專利名稱：一種實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr檢測(cè)美洲型prrsv及其變異株的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種可以精確、特異、快速檢測(cè)美洲型PRRSV及其變異株的方法。
背景技術(shù)：
It M M % Bf nI ^ -π IE (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)，俗稱豬藍(lán)耳病，是由PRRSV (豬藍(lán)耳病病毒)感染引起的高度傳染性免疫抑制疾病， 以成年豬早產(chǎn)、流產(chǎn)和死胎，以及仔豬呼吸異常為特征，常常繼發(fā)其他病原感染。自1987年美國(guó)報(bào)道以來(lái)，該病已逐漸成為困擾世界各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失，也是集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)中豬病控制的重點(diǎn)和難點(diǎn)。我國(guó)1996年首次報(bào)道PRRS，關(guān)于該病發(fā)生、流行以及研究的報(bào)告日趨增多。PRRSV分為美洲型和歐洲型，截止目前我國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)由歐洲型毒株感染引起的。2006年5月份以來(lái)，在我國(guó)多個(gè)省份暴發(fā)流行并造成仔豬大量死亡的豬“高熱病”疫情，經(jīng)過(guò)流行病學(xué)調(diào)查、病原分離鑒定、動(dòng)物試驗(yàn)等科技攻關(guān)， 證實(shí)了其病原為美洲型PRRSV變異株(NSP2 1594 1680缺失)。傳統(tǒng)的PRRS診斷方法有病毒分離、ELISA、免疫過(guò)氧化酶單層試驗(yàn)、間接熒光試驗(yàn)、血清中和試驗(yàn)等，以上傳統(tǒng)診斷方法曾經(jīng)在PRRSV的診斷中發(fā)揮過(guò)重大作用，但隨現(xiàn)在生物診斷技術(shù)的發(fā)展日益凸顯出其不足操作過(guò)程繁瑣，需時(shí)較長(zhǎng)，準(zhǔn)確度也不能滿足目前檢測(cè)需要且無(wú)法區(qū)分PRRSV和PRRSV變異株。在實(shí)際診斷過(guò)程中很容易漏檢和誤檢。因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)美洲型PRRSV及其變異株的方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問(wèn)題。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種用于實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)美洲型PRRSV及其變異株的特異性引物，其中， PRRSV群通用型特異性引物序列如SEQ NO. 1-2所示；PRRSV變異株特異性引物序列如SEQ N0. 4-5 所示。一種用于實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)美洲型PRRSV及其變異株的特異性探針，其中，PRRSV群通用型特異性探針序列如SEQ N0. 3所示；PRRSV變異株特異性探針序列如SEQ N0. 6所示。所述的用于實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)美洲型PRRSV及其變異株的特異性探針，其中，所述PRRSV群通用型特異性探針和PRRSV變異株特異性探針的5’端都標(biāo)記發(fā)光基團(tuán) FAM, 3'端都標(biāo)記泯滅基團(tuán)TAMRA。
一種使用上述的引物和探針的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)美洲型PRRSV及其變異株方法，其中，包括以下步驟
S100、樣品的預(yù)處 理對(duì)采集的樣品分別編號(hào)進(jìn)行編號(hào)，分別取少量的樣品混合青、鏈霉素雙抗溶液，勻漿，取上清，4°C過(guò)夜；
S200、RNA提取對(duì)采集的樣品提取RNA ；
S300、PRRSV群實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)以上述步驟所提取的RNA為模板，使用 PRRSV群通用型特異性引物和PRRSV群通用型特異性探針配制實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，先于樣品中篩選PRRSV ；
S400、PRRSV變異株實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)對(duì)上述PRRSV群通用型特異性引物和PRRSV群通用型特異性探針PCR擴(kuò)增呈陽(yáng)性的樣品再使用PRRSV變異株特異性引物和 PRRSV變異株特異性探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)，以檢測(cè)是否是屬于PRRSV變異株病毒；
S500、根據(jù)PRRSV群實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)結(jié)果和PRRSV變異株實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR反應(yīng)結(jié)果，鑒定診斷是否含有PRRSV或PRRSV變異株。所述的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)美洲型PRRSV及其變異株方法，其中，所述步驟 S300中的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系為25 μ L，其中，每條PRRSV通用型特異性引物終濃度為0. 4 μ mol/L, PRRSV通用型特異性探針濃度為0. 2 μ mol/L ；
