專利名稱：一種耐高溫中性纖維素酶Cel6及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種耐高溫中性纖維素酶Cel6及其基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生物質(zhì)的再生和降解是自然界中一個非常重要的環(huán)節(jié)，自然界中每年有15%的總碳通過植物被固定，其中50%的固定碳形成了結(jié)構(gòu)多糖和木質(zhì)素，通常將這一部分稱為木質(zhì)纖維素(Sandgren et al. Prog Biophys Mol Bio, 2005,89 :246-291.)。植物通過光和作用每年可產(chǎn)生約400億噸木質(zhì)纖維素，木質(zhì)纖維素主要由纖維素、木質(zhì)素和半纖維組成，還含有少量的灰分、蛋白質(zhì)和果膠(Dashtban et al. Int J Biol Sci, 2009, 5 :578-595.)。 纖維素的降解需要纖維素酶，纖維二糖水解酶，葡萄糖苷酶將纖維寡糖，二糖水解得到葡萄糖。纖維素酶廣泛存在于自然界的生物體中，按纖維素酶催化反應(yīng)的最適pH值，可將其分為酸性纖維素酶(最適PH值為3-5)、中性纖維素酶(最適pH值為6-8)和堿性纖維素酶(最適 PH 值為 8-11) (Zhang YHP，et al. Biotechnol Adv 2006，24 :62-481.)。纖維素酶在造紙、釀造、紡織、飼料、生物能源等領(lǐng)域均具有廣泛的應(yīng)用前景(WongKK, et al. Microbiol Rev 1988，52 :305-317.)。但是，不同的工業(yè)應(yīng)用需求不同性質(zhì)的纖維素酶，例如，飼料工業(yè)需要嗜酸的纖維素酶，紡織工業(yè)需要中性耐堿的纖維素酶。目前工業(yè)上廣泛應(yīng)用的木霉所產(chǎn)纖維素酶最適pH在5. O左右，最適溫度在50-60°C之間，不能滿足棉織品水洗整理工業(yè)、造紙制漿業(yè)的工業(yè)要求。由于棉纖維耐堿不耐酸，強(qiáng)酸性處理后易損壞(許愛國等，中性纖維素酶在棉織物整理中的應(yīng)用，印染,2006，21，11-12)。目前，國內(nèi)紡織工業(yè)主要依賴進(jìn)口，且價格昂貴。因此，獲得新型具有耐堿高溫的中性纖維素酶的研究具有重大意義?？寺『头蛛x具有中性、熱穩(wěn)定性好的纖維素酶可以更好的應(yīng)用于紡織等領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能高效應(yīng)用的耐高溫中性纖維素酶。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述耐高溫中性纖維素酶的基因。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述耐高溫中性纖維素酶的基因工程方法。本發(fā)明的另一目的提供上述耐高溫中性纖維素酶的應(yīng)用。本發(fā)明從瓶霉(Phialophora sp. G5)中分離得到一種新的耐高溫中性纖維素酶Cel6。本發(fā)明提供了一種耐高溫中性纖維素酶Cel6，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。SEQ ID NO. I MTAKHVFLAAALAATALAAPVSESQNCASEWGQCGGTGFTGASCCASGSTCTQQNEYYSQCVPGSQVTTGQIASTPAATVVGSATMGSSPSQMTAPAASASGTTSYSGNPFEGVQMWANAYYASEVLNLAVPSLSGDMVAKASAVAKVPSFQWLDTAAKVPTVMADTLADIAKANQAGASPAYAGLFVVYDLPDRDCAAAASNGEYSIADNGVANYKAYIDAIKAQLVANSDTRILLVVEPD SLANLVTNMNVAKCANAHDAYLECINYAVTQLNLPNVAMYLDAGHAGffLGffSANLQPAATLFANVYSNAGKPASLRGLATNVANYNAWTIASAPSYTQGDSNYDEKLYVQALSPLLSSAGWDAHFITDQSRSGKQPTGQNAWGDWCNVIGTGFGTRPTTDTGLDIEDALVWVKPGGECDGTSNTTAARYDYHCGLSDALQPSPEAGTWFQAYFVQLLTNANPAF其中，該酶基因編碼466個氨基酸，N端18個氨基酸為其預(yù)測的信號肽序列^mtakhvfIaaalaatala^ (SEQ ID NO. 3)。因此，成熟的中性纖維素酶Cel6的理論分子量為46. 6kDa，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示APVSESQNCASEWGQCGGTGFTGASCCASGSTCTQQNEYYSQCVPGSQVTTGQIASTPAATVVGSATMGSSPSQMTAPAASASGTTSYSGNPFEGVQMWANAYYASEVLNLAVPSLSGDMVAKASAVAKVPSFQWLDTAAKVPTVM ADTLADIAKANQAGASPAYAGLFVVYDLPDRDCAAAASNGEYSIADNGVANYKAYIDAIKAQLVANSDTRILLVVEPDSLANLVTNMNVAKCANAHDAYLECINYAVTQLNLPNVAMYLDAGHAGWLGWSANLQPAATLFANVYSNAGKPASLRGLATNVANYNAWTIASAPSYTQGDSNYDEKLYVQALSPLLSSAGWDAHFITDQSRSGKQPTGQNAWGDffCNVIGTGFGTRPTTDTGLDIEDALVWVKPGGECDGTSNTTAARYDYHCGLSDALQPSPEAGTWFQAYFVQLLTNANPAF本發(fā)明的中性纖維素酶Cel6同時具有好的熱穩(wěn)定性而且在中性和堿性的范圍內(nèi)均具有高活性等特性。