專利名稱：一種具有自組裝鉀通道功能的多肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程藥物開發(fā)領(lǐng)域，具體涉及一種具有自組裝鉀通道功能的多肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生命活動過程中，由于自身代謝和應(yīng)對各種生理刺激，細(xì)胞內(nèi)離子濃度經(jīng)常發(fā)生變化，而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)離子濃度的主要途徑是細(xì)胞膜上的離子通道。離子通道在許多生理反應(yīng)中具有重要作用，例如神經(jīng)系統(tǒng)的電信號產(chǎn)生和傳遞、肌肉收縮、腺體分泌、細(xì)胞質(zhì)酸堿度調(diào)節(jié)、心血管系統(tǒng)功能、免疫反應(yīng)等等。離子通道一般是由幾個相同或不同的亞基組成的膜蛋白，每個亞基又含有幾個疏水跨膜段，不同亞基的跨膜段圍繞形成離子通道孔區(qū)，孔的中央有一個離子選擇性濾器，決定了該離子通道主要通透何種離子。細(xì)胞膜內(nèi)外親水區(qū)段有一些配體結(jié)合位點(diǎn)，可以調(diào)節(jié)離子通道的活性。天然離子通道有兩個重要的特性離子選擇性和門控機(jī)制。離子選擇性是指一種離子通道只對一種或幾種離子選擇性透過其孔區(qū)， 門控是指離子通道開放和關(guān)閉機(jī)制。離子通道根據(jù)其通透離子的種類分為陽離子通道和陰離子通道，其中陽離子通道又根據(jù)其通透離子的不同分為鉀通道、鈉通道、鈣通道和非選擇性陽離子通道等種類。各種組織的細(xì)胞膜上離子通道功能出現(xiàn)障礙和/或蛋白表達(dá)異常都會導(dǎo)致疾病，目前已確定許多重要的疾病是由于離子通道功能異常所致，嚴(yán)重威脅人類的健康，所以發(fā)展和發(fā)現(xiàn)新型調(diào)節(jié)和/或代替離子通道功能的藥物越來越重要。在所有離子通道中，鉀通道是細(xì)胞表達(dá)最豐富的一種，而且具有重要的生理功能。 鉀通道參與維持細(xì)胞膜電位、心肌細(xì)胞動作電位復(fù)極化、平滑肌細(xì)胞舒張、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、 免疫反應(yīng)和胰島素分泌。因此鉀通道功能出現(xiàn)障礙和/或蛋白表達(dá)異常會導(dǎo)致許多種疾病。例如Anderson - Tawil綜合癥、糖尿病、癲癇、共濟(jì)失調(diào)、勃起障礙、長QT綜合癥和周期性麻痹等疾病。所以，鉀通道一直以來是藥物篩選和開發(fā)領(lǐng)域的重要靶點(diǎn)。目前已有多種調(diào)節(jié)鉀通道的藥物用于臨床治療疾病。例如治療心臟病的煙酰胺和抗心絞痛的尼可地爾等。因而，開發(fā)調(diào)節(jié)鉀通道的藥物具有重要的臨床價值。合成離子通道研究已有20多年的歷史，合成的離子通道可以模仿天然離子通道的某些功能，通過對合成離子通道的研究也可以了解天然離子通道的某些特征和性質(zhì)。所以，設(shè)計和合成新型的合成離子通道可以發(fā)現(xiàn)新的具有治療離子通道疾病的藥物候選化合物。通過合成的離子通道可以調(diào)節(jié)某種離子在細(xì)胞內(nèi)的濃度，補(bǔ)償由于天然離子通道功能障礙、缺失和/或蛋白表達(dá)異常所導(dǎo)致的疾病?，F(xiàn)階段臨床上治療鉀通道障礙相關(guān)疾病的方法主要是一些使用鉀通道開放劑，促進(jìn)有功能的鉀通道開放增強(qiáng)，未見有使用合成鉀通道補(bǔ)償、代替或增強(qiáng)鉀通道功能的治療藥物。目前國際上許多合成的離子通道對離子的選擇性不高，限制了其在臨床治療中的潛在應(yīng)用價值，而國內(nèi)尚未見相關(guān)發(fā)明專利發(fā)布。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要是針對目前生物工程藥物開發(fā)領(lǐng)域缺乏合成離子通道藥物，采用天然氨基酸序列開發(fā)合成離子通道藥物，提供了一種具有在細(xì)胞膜上自組裝成鉀離子通道的多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明由M個氨基酸組成的多肽，分子量為2762. 36。主要序列來自于天然離子通道蛋白瞬時受體電位通道家族TRPV4的第四個跨膜段。本發(fā)明的一種具有自組裝鉀通道功能的多肽，組成氨基酸序列<1>和編碼多肽的核苷酸序列<2>如下