實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)條件為 42°C 30min,92°C 2min,92°C 10s，55°C 30s，40 個(gè)循環(huán)。所述的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)美洲型PRRSV及其變異株方法，其中，所述步驟 S400中的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系為25 μ L，其中，每條PRRSV變異株特異性引物終濃度為0. 4 μ mol/L, PRRSV變異株特異性探針濃度為0. 2 μ mol/L ；
實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)條件為 42°C 30min,92°C 2min,92°C 10s，55°C 30s，40 個(gè)循環(huán)。有益效果本發(fā)明應(yīng)用Lightcycler2.0熒光PCR儀建立了同時(shí)針對(duì)PRRSV M基因和NSP2基因的熒光RT-PCR方法，其中針對(duì)NSP2基因的診斷方法可區(qū)分美洲型PRRSV和 PRRSV變異株(NSP2 1594-1680缺失)，針對(duì)保守的M基因的引物設(shè)計(jì)策略，還可有效防止因 NSP2區(qū)突變而造成的漏檢。經(jīng)過(guò)對(duì)本發(fā)明所建立的方法進(jìn)行了特異性、靈敏度的驗(yàn)證，結(jié)果顯示可以較好的將PRRSV同PRRSV變異株(NSP2 1594-1680缺失)以及豬類其他易感病毒區(qū)分開，且靈敏度可以達(dá)到0.47 TCID50。另外，本發(fā)明所建立的方法整個(gè)反應(yīng)過(guò)程是閉管操作，在最大程度上減少了體系的污染。本發(fā)明在診斷時(shí)間上同傳統(tǒng)方法相比自獲得待檢樣品到提取核酸，配制熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系，直到出現(xiàn)反應(yīng)結(jié)果，整個(gè)過(guò)程可以在2. 5 h內(nèi)完成，在保證檢驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上大大縮短了檢驗(yàn)所需時(shí)間。


圖1是PRRSV群實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR特異性擴(kuò)增熒光曲線。圖2是PRRSV變異株實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR特異性擴(kuò)增熒光曲線。圖3是PRRSV群特異性實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)的靈敏度曲線圖，從左到右的曲線的稀釋倍數(shù)依次是104、103、102、10。圖4是PRRSV變異株特異性實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)的靈敏度曲線圖，從左到右的曲線的稀釋倍數(shù)依次是104、103、102、10。圖5是本發(fā)明實(shí)施例1中PRRSV群實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)結(jié)果圖。圖6是本發(fā)明實(shí)施例1中PRRSV變異株實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供一種實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)美洲型PRRSV及其變異株的方法，為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明的目的是提供一種實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)美洲型PRRSV及其變異株的方法。本發(fā)明方法的靈敏度經(jīng)驗(yàn)證后可達(dá)到0.47 TCID50。同時(shí)可以很好的將美洲型PRRSV及其變異株同豬類其他易感病毒區(qū)分開，證明特異性良好。在使用熒光PCR儀 Lightcycler實(shí)施本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，污染性小，靈敏快速，從獲得模板至檢測(cè)出結(jié)果只需70min，在保證對(duì)美洲型PRRSV及其變異株檢測(cè)準(zhǔn)確性的前提下大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。本發(fā)明的用于鑒別診斷美洲型PRRSV及其變異株實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的確立過(guò)程如下
1、特異性引物、探針設(shè)計(jì)在GenBank中下載多個(gè)美洲型PRRSV M基因序列和病毒變異株(NSP2 1594 1680缺失株)NSP2區(qū)域基因序列，用CLUSTAL X進(jìn)行序列分析，找到保守片段用Primer Express 2. 0進(jìn)行特異性引物、探針設(shè)計(jì)。2、特異性探針合成由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。3、特異性探針處理在特異性探針的5’端標(biāo)記發(fā)光基團(tuán)FAM，3’端標(biāo)記泯滅基團(tuán) TAMRA0
