專利名稱：用液相芯片檢測(cè)蟲媒或接觸傳播病原的引物和探針及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種涵蓋9種臨床常見(jiàn)的蟲媒或接觸傳播的傳染病病原的檢測(cè)，尤其是一種借助液相芯片對(duì)9種臨床常見(jiàn)的蟲媒或接觸傳播的傳染病病原進(jìn)行檢測(cè)，屬于醫(yī)學(xué)監(jiān)測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乙型腦炎病毒(JEV)、登格熱病毒I型(DEN _1)、登格熱病毒II型(DEN _2)、登格熱病毒III型(DEN _3)、登格熱病毒IV型(DEN _4)、腸道病毒EV71型、腺病毒(ADV)、單純皰疹病毒I型(Herpes Virus 1)和單純皰疹病毒II型(Herpes Virus 2)是我國(guó)臨床常見(jiàn)的9種人類重大傳染病病原。其中乙型腦炎病毒，登格熱病I-IV型和腸道病毒EV71型為法定乙類傳染病。這9種病原體主要通過(guò)接觸或蟲媒傳播，易引起較大規(guī)模的流行，造成突發(fā)公共衛(wèi)生事件，危機(jī)人民的健康和社會(huì)的穩(wěn)定。對(duì)這些病原的早期診斷對(duì)于采取正確的治療方案和及時(shí)的應(yīng)對(duì)措施以防止疾病的傳播至關(guān)重要。目前臨床用于病毒檢測(cè)的常規(guī)方法主要有病原體的培養(yǎng)和分離，免疫學(xué)檢測(cè)和核酸PCR檢測(cè)。病原體培養(yǎng)和分離檢測(cè)方法是一種傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但是敏感性較低，檢測(cè)周期較長(zhǎng)，不利于病毒感染早期的診斷；免疫學(xué)檢測(cè)敏感性和特異性較強(qiáng)，但是檢測(cè)需要材料較多且測(cè)定的結(jié)果與抗體來(lái)源及親和力有關(guān)；核酸PCR檢測(cè)方法是目前靈敏度較高的一種檢測(cè)方法，較病原體分離方法的檢出率高，但是當(dāng)PCR的靶序列發(fā)生突變則容易造成假陰性結(jié)果。MASA液相芯片(Multi-Analyte Suspension Array，多功能懸浮點(diǎn)陣儀)技術(shù)是20 世紀(jì)90年代后期發(fā)展起來(lái)的一種新型芯片技術(shù)。該技術(shù)將流式檢測(cè)技術(shù)與芯片技術(shù)有機(jī)地結(jié)合在一起，具有高靈敏性，高異性，高通量，操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。液相芯片體系由許多大小均一的圓形微球構(gòu)成，每種微球上固定有不同的探針?lè)肿?，不同種類的微球帶用不同的熒光染料編碼，分子雜交在懸浮溶液中進(jìn)行。檢測(cè)過(guò)程中目的分子能夠與偶聯(lián)在微球上的探針特異性結(jié)合，使交聯(lián)探針的微球攜帶上報(bào)告分子藻紅蛋白，當(dāng)微球通過(guò)Luminex檢測(cè)儀時(shí)，該檢測(cè)儀上的紅色和綠色激光分別對(duì)單個(gè)微球上的編碼熒光和報(bào)告分子藻紅蛋白進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果通過(guò)熒光值直接判讀。由于液相芯片具有準(zhǔn)確性高，靈活性好，操作簡(jiǎn)單，通量大等特點(diǎn)，目前已被廣泛用在細(xì)胞因子的檢測(cè)，激酶的檢測(cè)，抗原決定簇的篩選，疾病病原體的檢測(cè)，以及與各種抗原抗體反應(yīng)相關(guān)的檢測(cè)當(dāng)中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用液相芯片檢測(cè)蟲媒或接觸傳播病原的引物和探針，還提供一種利用上述引物和探針檢測(cè)臨床常見(jiàn)呼吸道傳染病病原的方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題采用以下的技術(shù)方案
本發(fā)明提供的是一種基于MASA液相芯片對(duì)臨床常見(jiàn)的蟲媒或接觸傳播的傳染病病原進(jìn)行檢測(cè)的引物，該引物為特異性檢測(cè)引物，是根據(jù)基因庫(kù)中能夠檢索到的目標(biāo)病毒所有
5的核苷酸序列分別進(jìn)行同源性分析和設(shè)計(jì)的，具體是