本發(fā)明篩選到的纖維素酶，其最適PH值為7. Q，并在pH 4. O 11. O范圍內(nèi)具有40%以上的酶活力；最適溫度為65°C，在80°C處理60min后仍具有60%左右的酶活力。本發(fā)明提供了編碼上述耐高溫中性纖維素酶的基因cel6。具體地，該基因的序列如 SEQ ID NO. 3 所示atgactgccaaacacgtctttctcgcggccgctctcgcagcgacagcgctggccgccccggtttccgaaagccagaactgtgcttcagaatgggggcaatgcggaggtactggcttcacaggcgcaagctgctgtgcgtcagggagcacgtgtacgcagcagaacgaatactattcccaatgcgtaccggggagccaggtaacaaccggccagatcgccagtaccccggcggcgaccgtggttggctccgccaccatggggagctcccctagccagatgaccgcgccggcagcctccgcctcgggcacaacgtcgtacagcgggaatcccttcgagggcgtgcagatgtgggccaacgcctactacgcctccgaggtgctcaacctcgcggtgcccagcctgagcggcgacatggtggccaaggcctctgccgtggccaaggtgcccagcttccagtggctggacacggccgccaaggtgcccaccgtcatggccgacaccctcgccgacatcgcgaaggccaaccaggccggggccagccctgcgtacgcgggtctcttcgtcgtgtacgacctgccggaccgcgactgcgccgccgcggcgtccaacggcgagtacagcatcgctgacaacggggtggccaactacaaggcgtacatcgacgccatcaaggcccagctggtggccaactcggacacccgcatcctgctggtggtggagccggactcgctggccaacctggtgaccaacatgaacgtcgccaagtgtgccaacgcccacgacgcgtacctcgagtgcatcaactacgccgtcacccagctcaacctgcccaacgtggccatgtacctcgacgccggccacgccggctggctcggctggagcgccaacctgcagcccgccgccaccctcttcgccaacgtgtactccaacgccggcaagcccgccagcctgcgcggcctggccaccaacgtcgccaactacaacgcctggaccatcgcctccgcgccttcctacacccagggcgacagcaactacgacgagaagctgtacgtgcaggccctctccccgctcctcagctccgccggctgggacgcccacttcatcaccgaccagagccgctccggcaagcagccgacgggccagaatgcttggggcgactggtgcaacgtgatcggcacagggttcggcacgcgtccgaccaccgacaccgggctggacatcgaggatgccctcgtctgggtgaagcccggcggcgaatgcgacggcacgagcaacaccaccgcggcccgctacgactaccactgcggcctctccgacgctctgcagccctcgcccgaggccggcacctggttccaggcatacttcgtgcagcttctca
ccaacgccaacccggccttctaa去除信號肽序列后的基因序列SEQ ID NO. 4 gccccggtttccgaaagccagaactgtgcttcagaatgggggcaatgcggaggtactggcttcacaggcgcaagctgctgtgcgtcagggagcacgtgtacgcagcagaacgaatactattcccaatgcgtaccggggagccaggtaacaaccggccagatcgccagtaccccggcggcgaccgtggttggctccgccaccatggggagctcccctagccagatgaccgcgccggcagcctccgcctcgggcacaacgtcgtacagcgggaatcccttcgagggcgtgcagatgtgggccaacgcctactacgcctccgaggtgctcaacctcgcggtgcccagcctgagcggcgacatggtggccaaggcctctgccgtggccaaggtgcccagcttccagtggctggacacggccgccaaggtgcccaccgtcatggccgacaccctcgccgacatcgcgaaggccaaccaggccggggccagccctgcgtacgcgggtctcttcgtcgtgtacgacctgccggaccgc gactgcgccgccgcggcgtccaacggcgagtacagcatcgctgacaacggggtggccaactacaaggcgtacatcgacgccatcaaggcccagctggtggccaactcggacacccgcatcctgctggtggtggagccggactcgctggccaacctggtgaccaacatgaacgtcgccaagtgtgccaacgcccacgacgcgtacctcgagtgcatcaactacgccgtcacccagctcaacctgcccaacgtggccatgtacctcgacgccggccacgccggctggctcggctggagcgccaacctgcagcccgccgccaccctcttcgccaacgtgtactccaacgccggcaagcccgccagcctgcgcggcctggccaccaacgtcgccaactacaacgcctggaccatcgcctccgcgccttcctacacccagggcgacagcaactacgacgagaagctgtacgtgcaggccctctccccgctcctcagctccgccggctgggacgcccacttcatcaccgaccagagccgctccggcaagcagccgacgggccagaatgcttggggcgactggtgcaacgtgatcggcacagggttcggcacgcgtccgaccaccgacaccgggctggacatcgaggatgccctcgtctgggtgaagcccggcggcgaatgcgacggcacgagcaacaccaccgcggcccgctacgactaccactgcggcctctccgacgctctgcagccctcgcccgaggccggcacctggttccaggcatacttcgtgcagcttctcaccaacgccaacccggccttctaa本發(fā)明通過RT-PCR的方法分離克隆了耐高溫中性纖維素酶基因cel6，DNA全序列分析結(jié)果表明，中性纖維素酶Cel6的基因全長1401bp。成熟蛋白理論分子量為46. 6kDa，將纖維素酶基因cel6序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對，該基因與來源于Talaromyces emersonii的cellobiohydrolase (EC 3. 2. I. 91)氨基酸序列一致性為67% 說明Cel6是一種新的纖維素酶。本發(fā)明還提供了包含上述耐高溫中性纖維素酶基因cel6的重組載體，命名為pPIC-cel6。將本發(fā)明的纖維素酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將本發(fā)明的纖維素酶成熟蛋白基因插入到質(zhì)粒PPIC9上的EcoR I和NotI限制性酶切位點(diǎn)之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9-cel6。本發(fā)明還提供了包含上述耐高溫中性纖維素酶基因cel6的重組菌株，優(yōu)選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選為重組菌株GS115/cel6。本發(fā)明還提供了一種制備耐高溫中性纖維素酶Cel6的方法，包括以下步驟I)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組纖維素酶表達(dá)；
3)回收并純化所表達(dá)的纖維素酶Cel6。其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母細(xì)胞、啤酒酵母細(xì)胞或多型遜酵母細(xì)胞，優(yōu)選將重組酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞(Pichia pastoris)GS115，得到重組菌株GS115/cel60本發(fā)明還提供了上述耐高溫中性纖維素酶Cel6的應(yīng)用。本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有酸性纖維素酶在紡織工業(yè)上應(yīng)用的不足，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的、適合于在中堿性PH環(huán)境下應(yīng)用新的中性纖維素酶。本發(fā)明中來源于瓶霉屬Phialophora sp. G5的纖維素酶Cel6具有以下性質(zhì)最適pH7. O,并在PH5. O 8. O范圍內(nèi)具有60%以上的酶活力，具有很好的pH穩(wěn)定性，37°C下作用2h后，在pH 2. 0-11. O之間，剩余酶活性均在80%以上。最適溫度65°C，良好的熱穩(wěn)定性，80°C都有較好的穩(wěn)定性，保溫60min后仍保持60%以上的酶活。中性和堿性范圍內(nèi)具有較高酶活力，良好的PH和熱穩(wěn)定性等特性使其在紡織工業(yè)應(yīng)用上具有很大的潛力。其耐高溫特性，可使 其在需求耐高溫環(huán)境的工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用。本纖維素酶可應(yīng)用于紡織、能源工業(yè)。


圖I重組纖維素酶的最適pH。圖2重組纖維素酶的pH穩(wěn)定性。圖3重組纖維素酶的最適溫度。圖4重組纖維素酶的熱穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式試驗材料和試劑I、菌株及載體1、菌株及載體本發(fā)明從瓶霉(Phialophora sp.)中分離得到一種新的耐高溫中性纖維素酶Cel6。畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9及菌株GS115購自于Invitrogen 公司。2、酶類及其它生化試劑內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。購自Sigma公司，其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。3、培養(yǎng)基(I) LB培養(yǎng)基1% NaCl, O. 5%酵母提取物，I %蛋白胨⑵YPD培養(yǎng)基2 %葡萄糖，I %酵母提取物，2 %蛋白胨(3)MM 固體培養(yǎng)基瓊脂粉 I. 7% (w/v), YNB I. 34% (w/v)，生物素 4X 10-5% (w/ν),甲醇 O. 5% (ν/ν)(4)MD固體培養(yǎng)基以2% (w/v)的葡萄糖代替甲醇，其余同麗固體培養(yǎng)基(5) BMGY培養(yǎng)基酵母提取物I % (w/v)，蛋白胨2 % (w/v)，甘油I % (ν/ν)，生物M 4X10-5% (w/v), YNB I. 34% (w/v)(6) BMMY培養(yǎng)基以O(shè). 5%甲醇代替甘油，其余同BMGY培養(yǎng)基說明以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗方法，均參照《分子克隆實(shí)驗指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。