4、PRRSV及其變異株、對(duì)照病毒核酸的提取使用Mrcgene公司的TRIzol試劑對(duì)提取 I3RRSV弱毒疫苗株(Ch-Ia株、ATCC VR-2332株)和變異PRRSV毒株(⑶BY-3株、JX-A1株)、 豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、日本乙型腦炎病毒等病毒RNA，使用 OMEGA公司DNA提取試劑盒提取豬偽狂犬病毒和豬圓環(huán)病毒2型基因組DNA，分別提取核酸，方法按照說(shuō)明書進(jìn)行。5,RT-PCR擴(kuò)增以步驟4中提取的PRRSV及其變異株RNA為模板，使用TaKaRa公司的一步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，每條特異性引物的終濃度為0. 2 μ mol/L,反應(yīng)條件為50°C 30 min，94°C 2 min，94°C 10s，58°C 30s, 72°C 30 s，72°C 7 min，設(shè)定為 40個(gè)循環(huán)。電泳結(jié)束后取5 μ L在1.5%瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。6、目的基因的克隆、構(gòu)建重組質(zhì)粒將步驟5中經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后檢測(cè)到的目的條帶膠回收，采用T-A克隆方案克隆至pMDIS-T載體。使用QIAGEN公司的質(zhì)粒DNA抽提純化試劑盒抽提重組質(zhì)粒，操作步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行，重組質(zhì)粒送廣州英駿公司測(cè)序，測(cè)序鑒定后作為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性品。7、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的建立
(I)PRRSV群特異性試驗(yàn)分別以PRRSV弱毒疫苗株(Ch-Ia株、ATCC VR-2332株)、PRRSV 變異株(GDBY-3株、JXAl株)、豬瘟病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、日本乙型腦炎病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型的核酸為模板做PRRSV群特異性熒光RT-PCR 反應(yīng)，同時(shí)用健康豬內(nèi)臟組織提取的核酸作為陰性對(duì)照，使用PRRS V群通用型特異性引物、 探針，檢測(cè)群通用型特異性引物探針的特異性；反應(yīng)體系使用深圳匹基公司的顆粒酶和珠?？频巧锛夹g(shù)有限公司的TaqDNA聚合酶配制，每個(gè)反應(yīng)使用1/4顆粒酶和2 U TaqDNA聚合酶。每條特異性引物終濃度為0. 4 ymol/L，特異性探針濃度為0.2 μ mol/L，加入DEPC H2O 將每個(gè)反應(yīng)補(bǔ)足到 25 μ L0 反應(yīng)條件為 42°C 30min,92°C 2 min,92°C 10 s，55°C 30 s, 40個(gè)循環(huán)；PRRSV群特異性試驗(yàn)結(jié)果圖見圖1。(2)PRRSV變異株特異性試驗(yàn)分別以PRRSV弱毒疫苗株(Ch-la株、ATCC VR-2332 株)、PRRSV變異株(GDBY-3株、JXAl株)RNA為模板，使用PRRSV變異株特異性引物、探針，檢測(cè)PRRSV變異株特異性引物探針的特異性，同時(shí)用健康豬內(nèi)臟組織提取的核酸作為陰性對(duì)照。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同PRRSV群特異性試驗(yàn)。PRRSV變異株特異性試驗(yàn)結(jié)果見圖2。(3)靈敏度試驗(yàn)對(duì)⑶BY-3 (PRRSV變異毒株)分離株進(jìn)行10倍倍比稀釋，每個(gè)稀釋度取200 μ L提取病毒RNA為模板，配制反應(yīng)體系在熒光PCR儀上檢測(cè)進(jìn)行敏感性試驗(yàn)， 檢測(cè)到的最低濃度作為該方法的靈敏度。PRRSV群特異性實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果見圖3，PRRSV變異株特異性實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果見圖4，從左到右的曲線稀釋倍數(shù)依次是104、103、102、10。8、臨床可疑樣品檢測(cè)建立的兩種熒光RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)24份臨床可疑樣品進(jìn)行檢測(cè)，包括豬肺、淋巴結(jié)、組織樣品和血液。同時(shí)使用病毒分離方法進(jìn)行檢測(cè)。9、用于鑒別診斷美洲型PRRSV及其變異株熒光定量RT-PCR方法確立。本發(fā)明的用于鑒別診斷美洲型PRRSV及其變異株熒光定量RT-PCR方法具體步驟如下
S100、樣品的預(yù)處理對(duì)采集的樣品分別編號(hào)進(jìn)行編號(hào)，分別取少量的樣品混合青、鏈霉素雙抗溶液，勻漿，取上清，4°c過(guò)夜。S200、RNA提取使用Invitrogen公司的TRIzol試劑對(duì)采集的樣品提取RNA，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。S300,PRRSV群實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)以上述步驟所提取的RNA為模板，使用 PRRSV群通用型特異性引物和PRRSV群通用型特異性探針配制實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系先于樣品中篩選PRRSV。其中，PRRSV群通用型特異性引物F :5，-GATTGCGGCAAATGATA ACCA-3，，R 5，-AACCCGGGCACCAATGT-3，；PRRSV 群通用型特異性探針 P FAM-ATTTGTCGTCCGGCGTCCCG-TA MRA。反應(yīng)體系使用深圳匹基公司的顆粒酶和珠海科登生物技術(shù)有限公司的TaqDNA 聚合酶配制，每個(gè)反應(yīng)使用1/4顆粒酶和2U TaqDNA聚合酶。