(1)用于檢測(cè)乙型腦炎病毒的引物F、引物R的DNA序列 JEV-F CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCCGAGAGAATTCAGGAGGTG JEV-R TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGCGAGCATGCGGTGTTCAC
(2)用于檢測(cè)登格熱病毒I型的引物F、引物R的DNA序列 DEN I-F :CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCGTGCAATATGGTACATGTGG DEN I-R :TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCATTCTGAAGATCATCCTCTG
(3)用于檢測(cè)登格熱病毒II型的引物F、引物R的DNA序列 DEN 2-F :CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTCGGCACGTGAGGCTGTTG
DEN 2-R :TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCCACTCCGCTCAGAGAGTTC
(4)用于檢測(cè)登格熱病毒III型的引物F、引物R的DNA序列 DEN 3-F :CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGGCAGTAGAGCTATATGGTAC DEN 3-R :TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGTGTCCCAACCAGCTGTGTC
(5)用于檢測(cè)登格熱病毒IV型的引物F、引物R的DNA序列 DEN 4-F :CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTTAGGAGAGTTTGGCAGAGC DEN 4-R :TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTTCTTGTCTATCTCCTCCAGG
(6)用于檢測(cè)腸道病毒EV71的引物F、引物R的DNA序列 EV71-F CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGCAGCCCAAAAGAACTTCAC EV71-R TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAACACAGCGTGTCTCAATCAT
(7)用于檢測(cè)腺病毒的引物F、引物R的DNA序列 ADV-F CTGGTCCGTACTTCCGAGCGARTGGKCDTACATGCACATC ADV-R TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCGRTCBGTGGTCACRTCGTG
(8)用于檢測(cè)單純皰疹病毒I型和II型的引物F、引物R的DNA序列相同，序列為 Herpes Virus-F
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGCTCGAGTGCGAAAAAACGTTC Herpes Virus-R
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGCGGTTGATAAACGCGCAGT。
本發(fā)明提供的用液相芯片檢測(cè)蟲媒或接觸傳播病原的探針有9種，它們分別與上述的8種引物對(duì)應(yīng)設(shè)計(jì)制成，所述探針為特異性檢測(cè)探針，其DNA序列為
(1)用于檢測(cè)乙型腦炎病毒的JEV-probe探針的DNA序列 NH2- (CH2) 12 CCAGCTATGTCACGGAGGAT
(2)用于檢測(cè)登格熱病毒I型的DENΙ-probe探針的DNA序列 NH2- (CH2) 12 GGAATCTTTGATATGTCTCTGA
(3)用于檢測(cè)登格熱病毒II型的DEN2-probe探針的DNA序列 NH2- (CH2) 12GAACCAGTGATCTTCATTCAG
(4)用于檢測(cè)登格熱病毒III型的DEN3-probe探針的DNA序列 NH2- (CH2) 12TCACGCGAGAACCAGTGGT
(5)用于檢測(cè)登格熱病毒IV型的DEN4-probe探針的DNA序列 NH2- (CH2) 12CTCTGCCAAACCAGTGATCT(6)用于檢測(cè)腸道病毒EV71的EV71-probe探針的DNA序列 NH2- (CH2) 12TCAGCAGCTTGGAGTGCTGG
