專利名稱：基于dr5的植物活體中生長(zhǎng)素的原位實(shí)時(shí)測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物激素檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種基于生長(zhǎng)素響應(yīng)元件/ 飯的植物活體中生長(zhǎng)素(吲哚乙酸)的原位實(shí)時(shí)測(cè)定方法。
背景技術(shù)：
植物激素作為微量信號(hào)分子，調(diào)節(jié)植物體幾乎所有的生長(zhǎng)發(fā)育過程。對(duì)植物激素作用機(jī)理的深入研究，不僅有利于深入揭示植物生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)理等前沿科學(xué)問題，而且能夠?yàn)樽魑镞z傳改良等應(yīng)用領(lǐng)域提供強(qiáng)有力的理論支撐，在推動(dòng)“綠色革命”、大幅度提高作物產(chǎn)量與品質(zhì)和保證國(guó)家糧食安全方面發(fā)揮無可替代的重要作用。近年來，隨著植物分子生物學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，以擬南芥和水稻為代表的模式植物基因組研究不斷取得突破， 使本身就處于科學(xué)前沿的植物激素研究進(jìn)入了全新的快速發(fā)展階段。與此同時(shí)，作為關(guān)鍵支撐技術(shù)的植物激素成分分析及檢測(cè)方法已開始成為開展植物激素研究領(lǐng)域的限制因子之一。生長(zhǎng)素(IAA)是最早發(fā)現(xiàn)的植物激素，在調(diào)節(jié)植物從胚胎發(fā)生到成熟的生長(zhǎng)進(jìn)程中起著決定性作用。由于生長(zhǎng)素的作用具有明顯的時(shí)空特異性，不同細(xì)胞間細(xì)微的生長(zhǎng)素濃度梯度足以引起細(xì)胞發(fā)育方向的徹底改變，如決定干細(xì)胞的維持與分化或器官原基的是否發(fā)生。因此，準(zhǔn)確掌握生長(zhǎng)素在組織和細(xì)胞水平的原位實(shí)時(shí)分布，對(duì)于深入闡明生長(zhǎng)素介導(dǎo)的生長(zhǎng)發(fā)育過程的有關(guān)機(jī)制十分必要和迫切。1擬8年，Went通過著名的燕麥芽鞘彎曲實(shí)驗(yàn)而首次建立了檢測(cè)植物生長(zhǎng)素的生物測(cè)試法。除此之外，常用于測(cè)定IAA等植物激素的傳統(tǒng)方法還有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣-質(zhì)聯(lián)用(GC/MS)或液-質(zhì)(LC/ MS)聯(lián)用、酶聯(lián)免疫(ELISA)、放射免疫(RIA)等方法。這些方法各有優(yōu)點(diǎn)，但都存在一定的局限性。其中，生物試法簡(jiǎn)單易行，能反映被測(cè)植物激素的生理活性，但不能排除植物激素類似物和拮抗物的影響，專一性和靈敏度均較低；色譜法靈敏度高、重現(xiàn)性好，但對(duì)待測(cè)樣品需要量大、樣品前處理復(fù)雜且需要昂貴的儀器設(shè)備和較高的使用維護(hù)費(fèi)用；酶聯(lián)免疫法和放射免疫法靈敏度較高，但抗體制備和純化較為困難、測(cè)定周期長(zhǎng)且很難排除植物激素前體物和結(jié)構(gòu)類似物的影響。而且，酶聯(lián)免疫法的重現(xiàn)性受環(huán)境條件影響較大，放射免疫法還存在放射性廢物處理的問題。植物激素與生長(zhǎng)發(fā)育湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室所研制的植物激素免疫傳感測(cè)定方法是繼生物試法、物理化學(xué)方法、酶聯(lián)免疫與放射免疫等方法之后，在植物激素測(cè)定方法領(lǐng)域的重大創(chuàng)新與突破，如所研制的植物激素免疫傳感器可以直接測(cè)定出提取液中不同植物激素含量，且結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、制造簡(jiǎn)便和操作方面。