專利名稱：一種產膽鹽水解酶的基因工程菌及其構建方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種產膽鹽水解酶的基因工程菌及其構建方法和應用，屬于基因工程技術領域。
背景技術：
膽汁中的膽汁酸均以鈉鹽或鉀鹽形式存在，即膽汁酸鹽，簡稱膽鹽(bile salts)。。膽汁酸可分為兩類一類是初級膽汁酸(primary bile acids)，由肝細胞合成，包括膽酸、鵝脫氧膽酸及其與甘氨酸和牛磺酸結合的產物。另一類是次級膽汁酸(secondary bile acids)，是初級膽汁酸在腸道中受細菌作用生成的脫氧膽酸和石膽酸及其在肝中生成的結合產物。人膽汁中的膽汁酸以結合型為主。膽鹽水解酶是乳酸菌的一種代謝產物，該酶能水解結合態(tài)膽鹽，使結合態(tài)膽鹽降解為游離態(tài)膽鹽和氨基酸。很多膽鹽水解酶已經從各種微生物中得以純化和鑒定，目前已經檢測到BSH酶活性的菌有乳桿菌，雙歧桿菌，腸球菌，梭狀芽孢桿菌，類桿菌和鏈球菌等。 但是，國內關于乳酸菌產膽鹽水解酶的文章報道和專利報道很少。微生物膽鹽水解酶的作用主要有以下幾個方面(1)對菌體自身的影響營養(yǎng)價值、脫除膽汁的毒害作用、提高菌體的存活率、改變細胞膜的特性等；(2)對宿主的作用降低血清膽固醇、消弱對脂肪的消化吸收等。國內外大量臨床實驗證實，服用益生菌及其相關制品具有減少人體血清膽固醇含量，降低心血管疾病發(fā)病率的功效。而且許多實驗實驗證明膽鹽水解酶和益生菌降低膽固醇作用有密切關系。Klaver等利用許多株乳桿菌和雙歧桿菌進行的降膽固醇實驗研究證實乳酸菌產生的膽鹽水解酶可以使結合態(tài)膽鹽分解為游離膽鹽，后者與膽固醇形成復合物共同沉淀下來，從而導致環(huán)境中膽固醇含量的降低。也有人認為由于膽固醇是形成膽酸的前體物，部分膽固醇需要轉化為膽酸以彌補被分解后排出體外的部分，這樣就加速了膽固醇的分解代謝，從而導致膽固醇濃度的降低。Verstrate認為乳酸菌的高膽鹽水解酶活力這一特征在降低膽固醇含量方面起著重要作用。此外，Ahn認為乳酸菌的膽鹽水解酶在降低膽固醇方面有重要作用。利用基因工程或發(fā)酵工程來研究BSH的過量表達，可以提高益生菌株在腸道中的存活能力。這為研究膽鹽水解酶對菌體自身和宿主的作用提供了一定的基礎。另外，運用純的膽鹽水解酶或含膽鹽水解酶的菌株來控制血清中膽固醇水平(如口服活菌細胞療法) 將具有很大的前景。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種產鹽水解酶的基因工程菌，是將膽鹽水解酶基因導入大腸桿菌得到的基因工程菌，已于2011年4月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢、武漢大學，保藏編號為CCTCC NO =M 2011115，分類學命名為大腸埃希氏菌BL21(DE3)-p ET28a(+)-bsh(Escherichia coli BL21 (DE3)-pET28a(+)-bsh)
本發(fā)明還提供了一種產鹽水解酶基因工程菌的構建方法，包括如下步驟1)設計引物以CCTCC NO =M 2011116的基因組DNA為模板擴增出bsh基因；2)將bsh基因連接到大腸桿菌表達載體pET28a⑴，得到重組載體 pET28a(+)-bsh ；3)重組載體轉化 Escherichia coli BL21(DE3)。所述引物根據(jù)NCBI網站發(fā)表的Lactobacillus ρlantarum WCFS中膽鹽水解酶的基因序列設計，引物序列如下bshl-F :5’ -CGGGATCCATGTGTACTGCCATA ACTTATCA ATCTT-3’bshl-R 5' -CCCAAGCTTGTTAACTGCATAGTATTGTGCTTCTGAT-3’PCR反應體系0. 2mL PCR管中按順序加入以下試劑10XLA PCR buffer 11 (Mg2+plus) 5 μ 1 ；DNTP Mixture 8 μ 1 ；模板 DNA 1 μ 1 ；上下游引物各 2 μ 1 ；Taq 酶 0. 