種水牛睪丸曲精細(xì)管總蛋白樣品的制備方法和雙向電泳分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002]睪丸內(nèi)曲精細(xì)管是精子發(fā)生的重要場所，曲精細(xì)管組織中含有精原細(xì)胞和支持細(xì)胞等，精原細(xì)胞通過自身的分裂和增殖并在支持細(xì)胞的分泌作用下分化成各級(jí)生殖細(xì)胞，支持細(xì)胞對(duì)生精細(xì)胞起著支持、營養(yǎng)和保護(hù)等作用，其對(duì)于精母細(xì)胞最終發(fā)育成具有完整形態(tài)的精子具有至關(guān)重要的作用。目前國內(nèi)外對(duì)于睪丸曲精細(xì)管的研究大多是對(duì)其精原細(xì)胞或支持細(xì)胞進(jìn)行體外分離培養(yǎng)，很少涉及睪丸曲精細(xì)管總蛋白的提取和蛋白質(zhì)組學(xué)研究。
[0003]雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)之一，其基本原理是第一向基于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同在水平方向進(jìn)行等電聚焦分離，第二向根據(jù)蛋白分子量大小在垂直方向進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將復(fù)雜蛋白混合物中的蛋白在二維平面上分離開來，并最終結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對(duì)分離的蛋白進(jìn)行鑒定。然而，該技術(shù)本身存在蛋白分離范圍有限、歧視效應(yīng)及人為誤 差較大等的不足，尤其是所分析蛋白樣品制備的好壞在很大程度上影響雙向電泳技術(shù)的有效性和可靠性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種提取質(zhì)量較好、純度較高的適合于雙向電泳分析的水牛睪丸曲精細(xì)管總蛋白樣品的制備方法。
[0005]本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是提供一種分辨率較高、分離質(zhì)量較好的水牛睪丸曲精細(xì)管總蛋白樣品的雙向電泳分離方法。
[0006]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:水牛睪丸曲精細(xì)管總蛋白樣品的制備方法，包括以下步驟:
[0007](I)用體積濃度75%酒精消毒水牛陰囊皮膚，切開陰囊并剝離其周圍組織，取出睪丸，置于37°C生理鹽水中保存并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室；用PBS反復(fù)沖洗3次，去掉被膜、白膜，剪取一小塊睪丸實(shí)質(zhì)，用鑷子將組織慢慢撕開并置于15mL玻璃管中；
[0008](2)向步驟(1)的15mL玻璃管中加入膠原酶IV和DNase I的混合酶溶液，使睪丸組織與混合酶溶液的質(zhì)量體積比為1:10，置于37°C搖床上震搖2~3h，直到看到大量白色的曲精細(xì)管富集于管底時(shí)停止搖晃，輕輕倒掉上清液，用PBS溶液沖洗2~3次，將純化后的曲精細(xì)管樣品分裝于1.5mL離心管中；
[0009](3)向步驟(2)的1.5mL離心管中加入純化的曲精細(xì)管樣品3~5倍體積的蛋白裂解液，冰浴下震搖30min至曲精細(xì)管樣品充分裂解，4°C、12000g離心10min，收集上清液；
[0010](4)向步驟(3)收集的上清液中加入4倍預(yù)冷丙酮，-20°c靜置2~3h或過夜，4°C、12000g離心30min,棄上清,再用預(yù)冷丙酮洗漆沉淀2~3次,室溫放置IOmin使殘余丙酮盡可能完全揮發(fā)，蛋白沉淀用水化液復(fù)溶，Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，-80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0011]步驟(2)的混合酶溶液按以下步驟配制:將膠原酶IV和DNase I用PBS進(jìn)行溶解分別制成濃度lmg/mL和300 μ g/mL的溶液，然后按照體積比10:3混合，即得。
[0012]步驟(3)的蛋白裂解液組成為7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%CHAPS和1%DTT，每小管分裝lmL，-80°C保存。