<1>亮氨酸-酪氨酸-亮氨酸-丙氨酸-纈氨酸-甲硫氨酸-纈氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-亮氨酸-纈氨酸-亮氨酸-甘氨酸-色氨酸-甲硫氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-亮氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-蘇氨酸-精氨酸-甘氨酸-亮氨酸，(所述多肽的氨基酸序列為 Leu-Tyr-Leu-Ala-Val-Met-Val-Phe-Ala-Leu-Val-Leu-Gly-Trp-Met-Asn-Ala-Leu-Tyr-P he-Thr-Arg-Gly-Leu)；
<2>CTG TAC CTG GCT GTG ATG GTC TTT GCC CTG GTC CTG GGC TGG ATG AAT GCG CTG TAC TTC ACG CGC GGG TTG0本發(fā)明的自組裝鉀通道的多肽片段，其氨基酸主序列具有與該多肽氨基酸主序列 ^ 70%的相同性，^ 90%的相似性，片段為把所述的M個氨基酸的序列從任意位置截取成 3個或3個以上氨基酸組成的與所述多肽具有同樣生物活性的多肽。本發(fā)明的自組裝鉀通道的多肽類似物具有與所述多肽相同的生物活性，所述類似物是指在用所述多肽和另一種化合物融合或者用所述多肽的氨基酸序列融合另外的多肽或者蛋白質(zhì)而形成具有生物活性的多肽序列或蛋白質(zhì)。本發(fā)明的自組裝鉀通道的多肽衍生物，其氨基酸序列具有與該多肽氨基酸主序列 ^ 70%的相同性，^ 90%的相似性，該衍生物是指把所述氨基酸的序列中的氨基酸的一個或者幾個氨基酸的某個基團(tuán)用另外的基團(tuán)取代后與所述多肽具有同樣生物活性的多肽。本發(fā)明的自組裝鉀通道的多肽變體，其氨基酸序列具有與該多肽氨基酸主序列 ^ 70%的相同性，^ 90%的相似性，該變體是指一種具有一個或幾個氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列或編碼它的核苷酸序列，所述改變包括在氨基酸序列或核苷酸序列中，在序列中間的任一位置缺失、插入或替換氨基酸或核苷酸，或在序列兩端添加氨基酸或核苷酸。所述多肽具有在脂質(zhì)雙層膜和細(xì)胞膜上自組裝成選擇性通透鉀離子的鉀通道；在細(xì)胞膜上，其通透鉀離子可以顯著引起細(xì)胞膜電位超極化。本發(fā)明多肽、核苷酸、多肽片段、多肽類似物、多肽衍生物和多肽變體用于制備具有治療鉀通道功能障礙/缺失引起的疾病、高血壓藥物的應(yīng)用，也可用于制備具有改變脂質(zhì)體、細(xì)胞膜電位的研究領(lǐng)域工具藥的應(yīng)用。本發(fā)明的多肽來自于運(yùn)用生物信息學(xué)的方法把國際蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的蛋白進(jìn)行序列比對，篩選出來的一種新型的具有活性功能的生物活性肽，本發(fā)明有益技術(shù)效果體現(xiàn)在以下方面(1)本發(fā)明多肽的分子量小，可容易透過組織屏障；( 可通過固相合成技術(shù)大量制備，而且純度高，成本低；C3)本發(fā)明多肽代表了一種新的治療離子通道疾病的新方式；(4)本發(fā)明多肽主要序列來自于天然物質(zhì)，是對自然生物資源的充分利用。


圖1 :100 nM本發(fā)明多肽在內(nèi)外對稱200 mM KCl的人工合成的脂質(zhì)體上形成的單通道電流(分別在 80， 100和 120 mV電壓下記錄)，C 關(guān)閉(Close); 0 開放(Open)。圖2 :100 nM本發(fā)明多肽在內(nèi)外對稱200 mM NMDG-Cl的人工合成的脂質(zhì)體上無單通道電流(分別在 80， 100和 120 mV電壓下記錄)，C 關(guān)閉(Close); 0 開放(Open)。圖3:本發(fā)明多肽可以使脂質(zhì)體通透K+。