本發(fā)明力圖建立一種IAA的植物活體內(nèi)原位實(shí)時(shí)測(cè)定方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種能克服現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)的不足(測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)、成本高、操作繁瑣等)、對(duì)植物活體中生長(zhǎng)素(吲哚乙酸)進(jìn)行原位實(shí)時(shí)測(cè)定的新方法。為了解決所述技術(shù)問題，這種酶?jìng)鞲袡z測(cè)IAA的方法主要包括以下步驟來實(shí)現(xiàn)(1)分選GFP陰性細(xì)胞；(2)制備具有不同生長(zhǎng)素濃度及其相應(yīng)/ 飯/.·β〒誘導(dǎo)表達(dá)水平的細(xì)胞；(3)建立起GFP蛋白熒光強(qiáng)度和生長(zhǎng)素濃度之間的數(shù)量關(guān)系；(4)基于/ 飯(生長(zhǎng)素響應(yīng)元件)和報(bào)告基因的生長(zhǎng)素的單細(xì)胞級(jí)別的高靈敏、超微量、無創(chuàng)傷原位、實(shí)時(shí)的測(cè)定。本發(fā)明方法步驟(1)中所述分選GFP陰性細(xì)胞采用以下步驟①擬南芥々Ι.·.·βν轉(zhuǎn)基因植株的培養(yǎng)以培養(yǎng)的15-20天擬南芥/ 飯.^ffP轉(zhuǎn)基因植株的根系為實(shí)驗(yàn)材料；②酶解對(duì)擬南芥/ 飯.^ffP轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行纖維素酶和果膠酶的酶解制備原生質(zhì)體；③GFP陰性細(xì)胞的分選利用流式細(xì)胞儀將 GFP陽性細(xì)胞和GFP陰性細(xì)胞進(jìn)行分析，收取GFP陰性細(xì)胞。本發(fā)明方法步驟(2)制備具有不同生長(zhǎng)素濃度及其相應(yīng)/ 飯.^ffP誘導(dǎo)表達(dá)水平的細(xì)胞(圖1)。分別將GFP陰性細(xì)胞孵育在不同生長(zhǎng)素濃度溶液中。待GFP的穩(wěn)定表達(dá)后，分別取不同生長(zhǎng)素濃度孵育過的IxlO4 個(gè)GFP陰性細(xì)胞，用液氮處理后，采用LC-MS/MS法測(cè)定細(xì)胞中生長(zhǎng)素的實(shí)際濃度，制備得到具有不同生長(zhǎng)素濃度的細(xì)胞。本發(fā)明方法步驟(3)建立起GFP蛋白熒光強(qiáng)度和生長(zhǎng)素濃度之間的數(shù)量關(guān)系利用激光共聚焦掃描顯微鏡的對(duì)不同生長(zhǎng)素濃度細(xì)胞分別進(jìn)行GFP 熒光強(qiáng)度的測(cè)定，獲得單個(gè)細(xì)胞的GFP蛋白的平均相對(duì)熒光強(qiáng)度。以建立起單個(gè)細(xì)胞中的生長(zhǎng)素濃度和GFP熒光強(qiáng)度之間的梯度關(guān)系。本發(fā)明方法步驟(4)基于々K生長(zhǎng)素響應(yīng)元件)和報(bào)告基因的生長(zhǎng)素的單細(xì)胞級(jí)別的高靈敏、超微量、無創(chuàng)傷原位、實(shí)時(shí)的測(cè)定。對(duì)擬南芥/ 飯/.·β〒植株進(jìn)行激光共聚焦掃描顯微鏡的掃描，并利用已經(jīng)建立的生長(zhǎng)素濃度與熒光強(qiáng)度之間的數(shù)量關(guān)系，進(jìn)行生長(zhǎng)素的單細(xì)胞級(jí)別的高靈敏、超微量、無創(chuàng)傷原位、實(shí)時(shí)的測(cè)定。本發(fā)明的檢測(cè)原理本發(fā)明檢測(cè)方法是基于/ 飯是受生長(zhǎng)素特異性誘導(dǎo)的啟動(dòng)子融合報(bào)告基因(6)中)，進(jìn)一步建立起GFP熒光強(qiáng)度和生長(zhǎng)素濃度之間的數(shù)量關(guān)系，結(jié)合對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的激光共聚焦顯微鏡觀察得到的各細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度圖像，分析得出細(xì)胞中的IAA的濃度。