5 μ 1 ；加雙蒸水至終體積為50 μ 1。PCR 擴增條件94°C預變性 5min ；94°C變性 30s，57°C退火 90s，72°C延伸 Imin (30 個循環(huán))；72°C延伸IOmin0將膠回收純化后的PCR產物用BamH I和Hind III酶切后連接到大腸桿菌表達載體pED8a(+)，得到重組載體pEI^8a(+)-bsh，轉化fecherichia coli BL21 (DE!3)，經篩選鑒定獲得重組菌 Escherichia coli BL21 (DE3)-pET28a(+)-bsh。膽鹽水解酶酶活測定方法將發(fā)酵液離心IOmin(10000Xg，4°C )收集菌體，再用 0. IM磷酸鹽緩沖液(pH 7. 0)洗滌離心2次，調整菌濃在600nm下吸光度為10。取ImL上述細胞懸濁液，超聲破碎3min (工作時間間歇時間=2 3)，隨即離心IOmin (10，000 X g， 4°C )去除細胞碎片，得到無細胞提取物(cell free extract, CFE)。取0. ImL上清液加入1. 8mL 0. IM磷酸鹽緩沖液(pH 6. 0)和0. ImL結合膽鹽QOOmM)中混合，并置于37°C 孵育30min，取0. 5mL上述反應液加入0. 5mL15%三氯乙酸(w/t)終止反應，混合均勻，離心IOmin(離心機最大轉速，4°C )取上清。將0. ImL上清液與1. 9mL茚三酮顯色液(包括 0. 5mL 1 %茚三酮(溶解于0. 5M檸檬酸緩沖液(ρΗ5· 5)中)、1. 2mL甘油和0. 2mL 0. 5M的檸檬酸緩沖液(PH5. 5))混合，震蕩混勻，沸水浴Hmin。冷卻^iin后測定570nm下的吸收值。標準曲線用甘氨酸或?；撬嶂谱?。本發(fā)明的有益效果CCTCC NO =M 2011115在發(fā)酵結束后對甘氨脫氧膽酸鈉 (⑶CA)的總酶活高達3. 7819U/mL,比野生菌的總酶活提高了近11倍，為膽鹽水解酶的大規(guī)模生產以及其作為功能食品來降低血清膽固醇奠定了良好的基礎。生物材料樣品保藏一株高產膽鹽水解酶的重組大腸桿菌，其分類學命名為大腸埃希氏菌BL21(DE3 )-pET28a (+) -bsh (Escherichia coli BL21 (DE3)-pET28a (+)-bsh)，該菌株于 2011 年 4 月 9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢、武漢大學，保藏編號為CCTCC NO =M 2011115。


圖1 (a)目的基因的擴增。M =DL 2，000 DNA Marker ；泳道1和泳道2 :bsh基因的PCR擴增條帶；(b)菌落PCR挑選陽性重組子。M =DL 2，OOODNAMarker ；泳道1和泳道2 陽性重組子；泳道3 5 假陽性。圖2 (a)重組質粒的提取。M =DL 10, 000 DNA Marker ；泳道1和泳道2 重組質粒 pET 28a(+) -bsh ； (b)雙酶切驗證。M =DL 10，OOODNAMarker ；泳道 1 重組質粒 pET 28a(+)-bsh ；泳道2 重組質粒用BamH I和Hind III雙酶切后得到的條帶。圖3 蛋白電泳(SDS-PAGE)實驗結果。M 蛋白質分子量標準(Protein Molecular Weight Marker) ；1 含有 pET 28a(+)的 E.coli BL21(DE3) ；2:含有 pET 28a(+)的 E.coli BL21 (DE3)經過1. OmM IPTG誘導；3 重組菌；4 重組菌經過1. OmMIPTG誘導。圖4 重組菌對甘氨脫氧膽酸鈉(⑶CA)的總酶活以及和野生菌的總酶活的比較。