5 UM本發(fā)明多肽顯著性的增強(qiáng)脂質(zhì)體內(nèi)K+特異性熒光指示劑PBFI熒光強(qiáng)度；而本發(fā)明多肽溶劑對照DMSO只是輕微增強(qiáng)熒光背景強(qiáng)度(脂質(zhì)體內(nèi)含100 mM NMDG-Cl和400 uM PBFI，脂質(zhì)體外是100 mM KCl，其中NMDG+ 是一個大的有機(jī)陽離子，不能通過離子通道孔，K+和PBFI結(jié)合后熒光強(qiáng)度增加)。圖4 本發(fā)明多肽可以使脂質(zhì)體通透K+并升高脂質(zhì)體細(xì)胞膜電位；而本發(fā)明多肽溶劑對照DMSO只是輕微增強(qiáng)熒光背景強(qiáng)度(脂質(zhì)體內(nèi)含100 mM KC1，外液是100 mM NaCl 和60 nM safranin 0，safranin 0是膜電位感受熒光染料，信號升高說明膜電位超極化)。圖5 本發(fā)明多肽濃度依賴地降低60 mM KCl引起的原代平滑肌細(xì)胞膜去極化(細(xì)胞膜電位用膜電位敏感性熒光指示劑DiBAC4(3)檢測，DiBAC4(3)熒光信號升高代表去極化，降低代表復(fù)極化或超極化)。圖6 100 nM本發(fā)明多肽降低了 60 mM KCl引起的原代平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高 (細(xì)胞內(nèi)鈣用鈣熒光指示劑Fluo-4檢測，其可以測定細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的變化率)。圖7 本發(fā)明多肽濃度依賴地降低10 UM苯腎上腺素引起的血管收縮。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明多肽的制備方法采用化學(xué)合成的方法，即本領(lǐng)域熟知的已經(jīng)非常成熟的固相肽合成方法，其氨基保護(hù)策略主要有9-芴甲氧羰基(Fmoc)法和叔丁氧羰基(Boc)法兩種，目前國內(nèi)外主要采用Fmoc固相合成法。固相合成法可用市售保護(hù)氨基酸為原料，快速高效獲得較大量樣品。在9-芴甲氧羰基(Fmoc )合成系統(tǒng)中，優(yōu)選王(Wang)樹脂，加入15ml/ g的二甲基甲酰胺(DMF) 30分鐘，再加入總量為20%的六氫吡啶室溫處理20分鐘，以脫去 Fmoc保護(hù)基團(tuán)，然后再加入過量相應(yīng)的保護(hù)氨基酸和活化劑苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)，反應(yīng)30分鐘縮合，按照給定的氨基酸序列(Leu-Tyr-Leu-Ala-V al-Met-Val-Phe-Ala-Leu-Val-Leu-Gly-Trp-Met-Asn-Ala-Leu-Tyr-Phe-Thr-Arg-Gly-Le u)由C端逐個向N端延伸，以此類推，直到縮合到最后一個亮氨酸，合成完成后，用含4%對甲基苯酚的三氟乙酸(TFA)將多肽從樹脂上切割下來并除去保護(hù)基，采用過濾去除樹脂后乙醚沉淀分離得到粗品多肽；
合成后的粗品多肽采用反相高壓液相(HPLC)層析含1%。三氟乙酸的超純水充分平衡 C18反相柱(長300 mm，直徑5 mm)，用含1%。三氟乙酸的乙晴緩沖液梯度洗脫上述洗脫液， 收集活性峰，得到高純度(>95 %)的肽凍干粉，-20° C儲存。核苷酸采用人工合成方法制備；編碼多肽的核苷酸包含下組中的一種
(a)編碼具有所述氨基酸序列的多肽或其片段、類似物、衍生物或其變體的核苷
酸；
(b)與(a)所述核苷酸互補(bǔ)的核苷酸；
(c)與(a)或(b)中所述核苷酸有> 75%相同性的核苷酸；
該核苷酸基本有編碼具有<1>氨基酸序列多肽的核苷酸組成，本發(fā)明的核苷酸序列包括<2>中的核苷酸序列，其形式為DNA形式，包括cNDA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的也可以是雙鏈的。編碼多肽的編碼區(qū)序列可以和<2>中的核苷酸相同，也可以不同，稱為變異體，其中變異體是指具有編碼<1>中的氨基酸序列的編碼，但可以和<2>中的核苷酸不同。變異體可以是一個或幾個核苷酸取代、插入、缺失的核苷酸序列，但不會改變編碼<1> 中氨基酸序列的多肽的活性功能。該多肽或核苷酸的“變體”是指一種具有一個或幾個氨基酸或核苷酸改變的氨基酸序列或編碼它的核苷酸序列。