(7)用于檢測(cè)腺病毒的ADV-probe探針的DNA序列 NH2- (CH2) 12GCRCGGGCRAACTGCACCA
(8)用于檢測(cè)單純皰疹病毒I型的HerpesVirus 1-probe探針的DNA序列 NH2- (CH2) 12CATCTTACCCCCGTAGATGAC
(9)用于檢測(cè)單純皰疹病毒II型的HerpesVirus 2-probe探針的DNA序列 NH2- (CH2) 12CATCTTGCCCCCGCAGATGAC。本發(fā)明提供的用液相芯片檢測(cè)蟲媒或接觸傳播病原的方法，是采用上述的引物和探針，通過(guò)兩輪PCR反應(yīng)，分子雜交，再用LuminexlOO系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，從而確定樣本中所含病原體的種類。所述方法可以按下列步驟順序進(jìn)行 a.分別提取樣本中總DNA和RNA。b.第一輪 PCR 反應(yīng)
先以步驟a中提取的樣本總DNA為模版，分別用腺病毒特異性PCR引物ADV-F和ADV-R、 單純皰疹病毒I型、單純皰疹病毒II型通用特異性PCR引物Herpes Virus-F和Herpes Virus-R進(jìn)行第一輪PCR ；
在PCR管中加入下列物質(zhì)10XPCR緩沖液2. 5uL、四種脫氧核糖核苷酸0. 5uL、濃度為 20umol/L PCR引物F 0. 25uL、濃度為 20umol/L PCR引物R 0. 25uL、Taq DNA聚合酶 0. 5uL、 DNA模板0. 5uL和超純水20. 5uL ；
然后使用Biometra T personal PCR儀進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，所得的產(chǎn)物為第一輪PCR 擴(kuò)增的目標(biāo)基因片段。
C.第一輪 RT-PCR 反應(yīng)
以步驟a中提取的樣本總RNA為模版，進(jìn)行一步法RT-PCR，所用引物分別為乙型腦炎病毒正向和反向引物JEV-F和JEV-R、登格熱病毒I型正向和反向引物DEN I-F和DEN 1-R、 登格熱病毒II型正向和反向引物DEN 2-F和DEN 2-R、登格熱病毒III型正向和反向引物 DEN 3-F禾口 DEN 3-R、登格熱病毒IV型正向和反向引物DEN 4-F禾口 DEN 4-R、腸道病毒EV71 型正向和反向引物EV71-F和EV71-R ；
在PCR管中加入下列物質(zhì)5 X RT-PCR緩沖液5uL、四種脫氧核糖核苷酸luL、酶luL、每個(gè)反應(yīng)中加入RNA酶抑制劑0. 5u L、濃度為20umol/L PCR引物F 0. 25uL、濃度為20umol/ L PCR 引物 R 0. 25uL、RNA 模板 IuL,超純水 2IuL ；
然后將PCR管放入PCR儀中進(jìn)行第一輪RT-PCR反應(yīng)，得到的產(chǎn)物為第一輪PCR擴(kuò)增的目標(biāo)基因片段。 d.第二輪 PCR 反應(yīng)
以含有第一輪PCR擴(kuò)增的目標(biāo)基因片段的溶液為模板進(jìn)行第二輪PCR ； 在PCR管中加入下列物質(zhì)10XPCR緩沖液5uL、四種脫氧核糖核苷酸luL、濃度為 20umol/L 的通用引物 Universal-F luL、濃度為 20umol/L 的通用引物 Universal-R luL、 Taq DNA聚合酶luL、第一輪PCR的產(chǎn)物2uL和超純水39uL ；
然后將PCR管放入PCR儀中進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，得到第二輪PCR的產(chǎn)物為帶有生物素標(biāo)記的目標(biāo)基因溶液。e.雜交
分別把特異性檢測(cè)探針以共價(jià)方式結(jié)合到給定顏色的微球上，用雜交緩沖液稀釋，使得每微升含有100個(gè)微球；所述雜交緩沖液為1. 5 X TMAC的氯化四甲銨；
然后將帶有生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物分別與結(jié)合了探針的微球在棕色容器中進(jìn)行雜交， 得到熒光標(biāo)記的目標(biāo)基因與探針結(jié)合的產(chǎn)物。f.檢測(cè)
用LuminexlOO儀器分別讀取經(jīng)步驟e雜交后的9種微球上的熒光標(biāo)記的目標(biāo)基因與探針結(jié)合的產(chǎn)物的熒光檢測(cè)值；然后根據(jù)熒光檢測(cè)值旁定樣本中是否含探針對(duì)應(yīng)的病毒種類。本發(fā)明使用Biometra T personal PCR儀進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)時(shí)，其反應(yīng)條件建議為bl.94°C，5 分鐘；b2. 94°C，30 秒；b3.57°C，30 秒；b4.72°C，30 秒；b5.重復(fù)四次步驟 b2 b4 ；b6. 72 °C，10 分鐘；b7.降溫至 4°C。本發(fā)明使用Biometra T personal PCR儀進(jìn)行第一輪RT-PCR反應(yīng)，其條件建議為