實(shí)施例I瓶霉Phialophora sp.纖維素酶編碼基因cel6的克隆提取瓶霉Phialophora sp.基因組 DNA:采用CTAB法提取真菌基因組，參見(Graham et al.，1994)，有所修改①離心取真菌培養(yǎng)物約2g，盡量除去培養(yǎng)基，在液氮中充分研磨幾次；②加入15-20mL預(yù)熱的CTAB裂解液(一般O. 5_lg加3mL)，混勻后于65°C溫育2h,中間每15min混勻一次；③加入等體積的Tris飽和酚和氯仿的等體積混合物，混勻后，12，OOOg 4°C離心15min，然后將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中(視蛋白殘留的程度重復(fù)一次)；④上清液中加入等體積的氯仿，混勻后，12，OOOg 4°C離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移到 新的離心管中；⑤在上清液中加入等體積的_20°C預(yù)冷的異丙醇，-20°C靜置30min以上，離心棄
上清；⑥沉淀用70%乙醇漂洗兩次，然后真空抽干，重懸于500 μ LI蒸餾水；⑦加入10 μ LRNase (10mg/mL), 37°C處理 30min 以上；⑧采用DNA純化試劑盒進(jìn)行純化，以提高DNA的濃度和純度。 根據(jù)第六家族纖維素酶基因的保守(YDLPGRDC和KPGGE⑶)序列設(shè)計合成了簡并引物 CBhGH6-F，CBhGH6-RCBhGH6-F 5/ -TACGACCTTCCGGINMGIGAYTG-3'；CBhGH6-R 5/ -CCATCGCACTCNCCNCCIGKYTT-3')。以Phialophora sp. G5CGMCC 3328總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參數(shù)為94°C變性5min ;然后94°C變性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸lmin，30個循環(huán)后72°C保溫lOmin。得到一約698bp片段，將該片段回收后與pEASY_T3載體相連送博邁德公司測序。根據(jù)測序得到的核苷酸序列，設(shè)計上游和下游各三條TAIL-PCR特異性引物設(shè)計方向為需要擴(kuò)增的未知區(qū)域方向，sp2的位置設(shè)計在spl的內(nèi)側(cè)，sp3位于sp2的內(nèi)側(cè)。每兩個引物之間的距離沒有嚴(yán)格規(guī)定，引物長度一般22 30nt，退火溫度在60 65°C。并將它們分別命名為Cel6upl、Cel6up2、Cel6up3 (上游特異性引物)、Cel6dpl、Cel6dp2、Cel6dp3(下游特異性引物)見表I。表I.纖維素酶Cel6TAIL_PCR特異性引物
權(quán)利要求
1.一種耐高溫中性纖維素酶Cel6，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I或2所
2.一種耐高溫中性纖維素酶基因cel6，其特征在于，編碼權(quán)利要求I所述的耐高溫中性纖維素酶Cel6。
3.如權(quán)利要求2所述的耐高溫中性纖維素酶基因cel6，其特征在于，其堿基序列如SEQID NO. 4 所示。
4.包含權(quán)利要求2所述耐高溫中性纖維素酶基因cel6的重組載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為載體pPIC-Cel6
6.包含權(quán)利要求2所述耐高溫中性纖維素酶基因cel6的重組菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，
8.一種制備權(quán)利要求I所述耐高溫中性纖維素酶cel6的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)用權(quán)利要求4的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株； 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組纖維素酶表達(dá)； 3)回收并純化所表達(dá)的纖維素酶Cel6。
9.權(quán)利要求I所述耐高溫中性纖維素酶Cel6的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種耐高溫中性纖維素酶Cel6及其基因。本發(fā)明提供了一種來源于瓶霉屬Phialophora sp.的纖維素酶Cel6，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本發(fā)明提供了編碼上述中性纖維素酶的編碼基因cel6。本發(fā)明的纖維素酶具有以下性質(zhì)最適pH7.0，在pH4.0～11.0保持40％以上的酶活，最適溫度65℃，具有良好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。做為一種新型的酶制劑，可廣泛用于紡織、能源工業(yè)等。
文檔編號C12N15/56GK102827818SQ201110159738
公開日2012年12月19日 申請日期2011年6月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月15日
發(fā)明者王興吉, 郭慶文, 王忠連, 李芳芳, 劉文龍, 孫碩, 錢娟娟 申請人:山東隆科特酶制劑有限公司