改變可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入、添加或替換，變體可具有“保守性”改變，其中替換的氨基酸具有與原氨基酸相類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，也可以有“非保守性”改變，其中替換的氨基酸不具有與原氨基酸相類似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)?！叭笔А笔侵冈诎被嵝蛄谢蚝塑账嵝蛄兄幸粋€或幾個氨基酸或核苷酸缺失；“插入”是指在氨基酸序列或核苷酸序列的中間任意位置插入一個或幾個氨基酸；“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列的N端或C端添加一個或幾個氨基酸；“替換” 是指用不同的氨基酸或核苷酸替換一個或幾個氨基酸或核苷酸。該多肽、核苷酸、多肽片段、多肽類似物、多肽衍生物和多肽變體用于制備具有治療包括但不限于下述疾病的藥物的用途
1. Anderson - Tawil綜合癥、糖尿病、癲癇、共濟(jì)失調(diào)、勃起障礙、長QT綜合癥和周期性麻痹等疾病。2. 高血壓疾病原發(fā)性高血壓和繼發(fā)性高血壓。下面結(jié)合附圖，通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。這些實(shí)施舉例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列所有列舉實(shí)施例所涉及的合成多肽具有本發(fā)明涉及的藥物功能而不限于所列舉功能。實(shí)施例1
一種具有自組裝鉀通道功能的多肽是一個含有M個氨基酸的多肽所述多肽全序列一級結(jié)構(gòu)為亮氨酸-酪氨酸-亮氨酸-丙氨酸-纈氨酸-甲硫氨酸-纈氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-亮氨酸-纈氨酸-亮氨酸-甘氨酸-色氨酸-甲硫氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-亮氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-蘇氨酸-精氨酸-甘氨酸-亮氨酸(所述多肽的氨基酸序列為Leu-Tyr-Leu-Ala-Val-Met-Val-Phe-Ala-Leu-Val-Leu-Gly-Trp-Met-Asn-Ala-Le u-Tyr-Phe-Thr-Arg-Gly-Leu)ο本發(fā)明多肽(Leu-Tyr-Leu-Ala-Val-Met-Val-Phe-Ala-Leu-Val-Leu-Gly-Trp-Me t-Asn-Ala-Leu-Tyr-Phe-Thr-Arg-Gly-Leu)的固相合成
采用市售的Quartet多肽合成儀(PTI公司)合成序列為LYLAVMVFALVLGWMNALYFTRGL 的本發(fā)明多肽，具體步驟如下
1、根據(jù)軟件測算加入適量的相應(yīng)保護(hù)氨基酸溶液、縮合試劑、切割試劑
2、在反應(yīng)器中力口入Wang 樹月旨Fmoc-Leu-Wang-Resin 100 umol;
3、在搜集切割液的管道上放入15ml的離心管；
4、設(shè)定相關(guān)參數(shù)并開機(jī)按照程序合成；
5、最后將切割液用乙醚沉淀，離心，干燥，過反向HPLC純化。制得11 mg本發(fā)明多肽，為白色粉末，純度> 95%，20 °C保存留用。實(shí)施例2
本發(fā)明多肽(Leu-Tyr-Leu-Ala-Val-Met-Val-Phe-Ala-Leu-Val-Leu-Gly-Trp-Met-Asn-Ala-Leu-Tyr-Phe-Thr-Arg-Gly-Leu)在脂質(zhì)雙層膜上形成K+離子單通道電流 1.材料和方法
1. 1 材料KC1、NMDG-Cl夠自Sigma公司，POPC磷脂、磷脂酰絲氨酸 (phosphatidylserine, PS)購自 Avanti 公司(Avanti Polar Lipids，美國)，倒置顯微鏡(1X70，Olympus,日本)，微電極拉制儀(P_97，美國Sutter公司)，三維微電極操縱器 (MP-285，Sutter，美國)，膜片鉗放大器(EPC-9，HEKA，德國)，PULSE+PULSEFIT記錄和分析軟件(HEKA，德國)。1. 2脂質(zhì)雙層的合成稱取80 mg POPC和20 mg磷脂酰絲氨酸溶于2 ml雙蒸水， 在氮?dú)庀?，用渦旋混合器混懸20分鐘，然后用超聲波乳化10分鐘，將該脂質(zhì)懸液在高速離心機(jī)下160000 g離心1小時，棄去上清并用200 ul 10 mM的MOPS緩沖液(含有5 %乙二醇，PH 7. 2)懸浮沉淀，然后用加樣槍將該脂質(zhì)混懸液以15 ul/滴分別滴在蓋玻片上，置于干燥器中4 °C干燥6小時。使用時，將相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)液加在干燥后的脂質(zhì)膜上，4 °C保持濕潤10小時以上，即可用于膜片鉗離子通道電流記錄。1. 3膜片鉗單通道記錄將脂質(zhì)體放在3. 5 mm的培養(yǎng)皿上靜止15分鐘，然后加入細(xì)胞外液。電極內(nèi)灌以電極液，置于推進(jìn)器上，電極尖端浸入浴液前，電極內(nèi)給予弱正壓 (1-2 cm水柱)以保持尖端通暢、干凈，同時由刺激器經(jīng)膜片鉗放大器向微電極尖端發(fā)放一電壓為1 mV、波寬為20 mS的方波脈沖信號，用于檢查電極尖端阻抗及觀察封接形成過程。記錄用玻璃微電極的制作，是用硬質(zhì)厚壁玻璃毛坯在水平微電極拉制儀上分四步拉制而成，電極尖端直徑約為1 um，內(nèi)灌電極液后，電阻為6-10 M0內(nèi)插泛極化氯化銀。通過倒置顯微鏡監(jiān)視和三維微電極操縱器驅(qū)動微電極接近細(xì)胞。當(dāng)微電極尖端剛剛碰到細(xì)胞時，稍加10-20 cm水柱的負(fù)壓，高阻封接即刻形成。實(shí)驗(yàn)中僅選用封接電阻大于5 G的細(xì)胞。當(dāng)高阻封接形成后，即可通過改變電極內(nèi)電位而控制電極下的一小片細(xì)胞膜的跨膜電位，以觀察此小片膜上的離子通道電流隨電壓改變的變化，此為細(xì)胞貼附式膜片。 實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行(20-22 °C )
實(shí)驗(yàn)中采用細(xì)胞貼附式記錄方式及用藥前后自身對照的設(shè)計方法，觀察并記錄加入本發(fā)明多肽前后特征性離子通道單通道電流。單通道電流采用PULSE+PULSEFIT軟件進(jìn)行采樣、貯存，實(shí)驗(yàn)中單通道電流信號經(jīng)膜片鉗放大器及A/D、D/A轉(zhuǎn)換器，輸入計算機(jī)；采用低通濾波，頻率為3 KHz02.結(jié)果
當(dāng)脂質(zhì)體內(nèi)外液是對稱的200 mM的KC1，并有100 nM的本發(fā)明多肽加入到外液中時， 可分別在 80、 100、 120 mV記錄到典型的單通道電流(圖1)，而且隨著電壓的增大本發(fā)明多肽形成的通道開放越強(qiáng)(圖1);而當(dāng)K+用大的有機(jī)陽離子NMDG+代替后，S卩脂質(zhì)體內(nèi)外是200 mM NMDG-C1，100 nM本發(fā)明多肽加入到外液中時，在 80、 100、 120 mV記錄不到單通道電流(圖2)。實(shí)施例3
本發(fā)明多肽(Leu-Tyr-Leu-Ala-Val-Met-Val-Phe-Ala-Leu-Val-Leu-Gly-Trp-Met-As n-Ala-Leu-Tyr-Phe-Thr-Arg-Gly-Leu)在脂質(zhì)體膜上介導(dǎo)K+的通透并能改變膜電位 1.材料和方法
1. 1材料P0PC磷脂、磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine, PS)購自Avanti公司(Avanti Polar Lipids，美國)，K+離子敏感的熒光指示劑PBFI購自hvitrogen公司(美國)，膜電位熒光指示劑safranin 0購自Sigma公司(美國)。1.2脂質(zhì)雙層的合成稱取80 mg POPC和20 mg磷脂酰絲氨酸溶于氯仿和甲醇 1 1的混合液中，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干并得到一層脂質(zhì)膜，然后用真空泵繼續(xù)干燥3小時，將 1.3 ml 細(xì)胞內(nèi)液(K+濃度測定400 uM PBFI, 10 mM HEPES, 100 mM NMDG-Cl, pH 7. 0 ；膜電位測定100 mM KCl, 10 mM HEPES, pH 7. 