cl.50°C，30 分鐘；c2.94°C，15 分鐘；c3. 94°C，30 秒；c4. 50°C，30 秒；c5.72°C，30 秒； c6.重復(fù)29次步驟c3 c5 ；c7. 72 °C，10分鐘；c8.降溫至4°C。本發(fā)明使用Biometra T personal PCR儀進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)時(shí)，其條件建議為 dl. 94°C，5 分鐘；d2. 94°C，30 秒；d3. 60°C，30 秒；d4. 72°C，30 秒；d5.重復(fù) 29 次步
驟 d2 d4 ；d6. 72°C, 10 分鐘；d7.降溫至 4°C。第二輪PCR反應(yīng)使用的通用引物(生物素修飾的通用引物)的序列為 Universal-F TACAGTCGGTCGCGTGCCTC
Universal-R biotin-CTGGTCCGTACTTCCGAGCG。本發(fā)明可以采用以下方法進(jìn)行雜交雜交體系為50uL，其中微球33uL，PCR產(chǎn)物 5uL，加入TE補(bǔ)充體積至50uL ； 96°C變性5min后，55°C雜交15min ；加入親和素-藻紅蛋白55°C雜交5min。所述方法包括PCR產(chǎn)物的獲得及與探針的雜交，檢測(cè)結(jié)果的判定步驟。其中 所述PCR產(chǎn)物的獲得及與探針的雜交用于液相芯片檢測(cè)的PCR產(chǎn)物通過(guò)兩輪PCR反
應(yīng)獲得。第一輪反應(yīng)用病毒特異性檢測(cè)引物分別進(jìn)行PCR和RT-PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因片段。腺病毒、單純皰疹病毒I型和單純皰疹病毒II型為DNA病毒，第一輪擴(kuò)增以樣本總DNA為模版進(jìn)行PCR。其他6種病原為RNA病毒，第一輪擴(kuò)增以樣本總RNA為模版進(jìn)行RT-PCR。第二輪反應(yīng)利用生物素標(biāo)記的通用引物以第一輪反應(yīng)產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR，使所獲得PCR產(chǎn)物帶有生物素標(biāo)記，同時(shí)第二輪PCR反應(yīng)具有將第一輪PCR信號(hào)放大的作用，增加檢測(cè)的靈敏度。獲得的PCR產(chǎn)物與偶聯(lián)在不同微球上的病毒特異性探針雜交。所述檢測(cè)結(jié)果的判定雜交產(chǎn)物與報(bào)告分子親和素-藻紅蛋白孵育，親和素-藻紅蛋白可與雜交產(chǎn)物上的生物素特異性結(jié)合，使之帶有熒光。通過(guò)Luminex檢測(cè)儀讀取微球上的熒光數(shù)值對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定。本發(fā)明可以采用以下方法根據(jù)熒光檢測(cè)值判斷樣本中是否含探針對(duì)應(yīng)的病毒種類對(duì)登格熱病毒I型、登格熱病毒II型、登格熱病毒III型、登格熱病毒IV型、腸道病毒EV71型、腺病毒、單純皰疹病毒1型和單純皰疹病毒II型的檢測(cè)，當(dāng)微球上的探針與帶有生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物雜交后的熒光檢測(cè)值> 200，則樣品中含有該探針對(duì)應(yīng)的病毒種類；當(dāng)熒光檢測(cè)值< 100，則樣品中不含該探針對(duì)應(yīng)的病毒種類；當(dāng)100《熒光檢測(cè)值<200時(shí)，不能確定樣品中是否含探針對(duì)應(yīng)的病毒種類。本發(fā)明可以采用以下方法根據(jù)熒光檢測(cè)值判斷樣本中是否含探針對(duì)應(yīng)的病毒種類對(duì)乙型腦炎病毒病原體的檢測(cè)，當(dāng)微球上的探針與帶有生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物雜交后的熒光檢測(cè)值> 1000，則樣品中含有該探針對(duì)應(yīng)的病毒種類；當(dāng)熒光檢測(cè)值< 500，則樣品中不含該探針對(duì)應(yīng)的病毒種類；當(dāng)500 <熒光檢測(cè)值<1000時(shí)，不能確定樣品中是否含探針對(duì)應(yīng)的病毒種類。