專利名稱：泌尿生殖道病原菌分離鑒定用顯色培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測病原菌用顯色培養(yǎng)基，尤其是涉及一種泌尿生殖道病原菌分離鑒定用顯色培養(yǎng)基，該顯色培養(yǎng)基可同步鑒定多種細(xì)菌性、真菌性病原菌。
背景技術(shù)：
泌尿生殖道感染是指病原體直接侵入尿路或生殖道，在尿道或陰道環(huán)境中生長繁殖，并侵犯黏膜或組織而引起損傷。引起泌尿生殖道感染的細(xì)菌性病原菌主要為革蘭氏陰性桿菌，其中以普通大腸埃希氏菌為主，約占50 70%，其它還有克雷伯氏菌、變形桿菌、假單胞菌等，近年來革蘭氏陽性菌引起的泌尿生殖道感染呈上升趨勢，主要為腸球菌和凝固酶陽性金黃色葡萄球菌，同時凝固酶陰性的表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌的感染率也呈上升趨勢。真菌性病原菌如念珠菌引起的霉菌性陰道炎，也稱念珠菌性陰道炎，其發(fā)病率已高于滴蟲性陰道炎，多見于幼女、婦女、糖尿病患者以及絕經(jīng)后曾用較大劑量雌激素治療的患者。引起陰道感染的念珠菌809Γ90%系白色念珠菌，白帶增多的非孕婦女中，約有10%，孕婦中約有30%在陰道中有此菌寄生，當(dāng)陰道糖原增加、酸度升高時，或在機體抵抗力降低的情況下，便可成為致病的原因，長期應(yīng)用廣譜抗生素和腎上腺皮質(zhì)激素，可導(dǎo)致念珠菌感染大為增加?，F(xiàn)有檢測泌尿生殖道病原菌的方法主要有下述幾種Ι.普通培養(yǎng)法尿道細(xì)菌傳統(tǒng)的鑒定方法需要麥康凱和血平板互補培養(yǎng)，初步區(qū)分乳糖陽性細(xì)菌和乳糖陰性細(xì)菌，再根據(jù)需要做進一步的生化反應(yīng)以確定細(xì)菌的種類。在鑒定病原菌到屬、種時，需要多種生化及其他實驗，耗時、費力、程序繁雜。II.分子生物學(xué)方法隨著近年來分子生物學(xué)的發(fā)展， 逐漸出現(xiàn)了一些應(yīng)用PCR檢測大腸桿菌、糞腸球菌、白色念珠菌等泌尿生殖道感染菌的方法，PCR法雖然簡便快速、靈敏度高，但PCR方法需要昂貴的儀器設(shè)備，更重要的是PCR后處理產(chǎn)生污染導(dǎo)致的假陽性問題嚴(yán)重。III.生化方法無論是生化鑒定儀還是用于鑒別細(xì)菌的生化反應(yīng)管、反應(yīng)條、反應(yīng)培養(yǎng)基等，都只能對細(xì)菌的純培養(yǎng)進行鑒定，這就需要首先對標(biāo)本進行分離培養(yǎng)，整個過程耗時費力、特異性差、靈敏度低，不利于病原菌快速準(zhǔn)確的檢出。IV.顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)法顯色培養(yǎng)基由于含有特殊的顯色物質(zhì)，無需通過任何儀器，僅通過肉眼觀察菌落的色彩即可對待測標(biāo)本實現(xiàn)病原菌屬間甚至種間的分析；目前可用于泌尿生殖道病原菌檢測的顯色培養(yǎng)基主要有大腸桿菌顯色培養(yǎng)基、ECC顯色培養(yǎng)基、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基、UTI定位顯色培養(yǎng)基和念珠菌顯色培養(yǎng)基等，通過這些顯色培養(yǎng)基的應(yīng)用可以對引起泌尿生殖道感染的大腸桿菌、克雷伯氏菌、腸球菌、白色念珠菌、熱帶念珠菌等做出初步的分離鑒定，但各有其局限性
①.大腸桿菌顯色培養(yǎng)基能分離鑒定大腸桿菌，但不能同時分離鑒定腸球菌、念珠菌、 克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌、葡萄球菌等；
②.ECC顯色培養(yǎng)基能分離鑒定大腸桿菌、克雷伯氏菌，但不能同時分離鑒定腸球菌、 念珠菌、銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌、葡萄球菌等；③.金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基能分離鑒定金黃色葡萄球菌，但不能同時分離鑒定大腸桿菌、克雷伯氏菌、念珠菌、銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌等；
④.UTI定為顯色培養(yǎng)基能夠?qū)Υ竽c桿菌、肺炎克雷伯氏菌、腸球菌、銅綠假單胞菌、 奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌等做出定位分析，但不能分離鑒定念珠菌等；