0)加入脂質(zhì)膜中室溫重新水化2小時， 在水化過程中將該脂質(zhì)懸液用液氮和室溫的水反復(fù)凍融5個循環(huán)，然后將該脂質(zhì)懸液吸入制造脂質(zhì)體的1毫升玻璃注射器中，用力推注射器，使脂質(zhì)懸液通過100 nm孔徑的濾膜，反復(fù)5次后，就可以得到直徑約100 nm均勻的脂質(zhì)體，將該脂質(zhì)體置于4 °C保存留用。1. 3 K+敏感的熒光信號記錄將100 ul包被有K+熒光指示劑PBFI和NMDG-Cl的脂質(zhì)體懸液加入1. 9 ul含有(10 mM HEPES, 100 mM KCl，pH 7.0)的浴槽中，置于熒光顯微鏡上，給予350 nm激發(fā)光，并在508 nm處實(shí)時記錄發(fā)射光。1. 4膜電位記錄將100 ul包被有100 mM KCl的脂質(zhì)體懸液加入1. 9 ml含有 (100 mM NaCl，10 mM HEPES, pH 7.0)的浴槽中，并加入 60 nM 的 safranin 0 置于熒光顯微鏡上，給予520 nm激發(fā)光，并在580 nm處實(shí)時記錄發(fā)射光。2.結(jié)果
2. 1本發(fā)明多肽在脂質(zhì)體膜上介導(dǎo)K+的通透
如圖3所示，當(dāng)脂質(zhì)體內(nèi)液是100 mM NMDG-Cl并含有400 uM PBFI，而脂質(zhì)體外是100 mM KC1，在外液中加入5 uM本發(fā)明多肽時，脂質(zhì)體的PBFI熒光強(qiáng)度迅速升高，因?yàn)镻BFI和 K+結(jié)合后，熒光強(qiáng)度會升高，所以這個脂質(zhì)體內(nèi)熒光強(qiáng)度的升高說明脂質(zhì)體外有K+通過本發(fā)明多肽形成的通道流進(jìn)脂質(zhì)體內(nèi)；因?yàn)楸景l(fā)明多肽的溶劑是DMS0，所以采用DMSO作對照，DMSO加入脂質(zhì)體外液后只稍微提高基線水平(圖3)。2. 2本發(fā)明多肽能改變脂質(zhì)體膜電位
月旨質(zhì)體內(nèi)充滿100 mM KCl，外液是100 mM NaCl和60 nM safranin 0 (膜電位熒光指示劑)，當(dāng)在外液加入5 uM本發(fā)明多肽時，safranin 0的熒光強(qiáng)度立即升高(圖4)，safranin 0熒光強(qiáng)度升高代表脂質(zhì)體膜電位超極化，說明有K+從脂質(zhì)體內(nèi)流到外面，使脂質(zhì)體內(nèi)電位降低而出現(xiàn)超極化；而在DMSO對照組，DMSO沒有顯著升高脂質(zhì)體膜電位(圖4)。在實(shí)驗(yàn)最后，加入10 mM melittin破壞脂質(zhì)體膜，熒光強(qiáng)度立即降低，說明熒光強(qiáng)度的升高是由于脂質(zhì)體膜電位超極化弓丨起，而不是由于本發(fā)明多肽對熒光指示劑的直接影響造成。實(shí)施例4
本發(fā)明多肽(Leu-Tyr-Leu-Ala-Val-Met-Val-Phe-Ala-Leu-Val-Leu-Gly-Trp-Met-A sn-Ala-Leu-Tyr-Phe-Thr-Arg-Gly-Leu)弓丨起血管平滑肌細(xì)胞膜超極化并降低高鉀引起的內(nèi)鈣升高
1.材料和方法
1.1實(shí)驗(yàn)動物和材料健康雄性SD大鼠(5-6周齡，體重約150 g)由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；DMEM平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、鈣熒光指示劑Fluo-4、細(xì)胞膜電位熒光指示劑DiBAC4(3)購自^witrogen公司(美國)。鈣成像熒光記錄系統(tǒng)(TILL公司，德國)。1. 2血管平滑肌細(xì)原代培養(yǎng)平滑肌組織塊的獲得將大鼠脫頸椎后，迅速開胸取出胸主動脈，常溫下，在通有 95 % O2 + 5 % CO2 混合氣的 KH 液(118 mM NaCl, 4. 7 mM KCl, 2. 5 mM CaCl2, 1. 2 mM KH2PO4, 1. 2 mM MgSO4 · 7H20, 25. 2 mM NaHCO3, and 11. 1 mM glucose)平皿中，仔細(xì)分離血管周圍的脂肪和結(jié)締組織，然后縱向剖開動脈，用棉簽輕刮去血管內(nèi)膜，再剝?nèi)ネ饽?