[0013]步驟(4)的水化液的組成為8mol/L尿素和2%CHAPS，每小管分裝lmL，_80°C保存。
[0014]用于上述水牛睪丸曲精細(xì)管總蛋白樣品的雙向電泳分離方法，包括以下步驟:
[0015](5)取步驟(4)中得到的蛋白質(zhì)樣品350μ g，選取24cm、pH4~7的IPG膠條進(jìn)行第一向固相PH梯度等電聚焦，在蛋白質(zhì)樣品中加入2.25 μ L IPG Buffer和0.01g DTT，并根據(jù)蛋白質(zhì)樣品上樣體積加入適量水化液使上樣總體積達(dá)到450μ L ;
[0016](6)將步驟(5)中混合均勻的450 μ L上樣溶液緩慢加入膠條槽中，IPG膠條膠面朝下輕輕蓋住樣品混合液，避免產(chǎn)生氣泡，最后加入2~3mL Immobiline DryStrip礦物油覆蓋防止溶液揮發(fā)，蓋上蓋子水平放置于聚焦儀上進(jìn)行等電聚焦；
[0017](7)將步驟(6)中等電聚焦后的IPG膠條放入15mL平衡液I中，于搖床上平衡15min，再使用等體積的平衡液II平衡15min ；
[0018](8)將步驟(7)中 平衡好的膠條轉(zhuǎn)移至12.5%的SDS-PAGE凝膠頂端進(jìn)行第二向垂直電泳，以恒流15mA/gel電泳15min后,增大電流至25mA/gel,直至溴酹藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部停止電泳。
[0019]上述的雙向電泳分離方法，還包括以下步驟:
[0020](9)步驟(8)中第二向SDS-PAGE電泳結(jié)束后，取出玻璃板，將凝膠剝離后進(jìn)行硝酸銀染色，染色結(jié)束后，使用Image Scanner掃描儀掃描凝膠并將圖像保存，應(yīng)用ImageMaster2D platinum 軟件分析圖像。
[0021]步驟(5)的水化液的組成為8mol/L尿素和2%CHAPS，每小管分裝lmL，_80°C保存。
[0022]步驟(6)中等電聚焦按以下程序進(jìn)行:30V，6h (水化)、60V，6h (水化)、200V，Ih (除鹽)、500V，lh (除鹽)、1000V，lh (除鹽)、8000V，lh (升壓)、80000Vhs，IOh (聚焦)、1000V，IOh
(保持)。
[0023]步驟(7)中平衡液I 的的組成為 6mol/L 尿素，2%SDS，1.5mol/L Tris-HCl，87% 甘油，1%DTT ;平衡液 II 的組成為 6mol/L 尿素，2%SDS，1.5mol/L Tris-HCl, 87% 甘油，4%IAA。
[0024]本發(fā)明系國內(nèi)外首次對(duì)于水牛睪丸曲精細(xì)管總蛋白提取和蛋白質(zhì)組學(xué)分離方法進(jìn)行研究。針對(duì)雙向電泳分析對(duì)蛋白樣品要求高的問題，發(fā)明人建立了一種行之有效的水牛睪丸曲精細(xì)管總蛋白樣品的制備方法。該法屬于裂解液提取-丙酮沉淀方法，且方法簡單易行、快速可靠，結(jié)合使用組合酶(即適合比例的膠原酶IV (lmg/mL)和DNase I (300 μ g/mL)混合酶溶液)有效消化和去除了睪丸肌肉組織、結(jié)締組織等多種組織成分以及DNA等，最終將大量白色的睪丸曲精細(xì)管富集出來，獲得的曲精細(xì)管較純且不含其它雜質(zhì)，提取的總蛋白質(zhì)量較好，適合于雙向電泳分析。據(jù)此，發(fā)明人通過不斷摸索和優(yōu)化雙向電泳技術(shù)體系(水化液配方、蛋白上樣量、IPG膠條等參數(shù))，從而建立了一套水牛睪丸曲精細(xì)管總蛋白樣品的雙向電泳分離方法，該法可獲得質(zhì)量較好、分辨率較高的雙向電泳圖譜，對(duì)于后續(xù)的質(zhì)譜分析和蛋白鑒定具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0025]圖1是實(shí)施例1青年期水牛睪丸曲精細(xì)管總蛋白樣品雙向凝膠電泳圖譜。
[0026]圖2是實(shí)施例2老年期水牛睪丸曲精細(xì)管總蛋白樣品雙向凝膠電泳圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0027]實(shí)施例1
[0028]1、水牛睪丸曲精細(xì)管的收集和純化
[0029](I)從本地屠宰場獲取青年期水牛睪丸(用體積濃度75%酒精消毒水牛陰囊皮膚，切開陰囊并剝離其周圍組織，取出睪丸)，置于37°C生理鹽水中保存并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室；用PBS反復(fù)沖洗3次，去掉被膜、白膜，剪取一小塊睪丸實(shí)質(zhì)，用鑷子將組織慢慢撕開并置于15mL玻璃管中；