具體實施例方式實施例1重組菌的構建及鑒定1)從植物乳桿菌Lactobacillus ρlantarum ΒΒΕ7提取基因組DNA作模板，進行 PCR擴增，引物為bshl-F :5，-CGGGATCCATGTGTACTGCCATA ACTTATCAATCTT-3，bshl-R 5' -CCCAAGCTTGTTAACTGCATAGTATTGTGCTTCTGAT-3’植物乳桿菌Lactobacillus ρ lantarum BBE7已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏編號為CTCC M 2011116。0. 2mL PCR 管中按順序加入以下試劑10XLA PCR buffer II (Mg2+plus) 5 μ 1 ； DNTP Mixture 8 μ 1 ；模板DNA 1 μ 1 ；上下游引物各2 μ 1 ；Taq酶0. 5 μ 1 ；加雙蒸水至終體積為50 μ 1。按下列程序進行PCR擴增94°C預變性5min ；94°C變變性30s，57°C退火90s， 72°C 延伸 Imin (30 個循環(huán))；72°C 延伸 IOmin。2)以瓊脂糖凝膠電泳驗證并以0. 8%瓊脂糖凝膠電泳回收PCR擴增產物，結果擴增得到與文獻報道大小相符的bsh基因片段(圖Ia-泳道1、泳道2)。3)用限制性內切酶BamH I和Hind III雙酶切消化純化后的bsh基因和載體pET ^a(+)，用T4DNA連接酶于16°C過夜連接，連接產物用化學轉化法轉化宿主菌JM109，轉化菌液涂布在含有卡那霉素(30mg/mL)的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)，以bshl_F和bshl-R為引物進行菌落PCR的方法鑒定陽性克隆子(圖Ib-泳道1、泳道2)，最終獲得含有bsh基因的重組表達質粒pET 28a(+)-bsh(圖2a-泳道1、泳道幻，用雙酶切進行驗證(圖2b_泳道 2)。大腸桿菌化學轉化為取連接產物5μ 1加入到含有100μ 1 JM109感受態(tài)細胞中，充分混勻后，冰浴30min ；將裝有混合物的Eppendorf管，42°C水浴熱休克90s，然后將Eppendorf管立即轉移到冰上冷卻aiiin ；向管中加入600 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，置于 370C 200rpm恒溫搖床上培養(yǎng)lh，然后涂布于含有卡那霉素的平板上，37°C向上放置lh，倒置培養(yǎng)12-1 后觀察菌落。4)將重組質粒 pET 28a(+)-bsh 轉化 Escherichia coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞， 得到能在含有卡那霉素(30mg/mL)的LB平板上正常生長的基因工程菌，并經過鑒定命名為 Escherichia coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bsh。實施例2重組菌的酶活測定和蛋白電泳培養(yǎng)基種子和斜面培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基(IL)胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaClIOg,用IN NaOH將pH調至7. 0 ；斜面培養(yǎng)基添加瓊脂15g ；基本發(fā)酵培養(yǎng)基為TB培養(yǎng)基 (IL)去離子水900mL，胰蛋白胨12g，酵母抽提物Mg，甘油10mL，高壓滅菌，冷卻至60°C， 加IOOmL滅菌磷酸鉀緩沖液；培養(yǎng)方法將20°C、200rpm下培養(yǎng)到OD6tltl在0. 6 0. 7之間的種子以2%的接種量轉入基本發(fā)酵培養(yǎng)基，于2(rC、200rpm條件下培養(yǎng)；誘導條件誘導OD值為0. 6，重組菌在20°C誘導35小時，IPTG濃度為1. OmM。以空載體作為對照，通過蛋白電泳(SDS-PAGE)得到一條分子量大小約為37. 5kDa 的蛋白條帶(見圖3)，同時測定該重組菌對甘氨脫氧膽酸鈉(GDCA)的總酶活，總酶活為 3. 7819U/mL比野生菌的總酶活(0. 322U/mL)提高了近11倍(見圖4)。