，將僅剩的平滑肌層斜行剪成1X5 mm的條塊，將平滑肌組織塊貼在培養(yǎng)皿底部并放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中約20分鐘后，緩慢從培養(yǎng)皿壁加入培養(yǎng)基，然后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天左右可見大量平滑肌細(xì)胞爬出，每3天換一次新鮮的培養(yǎng)基。1.3血管平滑肌細(xì)膜電位和細(xì)胞內(nèi)鈣測定
用胰酶將培養(yǎng)的雄主動脈血管平滑肌細(xì)胞消化下來后，種在18 mm直徑的圓形蓋玻片上，放在12孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3天，將種有細(xì)胞的蓋玻片放入浴槽中，加入生理緩沖液(140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM glucose, 5 mM Hepes, pH 7. 4)， 并加入0. 1微摩爾/升的DiBAC4(3)(細(xì)胞膜電位記錄)或10 uM的Fluo_4 (細(xì)胞內(nèi)鈣測定)置于37 °C培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，然后用生理緩沖液沖洗2次后，再加入新鮮的生理緩沖液用于實(shí)驗(yàn)。將浴槽置于顯微鏡平臺上，調(diào)好焦距，選好視野，用488 nm的激發(fā)光激發(fā)Fluo-4 鈣熒光指示劑，并實(shí)時記錄516 nm發(fā)射光；用535 nm激發(fā)光激發(fā)DiBAC4 (3)細(xì)胞膜電位熒光指示劑，并實(shí)時記錄580 nm發(fā)射光。2.結(jié)果
2.1本發(fā)明多肽引起血管平滑肌細(xì)胞膜超極化
原代培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞膜電位用DiBAC4C3)膜電位敏感的熒光指示劑測定。在細(xì)胞用含有100 nM DiBAC4(3)的生理緩沖液孵育20分鐘后，當(dāng)細(xì)胞外液換成含有DiBAC4 (3) 的60 mM KCl的緩沖液后，細(xì)胞膜電位迅速去極化(圖5)，待膜電位趨于穩(wěn)定后，依次累積加入0.1 uM、l uM本發(fā)明多肽，細(xì)胞膜電位慢慢復(fù)極化(圖5)，說明本發(fā)明多肽形成的通道增加了平滑肌細(xì)胞膜對K+的通透性，使更多的K+從細(xì)胞內(nèi)流出，從而使細(xì)胞膜電位復(fù)極化。2.2本發(fā)明多肽降低血管平滑肌細(xì)胞高鉀引起的內(nèi)鈣升高
原代培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子用Fluo-4鈣離子熒光指示劑標(biāo)記。細(xì)胞用含有 10 uM Fluo-4的生理緩沖液孵育30分鐘后，當(dāng)細(xì)胞外液換成60 mM KCl的緩沖液，細(xì)胞膜電位迅速去極化，從而使細(xì)胞膜上電壓依賴鈣通道開放，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高(圖6)，待細(xì)胞內(nèi)鈣濃度穩(wěn)定后，加入100 nM的本發(fā)明多肽，平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度迅速降低(圖6)。實(shí)施例5
本發(fā)明多肽(Leu-Tyr-Leu-Ala-Val-Met-Val-Phe-Ala-Leu-Val-Leu-Gly-Trp-Met-As n-Ala-Leu-Tyr-Phe-Thr-Arg-Gly-Leu)降低激動劑引起的血管收縮 1.材料和方法