[0030](2)向步驟(1)中的15mL玻璃管中加入膠原酶IV和DNase I的混合酶溶液(將膠原酶IV和DNase I用PBS進(jìn)行溶解分別制成濃度lmg/mL和300 μ g/mL的溶液，然后按照體積比10:3混合，即得)，使睪丸組織與混合酶溶液的質(zhì)量體積比為1:10，置于37°C搖床上震搖2~3h，直到看到大量白色的曲精細(xì)管富集于管底時(shí)停止搖晃，輕輕倒掉上清液，用PBS溶液沖洗2~3次，將純化后的曲精細(xì)管樣品分裝于1.5mL離心管中。
[0031]2、水牛曲精細(xì)管總蛋白樣品制備
[0032](I)純化后的曲精細(xì)管樣品中加入3~5倍體積的蛋白裂解液(7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS, 1%DTT)，冰浴下震搖30min至曲精細(xì)管樣品充分裂解，4°C、12000g離心IOmin,收集上清液；
[0033](2)向步驟(1)中收集的上清液加入4倍預(yù)冷丙酮，_20°C靜置2~3h或過夜，4°C、12000g離心30min,棄上清,再用預(yù)冷丙酮洗漆沉淀2~3次,室溫放置IOmin使殘余丙酮盡可能完全揮發(fā)，蛋白沉淀用水化液(8mol/L尿素、2%CHAPS)復(fù)溶,Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，_80°C保存?zhèn)溆茫?br> [0034]3、雙向電泳分離
[0035](I)一向等電聚焦:根據(jù)蛋白質(zhì)定量結(jié)果，取蛋白上樣量350μ g，選取24cm、pH4~7的IPG膠條進(jìn)行第一向固相pH梯度等電聚焦，在蛋白質(zhì)樣品中加入2.25 μ L IPGBuffer和0.01g DTT,并根據(jù)蛋白質(zhì)樣品上樣體積加入適量水化液(8mol/L尿素和2%CHAPS)使上樣總體積達(dá)到450 μ L，然后將上樣溶液緩慢加入膠條槽中，IPG膠條膠面朝下輕輕蓋住樣品混合液，避免產(chǎn)生氣泡，最后加入2~3mL Immobiline DryStrip礦物油覆蓋防止溶液揮發(fā)，蓋上蓋子水平放置于聚焦儀上，按照如下程序進(jìn)行等電聚焦:30V，6h、60V，6h、200V，lh、500V, lhUOOOV, lh,8000V, lh、80000Vhs，IOhUOOOV, IOh ；
[0036](2)膠條平衡:將等電聚焦后的IPG膠條放入15mL平衡液I中(6mol/L尿素，2%SDS，1.5mol/L Tris-HCl，87%甘油，1%DTT)，于搖床上平衡15min，再使用等體積的平衡液II (6mol/L 尿素，2%SDS，1.5mol/L Tris-HCl, 87% 甘油，4%IAA)平衡 15min ；
[0037](3)第二向SDS-PAGE電泳:平衡好的膠條轉(zhuǎn)移至12.5%的SDS-PAGE凝膠頂端進(jìn)行第二向垂直電泳，以恒流15mA/gel電泳15min后,增大電流至25mA/gel,直至溴酹藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部停止電泳。[0038]4、凝膠染色及圖像分析
[0039]第二向SDS-PAGE電泳結(jié)束后，取出玻璃板，將凝膠剝離后進(jìn)行硝酸銀染色，染色結(jié)束后，使用Image Scanner掃描儀掃描凝膠并將圖像保存，應(yīng)用Image Master2Dplatinum軟件分析圖像。
[0040]雙向電泳結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明該水牛睪丸曲精細(xì)管總蛋白樣品的制備和分離效果良好，最終得到分辨率較高、重復(fù)性較好的雙向電泳圖譜。
[0041]實(shí)施例2
[0042]1、水牛睪丸曲精細(xì)管的收集和純化
[0043](I)從本地屠宰場獲取老年期水牛睪丸(用體積濃度75%酒精消毒水牛陰囊皮膚，切開陰囊并剝離其周圍組織，取出睪丸)，置于37°C生理鹽水中保存并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。用PBS反復(fù)沖洗3次，去掉被膜、白膜，剪取一小塊睪丸實(shí)質(zhì)，用鑷子將組織慢慢撕開并置于15mL玻璃管中；