⑤.念珠菌顯色培養(yǎng)基能夠分離鑒定白色念珠菌、熱帶念珠菌、克柔氏念珠菌，但不能用于大腸桿菌、克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌、腸球菌。目前臨床上對患者標(biāo)本所作的病原菌培養(yǎng)鑒定以傳統(tǒng)方法為主，采取分離培養(yǎng)、 鏡檢觀察、生化鑒定等多個步驟，檢測周期長，操作繁瑣，已經(jīng)不能滿足臨床對泌尿生殖道病原菌快速、便利檢測的需求，盡管目前市場上存在幾種用于尿道細(xì)菌和念珠菌檢測的顯色培養(yǎng)基，如科瑪嘉定位顯色培養(yǎng)基、梅里埃定位顯色培養(yǎng)基、科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基等，但這些顯色培養(yǎng)基或者僅能用于檢測細(xì)菌性病原菌，或者僅能用于檢測念珠菌，無法滿足對引起生殖道感染的細(xì)菌性病原菌和念珠菌同時分離鑒定，存在漏檢的可能，不利于臨床對病原菌的全面判斷，從而影響疾病的診斷和治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種泌尿生殖道病原菌分離鑒定用顯色培養(yǎng)基，該顯色培養(yǎng)基可同時鑒定大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌、腸球菌、金黃色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、白色念珠菌、熱帶念珠菌和克柔氏念珠菌等多種細(xì)菌性和真菌性病原菌，方便快捷。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案
本發(fā)明所述的泌尿生殖道病原菌分離鑒定用顯色培養(yǎng)基，它至少包括己糖胺酶底物、 β -D-半乳糖苷酶底物和β -D-葡萄糖苷酶底物三種顯色底物。將添加了上述三種顯色底物(根據(jù)各底物的實際質(zhì)量，每種顯色底物按照0. O 3 1 g/L的比例添加即可)的顯色培養(yǎng)基制備成普通的微生物培養(yǎng)基瓊脂平板，將樣本或經(jīng)過分離培養(yǎng)的菌落接種到顯色平板上，經(jīng)孵育直接觀測結(jié)果；也可以將其固定在一定的載體上(如紙片、紙膜、膠片等，材料可以是棉漿紙、木漿紙、竹漿紙、醋酸纖維膜、聚酯纖維膜、 聚乙烯薄膜、聚丙烯薄膜、聚丙烯酸鹽、交聯(lián)纖維素等)，制成快速培養(yǎng)檢測紙片。如果在其中增加色氨酸和鐵鹽；則添加了色氨酸和鐵鹽的顯色培養(yǎng)基可以同時鑒定奇異變形桿菌。所述顯色底物為基于吲哚酚衍生物的底物，也可以是基于硝基苯酚衍生物的底物或基于萘酚衍生物的底物。如果采用產(chǎn)生熒光的顯色底物，如采用基于傘形酮衍生物的底物或基于香豆素衍生物的底物，在揭示熒光的情況下，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的熒光讀取設(shè)備即可判讀出其結(jié)果。所述顯色底物的顯色基團不同。其目的是為了在同一塊平板上區(qū)分多種病原菌， 實現(xiàn)不同病原菌的特異性顯色，用同一種顯色基團則所有病原菌的顯色將呈現(xiàn)同樣的顏色，無法達(dá)到區(qū)分的目的。當(dāng)己糖胺酶顯色底物的顯色基團顯現(xiàn)某種顏色時，β -D-半乳糖苷酶底物的顯色基團顯現(xiàn)與之不同的另一種顏色。如β-D-半乳糖苷酶底物的顯色基團是顯現(xiàn)紅色的 5-溴-6-氯-3-吲哚基團，而己糖胺酶底物的顯色基團則是顯現(xiàn)藍(lán)色的5-溴-4-氯-3-吲哚基團；當(dāng)然也可以是其他顏色的，均可以達(dá)到此目的。β-D-葡萄糖苷酶底物為顯色基團顯現(xiàn)不同顏色的兩種顯色底物。如β-D-葡萄糖苷酶底物就可以用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷和5-溴-6-氯-3-吲哚-β -D-葡萄糖苷兩種顯色底物。當(dāng)然也可以是其他顏色的。本發(fā)明的優(yōu)點在于這種顯色培養(yǎng)基在一塊顯色平板上可以同時培養(yǎng)鑒定包括細(xì)菌和真菌在內(nèi)的多種生殖道病原菌，即可以同時鑒定大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、腸球菌、 銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌、腐生葡萄球菌等細(xì)菌性病原菌以及白色念珠菌、熱帶念珠菌等真菌性病原菌，肉眼觀察即可進行判斷，快捷方便，極易操作。