專利名稱：一種抗呼腸孤病毒口服基因工程疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程疫苗領(lǐng)域，尤其涉及一種用于治療呼腸孤病毒引起的草魚出血病的口服基因工程疫苗，及其制備方法。
背景技術(shù)：
草魚具有生長快、個體大、產(chǎn)量高、飼料要求低特點，是當(dāng)前較理想的節(jié)糧型池塘養(yǎng)殖品種，尤其在魚飼料價格上升，池塘養(yǎng)殖成本增長的形勢下，增加草魚養(yǎng)殖比例，可增加池塘經(jīng)濟(jì)效益，具有現(xiàn)實意義。草魚出血病是嚴(yán)重危害當(dāng)年草魚魚種的一種傳染性疾病。 這是一種流行廣，季節(jié)長，發(fā)病率高，死亡率極高的一種疾病。草魚出血病是影響我國草魚養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)性發(fā)展的最主要病害之一。我國目前沒有治療草魚出血病的有效藥物，對該病主要靠免疫預(yù)防。市場上銷售的疫苗產(chǎn)品主要包括草魚呼腸孤病毒(Reovirus)的組織漿滅活苗和體外細(xì)胞培養(yǎng)的減毒苗。由于這兩種疫苗的生產(chǎn)成本高，只適合用注射的方式免疫草魚，不利于其大規(guī)模推廣應(yīng)用。用基因工程的方法利用微生物發(fā)酵技術(shù)研制的口服化疫苗顯然會更加符合水生動物的特點，也有利于該疫苗的大規(guī)模推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有疫苗生產(chǎn)成本高，只適合用注射方式進(jìn)行免疫的問題，本發(fā)明公開了一種用基因工程的方法，利用微生物發(fā)酵技術(shù)研制的口服化疫苗，及其制備方法。實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案如下提供一種抗呼腸孤病毒口服基因工程疫苗，目標(biāo)疫苗蛋白為呼腸孤病毒外殼蛋白 vp5和外殼蛋白vp7。所述的外殼蛋白vp5基因的擴(kuò)增引物對為上游引物TCCCCCGGGGGATGGGGAACGTTCAAACCTCCGT和下游引物ATAAGAATGCGGCCGCTTATCACTTGCCGGGCCACAA ；外殼蛋白vp7基因的擴(kuò)增引物對為上游引物CGCGGATCCCCACTTCACATGATTCCGCAAGTC和下游引物ACGCGTCGACGTCTTAATCGGATGGCTCCAC。本發(fā)明還提供一種抗呼腸孤病毒口服基因工程疫苗的制備方法，包括以下步驟(1)首先用RT-PCR的方法從呼腸孤病毒株感染的CIK細(xì)胞中，擴(kuò)增出呼腸孤病毒株RNA基因組相應(yīng)的cDNA ；再以所得的cDNA為模板，用PCR的方法擴(kuò)增出外殼蛋白vp5基因和外殼蛋白vp7基因的全序列；其中外殼蛋白vp5基因的擴(kuò)增引物對為 TCCCCCGGGGGATGG GGAACGTTCAAACCTCCGT 和 ATAAGAATGCGGCCGC TTATCACTTGCCGGGCCACAA ； 蛋白 vp7 基因的擴(kuò)增引物對為 CGCGGATCCCCACTTCACATGATTCCGCAAGTC 和 ACGCGTCGACGTCTT AATCGGATGGCTCCAC ；(2)構(gòu)建表達(dá)外殼蛋白vp5和外殼蛋白vp7的原核表達(dá)質(zhì)粒外殼蛋白vp5基因片段用Sma I和Not I雙酶切后分別克隆到原核表達(dá)載體pGEX4T_3的相應(yīng)位點中；外殼蛋白vp7基因片段用BamH I和Sal I雙酶切后分別克隆到原核表達(dá)載體pGEX4T_3的相應(yīng)位點中. (3)將上一步所得的陽性重組質(zhì)粒pGEX_vp5和陽性重組質(zhì)粒pGEX_vp7分別轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株DH5 α中，得陽性表達(dá)菌株；(4)基于外殼蛋白νρ5和外殼蛋白νρ7的口服疫苗的制備將(3)所得的陽性表達(dá)菌株DH5 α滅活后，與魚顆粒飼料混勻，再加入魚肝油拌勻。