1.1實(shí)驗(yàn)動物和材料健康雄性C57小鼠(5-6周齡，體重約20 g)由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供；張力換能器(JH-2，量程為0-10 g，北京航天醫(yī)學(xué)工程研究所，中國);生物機(jī)能信號采集系統(tǒng)(Biolap 420S,成都泰盟公司，中國)；苯腎上腺素(phenyl印hrine，ΡΕ) 購自上海禾豐制藥有限公司；乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)購自上海試劑三廠。1.2胸主動脈環(huán)的制備將小鼠脫頸椎后，迅速開胸取出胸主動脈，常溫下，在通有95 ^ + 5 % CO2混合氣的KH液平皿中，仔細(xì)分離血管周圍的脂肪和結(jié)締組織并將其剪成(2-3) mm的動脈環(huán)。1. 3實(shí)驗(yàn)步驟將水平恒溫浴槽內(nèi)充盈KH液并持續(xù)通有95 % & + 5 % CO2混合氣以保持PH在7. 4，同時通過恒溫器將浴槽溫度控制在37 °C。把動脈環(huán)的一邊穿在水平恒溫浴槽上的可微調(diào)距離的細(xì)鋼絲上，另一邊穿在張力換能器的細(xì)鋼絲上，張力換能器接在Biolap 420S生物機(jī)能信號采集系統(tǒng)上并用計算機(jī)監(jiān)視和記錄張力信號，通過浴槽上可調(diào)的細(xì)鋼絲施加500-550 mg的前負(fù)荷平衡1 h，期間每15分鐘換一次KH液。然后用60 mM KCl預(yù)激1次，10分鐘后用KH液反復(fù)3次洗去60 mM KCl，重新平衡30分鐘，再用60 mM KCl收縮血管并記錄其最大張力。然后同樣方法用10 uM PE預(yù)激并用10 uM ACh舒張 1次，再用60 mM KCl收縮血管達(dá)平臺后，累積濃度加入本發(fā)明多肽(1，3，10，30uM)，分別記錄其值。2.結(jié)果
小鼠胸主動脈用受體激動劑苯腎上腺素(10 uM)收縮后，依次累積濃度(1，3，10， 30 uM)加入本發(fā)明多肽，血管出現(xiàn)濃度依賴性舒張(圖7)。
權(quán)利要求
1.一種具有自組裝鉀通道功能的多肽，其特征在于所述多肽由M個氨基酸組成，所述多肽的氨基酸序列如亮氨酸-酪氨酸-亮氨酸-丙氨酸-纈氨酸-甲硫氨酸-纈氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-亮氨酸-纈氨酸-亮氨酸-甘氨酸-色氨酸-甲硫氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-亮氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-蘇氨酸-精氨酸-甘氨酸-亮氨酸所示，(所述多肽的氨基酸序列為Leu-Tyr-Leu-Ala-Val-Met-Val-Phe-Ala-Leu-Val-Leu-Gly-Trp-Met-Asn-Ala-Leu-Tyr-Phe-Thr-Arg-Gly-Leu)ο
2.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述具有自組裝鉀通道功能的多肽的核苷酸。
3.—種如權(quán)利要求1所述的具有自組裝鉀通道功能的多肽制備具有治療鉀通道功能障礙/缺失引起的疾病、高血壓藥物的應(yīng)用，也可用于制備具有改變脂質(zhì)體、細(xì)胞膜電位的研究領(lǐng)域工具藥的應(yīng)用。
4.一種如權(quán)利要求2所述的具有自組裝鉀通道功能的多肽的核苷酸制備具有治療鉀通道功能障礙/缺失引起的疾病、高血壓藥物的應(yīng)用，也可用于制備具有改變脂質(zhì)體、細(xì)胞膜電位的研究領(lǐng)域工具藥的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種具有自組裝鉀通道功能的多肽。該多肽的多肽片段、類似物、衍生物、變體的氨基酸主序列具有與該多肽氨基酸主序列≥70%的相同性，≥90%的相似性；多肽、核苷酸、多肽片段、多肽類似物、多肽衍生物和多肽變體用于制備具有治療鉀通道功能障礙/缺失引起的疾病、高血壓藥物的應(yīng)用，也可用于制備具有改變脂質(zhì)體、細(xì)胞膜電位的研究領(lǐng)域工具藥的應(yīng)用。是一種治療鉀通道功能障礙/缺失性疾病和改變細(xì)胞膜電位的新方法。
文檔編號C12N15/11GK102199197SQ20111009143
公開日2011年9月28日 申請日期2011年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月13日
發(fā)明者朱金行, 杜鵑, 柯道平, 沈兵, 范禮斌 申請人:安徽醫(yī)科大學(xué)