本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基不僅適用于純培養(yǎng)物的培養(yǎng)鑒定，更可以直接用于臨床標(biāo)本的病原菌培養(yǎng)鑒定，縮短了傳統(tǒng)方法中先培養(yǎng)再鑒定的時間，24小時即可判讀結(jié)果(某些判讀不準(zhǔn)的情況可以延續(xù)培養(yǎng)至48h)，更有利于患者的早期診斷和治療。本發(fā)明所述的顯色培養(yǎng)基可以用于多種領(lǐng)域，包括醫(yī)學(xué)微生物標(biāo)本、藥品及醫(yī)療器械微升檢驗樣品、公共衛(wèi)生檢測樣品、 化妝品衛(wèi)生檢驗樣品、食品衛(wèi)生檢驗樣品等樣品中的大腸桿菌、腸球菌、肺炎克雷伯氏菌、 銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、白色念珠菌、熱帶念珠菌和克柔氏念珠菌的分離鑒定揭示β-D-半乳糖苷酶酶活性且半透明的扁平狀菌落為大腸桿菌；揭示β-D-半乳糖苷酶酶活性和β-D-葡萄糖苷酶酶活性同時存在的菌落為肺炎克雷伯氏菌；揭示β-D-葡萄糖苷酶酶活性和己糖胺酶活性同時存在的菌落為腸球菌；揭示己糖胺酶酶活性存在的菌落為白色念珠菌；揭示β -D-半乳糖苷酶酶活性和己糖胺酶活性同時存在的菌落為熱帶念珠菌；揭示色氨酸脫氨酶酶活性存在的菌落為奇異變形桿菌；揭示 β-D-半乳糖苷酶酶活性且不透明的圓形突起狀菌落為腐生葡萄球菌，產(chǎn)生金黃色色素且不透明的圓形突起狀菌落為金黃色葡萄球菌，呈棕褐色的扁平狀菌落為銅綠假單胞菌，呈較大的白色且有微毛的菌落為克柔氏念珠菌。
具體實施例方式實施例1 使用本發(fā)明所述顯色培養(yǎng)基分離鑒定泌尿生殖道病原菌
1. 1顯色培養(yǎng)基平板的制備按表1中的配方稱取各組分，加純化水1000ml，調(diào)整 pH6. 8士0. 1，115° C，高壓滅菌20min，冷卻至50° C左右倒平板備用； 表權(quán)利要求
1.一種泌尿生殖道病原菌分離鑒定用顯色培養(yǎng)基，其特征在于它至少包括己糖胺酶底物、β-D-半乳糖苷酶底物和β-D-葡萄糖苷酶底物三種顯色底物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的泌尿生殖道病原菌分離鑒定用顯色培養(yǎng)基，其特征在于它還包括色氨酸和鐵鹽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的泌尿生殖道病原菌分離鑒定用顯色培養(yǎng)基，其特征在于所述顯色底物為基于吲哚酚衍生物的底物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的泌尿生殖道病原菌分離鑒定用顯色培養(yǎng)基，其特征在于所述顯色底物的顯色基團不同。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的泌尿生殖道病原菌分離鑒定用顯色培養(yǎng)基，其特征在于當(dāng)己糖胺酶顯色底物的顯色基團顯現(xiàn)某種顏色時，β -D-半乳糖苷酶底物的顯色基團顯現(xiàn)與之不同的另一種顏色。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的泌尿生殖道病原菌分離鑒定用顯色培養(yǎng)基，其特征在于 β -D-葡萄糖苷酶底物為顯色基團顯現(xiàn)不同顏色的兩種顯色底物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種泌尿生殖道病原菌分離鑒定用顯色培養(yǎng)基，它至少包括己糖胺酶底物、β-D-半乳糖苷酶底物和β-D-葡萄糖苷酶底物三種顯色底物。將添加了上述三種顯色底物的顯色培養(yǎng)基制備成微生物培養(yǎng)基瓊脂平板，將樣本或經(jīng)過分離培養(yǎng)的菌落接種到顯色平板上，經(jīng)孵育即可直接觀測結(jié)果。本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基在一塊顯色平板上可以同時培養(yǎng)鑒定包括細(xì)菌和真菌在內(nèi)的多種生殖道病原菌，即可以同時鑒定大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、腸球菌、銅綠假單胞菌、奇異變形桿菌、金黃色葡萄球菌等細(xì)菌性病原菌以及白色念珠菌、熱帶念珠菌等真菌性病原菌，肉眼觀察即可進行判斷，快捷方便，極易操作。
文檔編號C12Q1/04GK102206697SQ20111009326
公開日2011年10月5日 申請日期2011年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月14日
發(fā)明者付光宇, 吳學(xué)煒, 孫昊權(quán), 孫若楠, 崔曉曉, 楊紅云, 王則宇, 王利英, 鄭業(yè)煥 申請人:鄭州安圖綠科生物工程有限公司