其中，在步驟⑷中所述的陽性表達(dá)菌株DH5 α滅活方法為將步驟⑶所得的陽性表達(dá)菌株DH5 α 離心富集后首先用0.5%甲醛在20°C滅活，用IX PBS緩沖液洗滌除掉甲醛，最后用IX PBS 緩沖液重懸至使用濃度IO9個/ml ；所述的魚顆粒飼料為0. 005-0. 05g/顆，優(yōu)選為0. 02g/顆；所述的混勻為將魚顆粒飼料與陽性表達(dá)菌株DH5 α菌懸液在冰上混合10_20分鐘，優(yōu)選為15分鐘；陽性表達(dá)菌株DH5ci用量為每克飼料2-10ml，優(yōu)選為5ml ；所述的魚肝油的加入量為能防止入水后滅活的陽性表達(dá)菌株DH5 α向水中擴(kuò)散的量。呼腸孤病毒是魚類出血病的致病因子。呼腸孤病毒的基因組由11條雙鏈RNA構(gòu)成，并被兩層蛋白質(zhì)外殼包裹。最外層蛋白衣殼由νρ5和νρ7形成的二聚體構(gòu)成，這兩個蛋白質(zhì)主要參與病毒對宿主細(xì)胞的識別與吸附。由于病毒外膜蛋白通常也是誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和性抗體的蛋白質(zhì)，所以本發(fā)明將νρ5和νρ7選定為目標(biāo)疫苗蛋白，可以得到好的免疫效果ο本發(fā)明大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)νρ5和νρ7蛋白，可以降低疫苗生產(chǎn)成本。另一方面，本發(fā)明用飼料添加劑的形式研制疫苗的口服劑型，顯然會更加符合水生動物的特點，也有利于該疫苗的大規(guī)模推廣應(yīng)用。


圖1外殼蛋白νρ5基因和外殼蛋白νρ7基因電泳圖；圖2外殼蛋白νρ5和外殼蛋白νρ7誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果；圖3外殼蛋白νρ5和外殼蛋白vp7 Western-Blot免疫學(xué)檢測結(jié)果；圖4對照組和實驗組草魚的存活數(shù)。
具體實施例方式應(yīng)當(dāng)理解，下面實施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒炄藛T常規(guī)采用方法如薩姆布魯克和拉塞爾主編的《分子克隆實驗指南》第三版，或按照制造廠商所建議的步驟和條件。實施例中，所涉及的部分材料來源如下病毒和細(xì)胞株草魚呼腸孤病毒873株和草魚腎細(xì)胞系CIK細(xì)胞均購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心；草魚腎細(xì)胞系CIK細(xì)胞培養(yǎng)基含10%小牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，購于上海皓嘉科技發(fā)展有限公司，細(xì)胞的培養(yǎng)及病毒的感染與擴(kuò)增都在27°C細(xì)胞培養(yǎng)箱(購于日本三洋電器集團(tuán))中進(jìn)行。表達(dá)載體和菌種原核表達(dá)載體pGEX4T-3購自GE Healthcare公司，表達(dá)菌株 DH5 α、羊抗兔抗體及普通營養(yǎng)肉湯購自上海鼎國生物技術(shù)有限公司。DNA提取試劑盒和工具酶質(zhì)粒微量提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，限制性內(nèi)切酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，連接酶和Taq多聚酶均購自TAKARA公司。