每條特異性引物終濃度為 0.4 μ mol/L，特異性探針濃度為0.2 μ mol/L，加入DEPC H2O將每個(gè)反應(yīng)補(bǔ)足到25 μ L。反應(yīng)條件為 42°C 30min，92°C 2min，92°C 10s，55°C 30s，40 個(gè)循環(huán)。S400、PRRSV變異株實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)對(duì)上述PRRSV群通用型特異性引物、探針擴(kuò)增呈陽(yáng)性的樣品再使用PRRSV變異株特異性引物和PRRSV變異株特異性探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)，以檢測(cè)是否是屬于PRRSV變異株病毒。其中，PRRSV變異株特異性引物序列F :5，-CAGGATGAGCCTC TGGATTTG-3，，R 5，-CCTCCAGGATGCCCATGTT-3，；PRRSV 變異株特異性探針 P :FAM-CGGAATATGAGGCTTTCCCCCT AGCA-TAMRA。PRRSV變異株實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件均與PRRSV群實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)相同。S500、根據(jù)PRRSV群實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)結(jié)果和PRRSV變異株實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR反應(yīng)結(jié)果，鑒定診斷是否含有PRRSV或PRRSV變異株。實(shí)施例1
為在一定程度上評(píng)估珠海市大型豬場(chǎng)的PRRSV流行情況，我中心實(shí)驗(yàn)室共采集了臨床可疑樣品24份。采用本發(fā)明中所建立的熒光定量RT-PCR方法鑒別診斷是否含有PRRSV或 PRRSV變異株病毒。1.樣品的預(yù)處理對(duì)采集的樣品分別編號(hào)1-24。分別取少量的樣品混合青、鏈霉素雙抗溶液，勻漿，取上清，4°C過(guò)夜。2. RNA提取使用Invitrogen公司的TRIzol試劑對(duì)采集的樣品提取RNA，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。3. PRRSV群實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)以上述步驟所提取的RNA為模板， 使用PRRSV群通用型特異性引物和PRRSV群通用型特異性探針配制實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系先于樣品中篩選PRRSV。PRRSV群通用型特異性引物序列為F 5，-GATTGCGGCAAATGATAACCA-3，，R :5，-AACCCGGGCACC AATGT-3，；PRRSV 群通用型特異性探針P :FAM-ATTTGTCGTCC GGCGTCCCG-TAMRA。反應(yīng)體系使用深圳匹基公司的顆粒酶和珠?？频巧锛夹g(shù)有限公司的TaqDNA聚合酶配制，每個(gè)反應(yīng)使用1/4顆粒酶和2U TaqDNA聚合酶。每條特異性引物終濃度為0. 4μπι01/1，特異性探針濃度為0. Zym0VLJnADEPC H2O 將每個(gè)反應(yīng)體系補(bǔ)足到25 μ L0反應(yīng)條件為42°C 30min,92°C 2min,92°C 10s，55°C 30s, 40個(gè)循環(huán)。1. PRRSV變異株實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)對(duì)上述PRRSV群通用型特異性引物和探針擴(kuò)增呈陽(yáng)性的樣品，再使用PRRSV變異株特異性引物、探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR反應(yīng)，以檢測(cè)是否是屬于PRRSV變異株病毒。PRRSV變異株特異性引物序列F 5，-CAGGATGAGCCTCTGGATTTG-3，，R :5，-CCTCCAGGATGC CCATGTT-3，；PRRSV 變異株特異性探針P :FAM-CGGAATATG AGGCTTTCCCCCTAGCA-TAMRA。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件均同PRRSV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)。2.結(jié)果=PRRSV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)中出現(xiàn)21份陽(yáng)性(21/24)，PRRSV群實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)結(jié)果如圖5所示；對(duì)這兩份樣品進(jìn)一步以PRRSV變異株實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR反應(yīng)確認(rèn)，結(jié)果為全部為陽(yáng)性(21/21 )，PRRSV變異株實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)結(jié)果如圖6所示。3.病毒分離按照常規(guī)病毒分理操作。結(jié)論本發(fā)明中實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法結(jié)果同傳統(tǒng)病毒分離結(jié)果一致。但是卻大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，并且本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，污染性小，又可以開展批量普查篩選，便于在實(shí)際臨床中應(yīng)用。應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的應(yīng)用不限于上述的舉例，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換，所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)美洲型PRRSV及其變異株的特異性引物，其特征在于，PRRSV群通用型特異性引物序列如SEQ NO. 1-2所示；PRRSV變異株特異性引物序列如 SEQ NO. 4-5 所示。