權利要求
1.一種產膽鹽水解酶的基因工程菌，是將膽鹽水解酶基因導入大腸桿菌得到的基因工程菌。
2.權利要求1所述基因工程菌，其特征在于，是將植物乳桿菌來源的膽鹽水解酶基因連接到大腸桿菌表達載體pET 28a(+)并轉化hcherichia coli BL21 (DE!3)得到的基因工程菌。
3.權利要求1或2所述基因工程菌，于2011年4月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號 CCTCC NO =M 2011115。
4.一種權利要求1所述基因工程菌的構建方法，包括如下步驟1)設計引物以CCTCCNO =M 2011116的基因組DNA為模板擴增出bsh基因；2)將bsh基因連接到大腸桿菌表達載體pET28a(+)，得到重組載體pET28a (+) -bsh ；3)重組載體轉化Escherichiacoli BL21 (DE3)得到基因工程菌CCTCC NO :M 2011115。
5.權利要求4所述方法，其特征在于，引物根據(jù)NCBI網站發(fā)表的Lactobacillus ρlantarum WCFS中膽鹽水解酶的基因序列設計。
6.權利要求4或5所述方法，其特征在于，所述引物如下bshl-F 5' -CGGGATCCATGTGTACTGCCATAACTTATCAATCTT-3’b sh1-R 5 ’ -CCCAAGCTTGTTAACTGCATAGTATTGTGCTTCTGAT-3’
7.權利要求1所述菌株生產膽鹽水解酶的方法，其特征在于1)培養(yǎng)基種子和斜面培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基(IL)胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl IOg,用IN NaOH將pH調至7. 0 ；斜面培養(yǎng)基添加瓊脂15g ；基本發(fā)酵培養(yǎng)基為TB培養(yǎng)基 (IL)去離子水900mL，胰蛋白胨12g，酵母抽提物Mg，甘油10mL，高壓滅菌，冷卻至60°C， 加IOOmL滅菌磷酸鉀緩沖液；2)培養(yǎng)方法將20°C、200rpm下培養(yǎng)到OD6tltl在0.6 0. 7之間的種子以2%的接種量轉入基本發(fā)酵培養(yǎng)基，于2(rC、200rpm條件下培養(yǎng)；3)誘導條件誘導OD值為0.6，重組菌在20°C誘導35小時，IPTG濃度為1. OmM。
8.權利要求1所述菌株在膽鹽水解酶生產中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產膽鹽水解酶的基因工程菌及其篩構建方法和應用，屬于基因工程技術領域。本發(fā)明采用重組DNA技術將植物乳桿菌Lactobacillus plantarum BBE7的膽鹽水解酶(bsh)基因克隆連接到大腸桿菌表達載體pET28a(+)，并轉化Escherichia coli BL21(DE3)，經篩選鑒定得到一株可以產較高活性膽鹽水解酶的重組大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bsh，保藏編號為CCTCC NOM2011115。該菌株表達的膽鹽水解酶對甘氨脫氧膽酸鈉(GDCA)的總酶活為3.7819U/ml，比野生菌的總酶活提高了近11倍。這為膽鹽水解酶的大規(guī)模生產以及其作為功能食品來降低血清膽固醇奠定了良好的基礎。
文檔編號C12N9/14GK102220276SQ201110119810
公開日2011年10月19日 申請日期2011年5月10日 優(yōu)先權日2011年5月10日
發(fā)明者堵國成, 張娟, 李華鐘, 董自星, 陳堅 申請人:江南大學