[0044](2)向步驟(1)中的15mL玻璃管中加入膠原酶IV和DNase I的混合酶溶液(將膠原酶IV和DNase I用PBS進(jìn)行溶解分別制成濃度lmg/mL和300 μ g/mL的溶液，然后按照體積比10:3混合，即得 )，使睪丸組織與混合酶溶液的質(zhì)量體積比為1:10，置于37°C搖床上震搖2~3h，直到看到大量白色的曲精細(xì)管富集于管底時(shí)停止搖晃，輕輕倒掉上清液，用PBS溶液沖洗2~3次，將純化后的曲精細(xì)管樣品分裝于1.5mL離心管中。
[0045]2、水牛曲精細(xì)管總蛋白樣品制備
[0046](I)純化后的曲精細(xì)管樣品中加入3~5倍體積的蛋白裂解液(7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS, 1%DTT)，冰浴下震搖30min至曲精細(xì)管樣品充分裂解，4°C、12000g離心IOmin,收集上清液；
[0047](2)向步驟(1)中收集的上清液加入4倍預(yù)冷丙酮，_20°C靜置2~3h或過夜，4°C、12000g離心30min,棄上清,再用預(yù)冷丙酮洗漆沉淀2~3次,室溫放置IOmin使殘余丙酮盡可能完全揮發(fā)，蛋白沉淀用水化液(8mol/L尿素、2%CHAPS)復(fù)溶,Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，_80°C保存?zhèn)溆茫?br> [0048]3、雙向電泳分離
[0049](I)一向等電聚焦:根據(jù)蛋白質(zhì)定量結(jié)果，取蛋白上樣量350μ g，選取24cm、pH4~7的IPG膠條進(jìn)行第一向固相pH梯度等電聚焦，在蛋白質(zhì)樣品中加入2.25 μ L IPGBuffer和0.01g DTT,并根據(jù)蛋白質(zhì)樣品上樣體積加入適量水化液(8mol/L尿素和2%CHAPS)使上樣總體積達(dá)到450 μ L，然后將上樣溶液緩慢加入膠條槽中，IPG膠條膠面朝下輕輕蓋住樣品混合液，避免產(chǎn)生氣泡，最后加入2~3mL Immobiline DryStrip礦物油覆蓋防止溶液揮發(fā)，蓋上蓋子水平放置于聚焦儀上，按照如下程序進(jìn)行等電聚焦:30V，6h、60V，6h、200V，lh、500V, lhUOOOV, lh,8000V, lh、80000Vhs，IOhUOOOV, IOh ；
[0050](2)膠條平衡:將等電聚焦后的IPG膠條放入15mL平衡液I中(6mol/L尿素，2%SDS，1.5mol/L Tris-HCl，87%甘油，1%DTT)，于搖床上平衡15min，再使用等體積的平衡液II (6mol/L 尿素，2%SDS，1.5mol/L Tris-HCl, 87% 甘油，4%IAA)平衡 15min ；
[0051](3)第二向SDS-PAGE電泳:平衡好的膠條轉(zhuǎn)移至12.5%的SDS-PAGE凝膠頂端進(jìn)行第二向垂直電泳，以恒流15mA/gel電泳15min后,增大電流至25mA/gel,直至溴酹藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部停止電泳。[0052]4、凝膠染色及圖像分析
[0053]第二向SDS-PAGE電泳結(jié)束后，取出玻璃板，將凝膠剝離后進(jìn)行硝酸銀染色，染色結(jié)束后，使用Image Scanner掃描儀掃描凝膠并將圖像保存，應(yīng)用Image Master2Dplatinum軟件分析圖像。
[0054]雙向電泳結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明該水牛睪丸曲精細(xì)管總蛋白樣品的制備和分離效果良好，最終得到 分辨率較高、重復(fù)性較好的雙向電泳圖譜。
【權(quán)利要求】
1.一種水牛睪丸曲精細(xì)管總蛋白樣品的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)用體積濃度75%酒精消毒水牛陰囊皮膚，切開陰囊并剝離其周圍組織，取出睪丸，置于37°C生理鹽水中保存并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室；用PBS反復(fù)沖洗3次，去掉被膜、白膜，剪取一小塊睪丸實(shí)質(zhì)，用鑷子將組織慢慢撕開并置于15mL玻璃管中； (2)向步驟(1)的15mL玻璃管中加入膠原酶IV和DNaseI的混合酶溶液，使睪丸組織與混合酶溶液的質(zhì)量體積比為1:10，置于37°C搖床上震搖2~3h，直到看到大量白色的曲精細(xì)管富集于管底時(shí)停止搖晃，輕輕倒掉上清液，用PBS溶液沖洗2~3次，將純化后的曲精細(xì)管樣品分裝于1.5mL離心管中； (3)向步驟(2)的1.5mL離心管中加入純化的曲精細(xì)管樣品3~5倍體積的蛋白裂解液，