蛋白分子量標(biāo)記物、隨機(jī)引物、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶、Sma I和Not I雙酶、BamH I和Sal I雙酶、LB培養(yǎng)基平板、商品化魚顆粒飼料、固體化學(xué)試劑均購自上海朝瑞生物工程有限公司；Trizol試劑、氯仿、異丙醇、普通營養(yǎng)肉湯、IPTG、甲醛、IX PBS緩沖液、魚肝油、液態(tài)化學(xué)試劑均購自上海國藥集團(tuán)生化試劑有限公司。兔抗外殼蛋白vp5和外殼蛋白vp7血清由艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司制
草魚，平均體重100g，購自上海銅川路水產(chǎn)品批發(fā)市場。實施例一一、制備方法1、從草魚呼腸孤病毒873株基因組中擴(kuò)增外殼蛋白vp5基因和外殼蛋白vp7基因.首先用RT-PCR的方法從草魚呼腸孤病毒873株感染的草魚腎細(xì)胞系CIK細(xì)胞中擴(kuò)增出草魚呼腸孤病毒873株RNA基因組相應(yīng)的cDNA，具體步驟為用草魚呼腸孤病毒873株感染一瓶草魚腎細(xì)胞系CIK細(xì)胞，72小時后收獲草魚腎細(xì)胞系CIK細(xì)胞，并用Trizol試劑和氯仿抽提草魚腎細(xì)胞系CIK細(xì)胞中的總RNA，用異丙醇沉淀后所有的RNA溶入30 μ 1 超純水中。約Iyg RNA用于后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)總體積為20 μ 1，反應(yīng)體系含Iyg RNA，ly 1隨機(jī)引物(Takara)，2y 1 IOX逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，1 μ 1 IOmM dNTP，1 μ 1逆轉(zhuǎn)錄酶。在42°C反應(yīng)1小時后，反應(yīng)管置于70°C滅活10分鐘。以上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用 PCR的方法可以擴(kuò)增出外殼蛋白vp5基因和外殼蛋白vp7基因的全序列。其中外殼蛋白 vp5 基因的擴(kuò)增引物對為TCCCCCGGGGGATGG GGAACGTTCAAACCTCCGT 和 ATAAGAATGCGGCCGC TTATCACTTGCCGGGCCACAA ；蛋白 vp7 基因的擴(kuò)增引物對為 CGCGGATCCCCACTTCACATGATTCCGCA AGTC 和 ACGCGTCGACGTCTTAATCGGATGGCTCCAC。2、構(gòu)建表達(dá)外殼蛋白vp5和外殼蛋白vp7的原核表達(dá)質(zhì)粒。外殼蛋白vp5基因片段用Sma I和Not I雙酶切后分別克隆到原核表達(dá)載體pGEX4T_3的相應(yīng)位點中；外殼蛋白 vp7基因片段用BamH I和Sal I雙酶切后分別克隆到原核表達(dá)載體pGEX4T_3的相應(yīng)位點中。所得到的陽性重組質(zhì)粒pGEX-vp5和pGEX-vp7分別送到上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序確認(rèn)。3、外殼蛋白vp5和外殼蛋白vp7在表達(dá)菌株DH5 α中的誘導(dǎo)表達(dá)。將陽性重組質(zhì)粒pGEX-vp5和陽性重組質(zhì)粒pGEX-vp7分別轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株DH5 α中，于LB培養(yǎng)基平板中過夜培養(yǎng)后再挑取陽性表達(dá)菌株DH5 α單菌落至普通營養(yǎng)肉湯中進(jìn)行液體培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入ImM的IPTG在37°C進(jìn)行4小時的誘導(dǎo)培養(yǎng)，然后收集陽性表達(dá)菌株DH5 α菌體采用Western-Blot免疫學(xué)檢測方法對外殼蛋白vp5和外殼蛋白vp7進(jìn)行表達(dá)鑒定。