本生長(zhǎng)素測(cè)定方法的具有簡(jiǎn)便、快速、高靈敏，原位，無損傷的細(xì)胞級(jí)別活體檢測(cè)的特點(diǎn)，有較大的創(chuàng)新性。本發(fā)明效果本方法擬篩選出有不同生長(zhǎng)素濃度的 DR5: :GFP細(xì)胞；通過目前精確的LC-MS/MS方法測(cè)定生長(zhǎng)素濃度，并進(jìn)一步建立起生長(zhǎng)素濃度與報(bào)告基因GFP的表達(dá)量之間的梯度對(duì)應(yīng)關(guān)系。利用分子生物學(xué)、植物激素測(cè)定技術(shù)和高精密激光共聚焦掃描顯微操作平臺(tái)相結(jié)合，建立基于/ 飯(生長(zhǎng)素響應(yīng)元件)和報(bào)告基因的生長(zhǎng)素的單細(xì)胞級(jí)別的高靈敏、超微量、無創(chuàng)傷原位、實(shí)時(shí)的測(cè)定技術(shù)體系和標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)定方法，為植物激素的測(cè)定開辟了新途徑。


圖1是本發(fā)明具有不同IAA濃度及其相應(yīng)/ 飯.·.·秀導(dǎo)表達(dá)水平的細(xì)胞制備過程圖。
權(quán)利要求
1.基于/ 飯的植物活體中生長(zhǎng)素的原位實(shí)時(shí)測(cè)定方法，其特征在于包括以下步驟(1) 分選GFP陰性細(xì)胞以擬南芥々I.^ffP轉(zhuǎn)基因植株根系為材料進(jìn)行酶解制備原生質(zhì)體，利用流式細(xì)胞儀將GFP陽性細(xì)胞和GFP陰性細(xì)胞進(jìn)行分析，收取GFP陰性細(xì)胞；(2)制備具有不同生長(zhǎng)素濃度及其相應(yīng)/ 飯.^ffP誘導(dǎo)表達(dá)水平的細(xì)胞分別將GFP陰性細(xì)胞孵育在不同生長(zhǎng)素濃度溶液，待GFP的穩(wěn)定表達(dá)后，用液氮處理后，采用LC-MS/MS法測(cè)定細(xì)胞中生長(zhǎng)素的實(shí)際濃度，制備得到具有不同生長(zhǎng)素濃度的細(xì)胞；(3)建立起GFP蛋白熒光強(qiáng)度和生長(zhǎng)素濃度之間的數(shù)量關(guān)系利用激光共聚焦掃描顯微鏡的對(duì)不同生長(zhǎng)素濃度及其相應(yīng)誘導(dǎo)表達(dá)水平細(xì)胞分別進(jìn)行GFP熒光強(qiáng)度的測(cè)定，進(jìn)而建立起單個(gè)細(xì)胞中的生長(zhǎng)素濃度和GFP熒光強(qiáng)度之間的梯度關(guān)系；(4)基于々K生長(zhǎng)素響應(yīng)元件)和報(bào)告基因的生長(zhǎng)素的無創(chuàng)傷原位、實(shí)時(shí)的測(cè)定對(duì)擬南芥/ 飯.^ffP植株進(jìn)行激光共聚焦掃描顯微鏡的掃描，并利用已經(jīng)建立的生長(zhǎng)素濃度與熒光強(qiáng)度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行生長(zhǎng)素的單細(xì)胞級(jí)別的高靈敏、超微量、無創(chuàng)傷原位、實(shí)時(shí)測(cè)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)植物樣品中IAA含量的方法，其特征包括(1)中所述實(shí)驗(yàn)材料為在MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天后，轉(zhuǎn)入MS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8-15天擬南芥轉(zhuǎn)基因植株的根系；(1)中所述制備擬南芥/ 飯//ffP原生質(zhì)體取50株擬南芥的根一切成0.5 - Imm長(zhǎng)的小段一浸沒于3 mL酶溶液(1.5% Cellulase Onozuka RS, 1% cellulysin, 0. 