2.一種用于實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)美洲型PRRSV及其變異株的特異性探針，其特征在于，PRRSV群通用型特異性探針序列如SEQ NO. 3所示；PRRSV變異株特異性探針序列如 SEQ NO. 6 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)美洲型PRRSV及其變異株的特異性探針，其特征在于，所述PRRSV群通用型特異性探針和PRRSV變異株特異性探針的 5’端都標(biāo)記發(fā)光基團(tuán)FAM，3’端都標(biāo)記泯滅基團(tuán)TAMRA。
4.一種使用如權(quán)利要求1所述的特異性引物和如權(quán)利要求2所述的特異性探針的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)美洲型PRRSV及其變異株方法，其特征在于，包括以下步驟S100、樣品的預(yù)處理對(duì)采集的樣品分別編號(hào)進(jìn)行編號(hào)，分別取少量的樣品混合青、鏈霉素雙抗溶液，勻漿，取上清，4°C過(guò)夜；S200、RNA提取對(duì)采集的樣品提取RNA ；S300、PRRSV群實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)以上述步驟所提取的RNA為模板，使用 PRRSV群通用型特異性引物和PRRSV群通用型特異性探針配制實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，先于樣品中篩選PRRSV ；S400、PRRSV變異株實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)對(duì)上述PRRSV通用型特異性引物和 PRRSV通用型特異性探針PCR擴(kuò)增呈陽(yáng)性的樣品，再使用PRRSV變異株特異性弓丨物和PRRSV 變異株特異性探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)，以檢測(cè)是否是屬于PRRSV變異株病毒； S500、根據(jù)PRRSV群實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)結(jié)果和PRRSV變異株實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR反應(yīng)結(jié)果，鑒定診斷是否含有PRRSV或PRRSV變異株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)美洲型PRRSV及其變異株方法，其特征在于，所述步驟S300中的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系為25 μ L，其中，每條PRRSV 群通用型特異性引物終濃度為0. 4 μ mol/L, PRRSV群通用型特異性探針濃度為0. 2 μ mol/ L；實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)條件為 42°C 30min,92°C 2min,92°C 10s，55°C 30s，40 個(gè)循環(huán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)美洲型PRRSV及其變異株方法，其特征在于，所述步驟S400中的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系為25 μ L，其中，每條PRRSV 變異株特異性引物終濃度為0. 4 μ mol/L, PRRSV變異株特異性探針濃度為0. 2 μ mol/L ；實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)條件為 42°C 30min,92°C 2min,92°C 10s，55°C 30s，40 個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)美洲型PRRSV及其變異株方法，經(jīng)過(guò)對(duì)本發(fā)明所建立的方法進(jìn)行特異性、靈敏度的驗(yàn)證，結(jié)果顯示可以較好的將PRRSV同PRRSV變異株(NSP21594-1680缺失)以及豬類其他易感病毒區(qū)分開，且靈敏度可以達(dá)到0.47TCID50。本發(fā)明在診斷時(shí)間上同傳統(tǒng)方法相比自獲得待檢樣品到提取核酸，配制熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系，直到出現(xiàn)反應(yīng)結(jié)果，整個(gè)過(guò)程可以在2.5h內(nèi)完成，在保證檢驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上大大縮短了檢驗(yàn)所需時(shí)間。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102220435SQ201110084979
公開日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月6日
發(fā)明者廖秀云, 徐海聶, 沙才華, 王振全, 羅寶正, 薄清如, 鄺筱珊, 陳偉生 申請(qǐng)人:珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心