4、基于外殼蛋白vp5和外殼蛋白vp7的口服疫苗的制備方法。表達(dá)外殼蛋白vp5 和外殼蛋白vp7的陽性表達(dá)菌株DH5 α離心富集后首先用0. 5%甲醛在20°C滅活15分鐘，用IX PBS緩沖液洗滌兩次除掉甲醛，最后用IX PBS緩沖液重懸至使用濃度IO9個/ml，并置于4°C保存。將商品化魚顆粒飼料(0.02g/顆)與陽性表達(dá)菌株DH5ci菌懸液在冰上混合15分鐘，陽性表達(dá)菌株DH5 α用量為每克飼料5ml。待商品化魚顆粒飼料完全吸附陽性表達(dá)菌株DH5ci菌懸液后，向商品化魚飼料中加入少許魚肝油拌勻，防止入水后滅活的陽性表達(dá)菌株DH5ci向水中擴(kuò)散。5、口服疫苗對草魚的免疫保護(hù)作用。取用商品化魚顆粒飼料飼喂的60尾草魚進(jìn)行草魚呼腸孤病毒873株的攻毒實驗。實驗前實驗組30尾草魚用口服疫苗連續(xù)飼喂7天， 對照組30尾草魚用商品化魚顆粒飼料連續(xù)飼喂7天，然后對照組和實驗組每尾草魚注射 IO6PFU草魚呼腸孤病毒873株懸液后放到一個隔離的養(yǎng)殖系統(tǒng)的水族箱中。水溫通過加熱棒保持在27士 1°C，然后每天繼續(xù)用商品化魚顆粒飼料進(jìn)行表觀飽食投喂，每天2次，持續(xù) 20天。每2天記錄實驗組和對照組草魚的存活數(shù)。二、結(jié)果1、圖1表明，從草魚呼腸孤病毒873株基因組中分別用RT-PCR的方法擴(kuò)增出了外殼蛋白vp5基因(條帶1)和外殼蛋白vp7基因(條帶2)，M為基因標(biāo)記物。2.圖2中，M為蛋白分子量標(biāo)記物，1為未加入IPTG培養(yǎng)的陽性重組質(zhì)粒pGEX_vp5 表達(dá)菌株DH5 α菌體，2為加入IPTG培養(yǎng)的陽性重組質(zhì)粒pGEX_vp5表達(dá)菌株DH5 α菌體， 3為未加入IPTG培養(yǎng)的陽性重組質(zhì)粒pGEX-vp7表達(dá)菌株DH5 α菌體，4為加入IPTG培養(yǎng)的陽性重組質(zhì)粒pGEX-vp7表達(dá)菌株DH5 α菌體；表明外殼蛋白νρ5和外殼蛋白νρ7在表達(dá)菌株DH5a中成功誘導(dǎo)表達(dá)。3.圖3中，M為蛋白分子量標(biāo)記物，1為未加入IPTG培養(yǎng)的陽性重組質(zhì)粒pGEX_vp5 表達(dá)菌株DH5a菌體，2為加入IPTG培養(yǎng)的陽性重組質(zhì)粒pGEX_vp5表達(dá)菌株DH5a菌體，3 為未加入IPTG培養(yǎng)的陽性重組質(zhì)粒pGEX-vp7表達(dá)菌株DH5 α菌體，4為加入IPTG培養(yǎng)的陽性重組質(zhì)粒pGEX-vp7表達(dá)菌株DH5 α菌體；表明，用實驗室制備的兔抗外殼蛋白vp5和外殼蛋白vp7血清作為第一抗體，第二抗體是HRP-標(biāo)記的羊抗兔抗體，通過Western-Blot 免疫學(xué)檢測進(jìn)一步說明外殼蛋白vp5和外殼蛋白vp7在表達(dá)菌株DH5a中成功誘導(dǎo)表達(dá)。4. 口服疫苗對草魚的保護(hù)作用圖4表明，實驗組草魚存活率達(dá)85%，而對照組草魚存活率只有10%，說明口服疫苗對草魚有良好的保護(hù)作用。本發(fā)明以草魚呼腸孤病毒873株作為疫苗制備原料說明疫苗制備方法，并不表示本發(fā)明局限于僅以此病毒作為疫苗制備的原料；同理，本發(fā)明以草魚作為疫苗作用對象，并不表示對其他魚類作用的局限性。
權(quán)利要求
1.一種抗呼腸孤病毒口服基因工程疫苗，其特征在于，目標(biāo)疫苗蛋白為呼腸孤病毒外殼蛋白vp5和外殼蛋白vp7。