1% pectolyase Y-23，10 mMKCl, 10 mMCaCl2,2mM MgCl2, 2mM MES, pH 5.6)中一60 rpmJ8° C振蕩30-50 min - 200目細(xì)胞篩過濾一洗液清洗200 g離心 5min —洗液稀釋沉淀一冰上靜置保存；(1)中所述利用流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter, EPICS ALTRA)將擬南芥/ 飯.·.·β〒轉(zhuǎn)基因植株根尖原生質(zhì)體依照GFP陽性和GFP陰性進(jìn)行分選，選定IOOym噴嘴，488 nm藍(lán)光激發(fā)，鞘液壓力為20 psi，以野生型擬南芥根尖原生質(zhì)體作為陽性對(duì)照同時(shí)基于完整的原生質(zhì)體具有較高的前向角(forwardscatter，F(xiàn)SC) 和側(cè)向角(side scatter, SSC)比值的原則建立分選門，分選得到大量GFP陰性細(xì)胞；(2) 中所述分別取出IxlO5個(gè)GFP陰性細(xì)胞，孵育在不同生長(zhǎng)素濃度溶液中；生長(zhǎng)素濃度擬定為 10_12 g. L—1，10_n g · L—1，10_1CI g · L—1，10_9 g · L—1，10_8 g · L—1，10_7 g · L—1，10_6 g · L—1，10_5 g -Γ1,10_4 g ·Ι^，通過激光共聚焦掃描顯微鏡，待GFP的穩(wěn)定表達(dá)后，分別取不同生長(zhǎng)素濃度孵育過的IxlO4個(gè)GFP陰性細(xì)胞，用液氮處理，采用LC-MS/MS法測(cè)定生長(zhǎng)素的實(shí)際濃度， 制備得到具有不同生長(zhǎng)素濃度及相應(yīng)/ 飯/.·β〒誘導(dǎo)表達(dá)水平的細(xì)胞；(3)中所述用激光共聚焦掃描顯微鏡以488nm波長(zhǎng)激發(fā)光進(jìn)行掃描，擇每個(gè)細(xì)胞為ROI (感興趣區(qū)域)，然后利用激光共聚焦掃描顯微鏡配套軟件FV10-ASW1. 1和Image-Pro Plus 6. 0，進(jìn)行GFP熒光強(qiáng)度的測(cè)定，得到生長(zhǎng)素濃度和GFP熒光強(qiáng)度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)中所述通過激光共聚焦掃描顯微鏡以488nm波長(zhǎng)激發(fā)光對(duì)擬南芥/ 飯.^ffP植株根系進(jìn)行掃描，獲得各個(gè)部位細(xì)胞的相應(yīng)GFP熒光強(qiáng)度，同時(shí)根據(jù)步驟(3)得到生長(zhǎng)素濃度和GFP熒光強(qiáng)度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行生長(zhǎng)素的高靈敏、超微量、無創(chuàng)傷原位、實(shí)時(shí)測(cè)定。
全文摘要
本發(fā)明具體涉及一種基于生長(zhǎng)素響應(yīng)元件DR5的植物活體中生長(zhǎng)素(吲哚乙酸)的原位實(shí)時(shí)測(cè)定方法。(1)分選GFP陰性細(xì)胞；(2)制備具有不同生長(zhǎng)素濃度及其相應(yīng)DR5::GFP誘導(dǎo)表達(dá)水平的細(xì)胞；(3)建立起GFP蛋白熒光強(qiáng)度和生長(zhǎng)素濃度之間的數(shù)量關(guān)系；(4)基于DR5(生長(zhǎng)素響應(yīng)元件)和報(bào)告基因的生長(zhǎng)素的單細(xì)胞級(jí)別的高靈敏、超微量、無創(chuàng)傷原位、實(shí)時(shí)的測(cè)定。本發(fā)明有益的效果是實(shí)現(xiàn)了游離態(tài)生長(zhǎng)素的單細(xì)胞級(jí)別的高靈敏、超微量、無創(chuàng)傷原位、實(shí)時(shí)的測(cè)定。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102268470SQ20111011105
公開日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2011年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月30日
發(fā)明者李合松, 王若仲, 肖浪濤, 黃志剛 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)