冰浴下震搖30min至曲精細(xì)管樣品充分裂解，4°C、12000g離心10min，收集上清液；(4)向步驟(3)收集的上清液中加入4倍預(yù)冷丙酮，_20°C靜置2~3h或過夜，40C、12000g離心30min,棄上清，再用預(yù)冷丙酮洗滌沉淀2~3次，室溫放置IOmin使殘余丙酮盡可能完全揮發(fā)，蛋白沉淀用水化液復(fù)溶，Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，_80°C保存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(2)的混合酶溶液按以下步驟配制:將膠原酶IV和DNase I用PBS進(jìn)行溶解分別制成濃度lmg/mL和300 μ g/mL的溶液，然后按照體積比10:3混合，即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(3)的蛋白裂解液組成為7mol/L尿素、2mol/L 硫脲、4%CHAPS 和 1%DTT。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于步驟(4)的水化液的組成為8mol/L尿素和 2%CHAPS。
5.用于權(quán)利要求1所述水牛睪丸曲精細(xì)管總蛋白樣品的雙向電泳分離方法，其特征在于包括以下步驟: (5)取步驟(4)中得到的蛋白質(zhì)樣品350μg，選取24cm、pH4~7的IPG膠條進(jìn)行第一向固相pH梯度等電聚焦，在蛋白質(zhì)樣品中加入2.25 μ L IPG Buffer和0.01g DTT，并根據(jù)蛋白質(zhì)樣品上樣體積加入適量水化液使上樣總體積達(dá)到450μ L ; (6)將步驟(5)中混合均勻的450μ L上樣溶液緩慢加入膠條槽中，IPG膠條膠面朝下輕輕蓋住樣品混合液，避免產(chǎn)生氣泡，最后加入2~3mL Immobiline DryStrip礦物油覆蓋防止溶液揮發(fā)，蓋上蓋子水平放置于聚焦儀上進(jìn)行等電聚焦； (7)將步驟(6)中等電聚焦后的IPG膠條放入15mL平衡液I中，于搖床上平衡15min，再使用等體積的平衡液II平衡15min ； (8)將步驟(7)中平衡好的膠條轉(zhuǎn)移至12.5%的SDS-PAGE凝膠頂端進(jìn)行第二向垂直電泳，以恒流15mA/gel電泳15min后,增大電流至25mA/gel,直至溴酹藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部停止電泳。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雙向電泳分離方法，其特征在于還包括以下步驟: (9)步驟(8)中第二向SDS-PAGE電泳結(jié)束后，取出玻璃板，將凝膠剝離后進(jìn)行硝酸銀染色，染色結(jié)束后，使用Image Scanner掃描儀掃描凝膠并將圖像保存,應(yīng)用Image Master2Dplatinum軟件分析圖像。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的雙向電泳分離方法，其特征在于步驟(5)的水化液的組成為8mol/L 尿素和 2%CHAPS。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雙向電泳分離方法，其特征在于步驟(6)中等電聚焦按以下程序進(jìn)行:30V，6h、60V，6h、200V，lh、500V，lhUOOOV, lh,8000V, lh、80000Vhs，IOhUOOOV,10h。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的雙向電泳分離方法，其特征在于步驟(7)中平衡液I的的組成為 6mol/L 尿素，2%SDS，1.5mol/L Tris-HCl，87% 甘油，1%DTT ;平衡液 II 的組成為 6mol/L 尿素，2%SDS，1.5mol/L Tris-HCl, 87% 甘油，4%IAA。
【文檔編號(hào)】G01N27/26GK103951730SQ201410160031
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年4月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月21日
【發(fā)明者】張明, 黃愉淋, 付強(qiáng), 黃德倫 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)