2.如權(quán)利要求1所述的口服基因工程疫苗，其特征在于，所述的外殼蛋白vp5基因的擴(kuò)增引物對為上游引物TCCCCCGGGGGATGG GGAACGTTCAAACCTCCGT和下游引物ATAAGAATGCGGCCGC TTATCACTTGCCGGGCCACAA ；外殼蛋白vp7基因的擴(kuò)增引物對為上游引物CGCGGATCCCCACTTCACATGATTCCGCAAGTC和下游引物ACGCGTCGACGTCTTAATCGGATGGCTCCAC。
3.一種抗呼腸孤病毒口服基因工程疫苗的制備方法，包括以下步驟(1)首先用RT-PCR的方法從呼腸孤病毒株感染的CIK細(xì)胞中，擴(kuò)增出呼腸孤病毒株 RNA基因組相應(yīng)的cDNA ；再以所得的cDNA為模板，用PCR的方法擴(kuò)增出外殼蛋白vp5基因和外殼蛋白vp7基因的全序列；其中外殼蛋白vp5基因的擴(kuò)增引物對為TCCCCCGGGGGATGG GGAACGTTCAAACCTCCGT 和 ATMGMTGCGGCCGC TTATCACTTGCCGGGCCACAA ；蛋白 vp7 基因的擴(kuò)增弓 | 物對為 CGCGGATCCCCACTTCACATGATTCCGCMGTC 和 ACGCGTCGACGTCTTMTCGGATGGCTCCAC ；(2)構(gòu)建表達(dá)外殼蛋白vp5和外殼蛋白vp7的原核表達(dá)質(zhì)粒外殼蛋白vp5基因片段用 Sma I和Not I雙酶切后分別克隆到原核表達(dá)載體pGEX4T_3的相應(yīng)位點中；外殼蛋白vp7 基因片段用BamH I和Sal I雙酶切后分別克隆到原核表達(dá)載體pGEX4T_3的相應(yīng)位點中；(3)將上一步所得的陽性重組質(zhì)粒pGEX-vp5和陽性重組質(zhì)粒pGEX-vp7分別轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株DH5 α中，得陽性表達(dá)菌株；(4)基于外殼蛋白νρ5和外殼蛋白νρ7的口服疫苗的制備將(3)所得的陽性表達(dá)菌株DH5 α滅活后，與魚顆粒飼料混勻，再加入魚肝油拌勻。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，其中所述的陽性表達(dá)菌株DH5 α滅活方法為將步驟(3)所得的陽性表達(dá)菌株DH5 α離心富集后首先用0.5%甲醛在20°C滅活，用IX PBS緩沖液洗滌除掉甲醛，最后用IX PBS緩沖液重懸至使用濃度IO9個/ml;所述的魚顆粒飼料為0. 005-0. 05g/顆；所述的混勻為將魚顆粒飼料與陽性表達(dá)菌株DH5 α菌懸液在冰上混合10-20分鐘，陽性表達(dá)菌株DH5a用量為每克飼料2-10ml ；所述的魚肝油的加入量為能防止入水后滅活的陽性表達(dá)菌株DH5 α向水中擴(kuò)散的量。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的魚顆粒飼料為0.02g/顆。
6.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的混勻的混合時間為15分鐘，陽性表達(dá)菌株DH5a用量為每克飼料5ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗呼腸孤病毒口服基因工程疫苗及其制備方法，屬于基因工程疫苗領(lǐng)域。目前的疫苗產(chǎn)品主要包括草魚呼腸孤病毒的組織漿滅活苗和體外細(xì)胞培養(yǎng)的減毒苗，生產(chǎn)成本高，只適合用注射的方式免疫。本發(fā)明以呼腸孤病毒外膜蛋白vp5和vp7為目標(biāo)疫苗蛋白，公開了飼料添加劑形式的口服劑型疫苗及其制備方法?？捎糜诤裟c孤病毒引起的草魚出血病的防治。
文檔編號C12N15/70GK102218136SQ20111009157
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月12日
發(fā)明者呂利群, 和永杏, 曹海鵬 申請人:上海海洋大學(xué)