本發(fā)明設(shè)計(jì)了針對(duì)9種臨床常見(jiàn)蟲媒或接觸傳播的傳染病病原的特異性檢測(cè)引物和探針，使用9種熒光編碼微球，利用液相芯片技術(shù)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)分析。發(fā)現(xiàn)基于液相芯片技術(shù)研制的針對(duì)9種臨床常見(jiàn)蟲媒或接觸傳播的傳染病病原的特異性檢測(cè)引物和探針具有特異性高、靈敏度高的特點(diǎn)，對(duì)所有9種病原體都可進(jìn)行明確的區(qū)分。本發(fā)明提供的用液相芯片檢測(cè)蟲媒或接觸傳播病原的方法，不僅檢測(cè)速度快，完成一次檢測(cè)僅需3. 5小時(shí)，一次檢測(cè)可以進(jìn)行多個(gè)樣本的同時(shí)檢測(cè)，且操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)費(fèi)用低，適合大范圍推廣應(yīng)用。在對(duì)臨床常見(jiàn)蟲媒或接觸傳播的傳染病病原進(jìn)行快速檢測(cè)和進(jìn)行早期診斷方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值?？傊景l(fā)明具有速度快、操作簡(jiǎn)單、敏感性高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，適合對(duì)9種臨床常見(jiàn)蟲媒或接觸傳播的傳染病病原的檢測(cè)及早期診斷；因而能為這些常見(jiàn)蟲媒或接觸傳播傳染病病原的早期診斷和治療及防止這些常見(jiàn)呼吸道傳染病病原的傳播作出重要貢獻(xiàn)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明基于MASA液相芯片技術(shù)對(duì)病原進(jìn)行檢測(cè)。運(yùn)用生物信息學(xué)知識(shí)和相關(guān)的生物信息學(xué)軟件，對(duì)在美國(guó)NCBI與日本DDBJ基因庫(kù)中能夠檢索到的9種目標(biāo)病毒的核苷酸序列分別進(jìn)行同源性分析，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物和特異性探針，通過(guò)兩輪PCR，分子雜交，再用 LuminexlOO系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，從而確定樣本中所含病原體的種類。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)例1
已知樣品1中含有乙型腦炎病毒(JEV)，按本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟如下
a.分別提取樣本中總DNA和RNA；
b.以步驟a中提取的樣本總DNA為模版，分別用腺病毒特異性PCR引物ADV-F和 ADV-R、單純皰疹病毒I型、單純皰疹病毒II型通用特異性PCR引物Herpes Virus-F和 Herpes Virus-R進(jìn)行第一輪PCR。各引物序列如下
ADV-F CTGGTCCGTACTTCCGAGCGARTGGKCDTACATGCACATC ADV-R TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCGRTCBGTGGTCACRTCGTG Herpes Virus-F :CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGCTCGAGTGCGAAAAAACGTTC Herpes Virus-R :TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGCGGTTGATAAACGCGCAGT。c.在PCR管中加入下列物質(zhì)10XPCR緩沖液2. 5uL、四種脫氧核糖核苷酸0. 5uL、 濃度為 20umol/L PCR 引物 F 0. 25uL、濃度為 20umol/L PCR 引物 R 0. 25uL、Taq DNA 聚合
9酶0. 5uL、DNA模板0. 5uL和超純水20. 5uL。使用Biometra T personal PCR 儀，PCR 過(guò)程條件為cl. 94°C，5 分鐘；c2. 94°C, 30 秒；c3. 57 °C，30 秒；c4. 72 °C，30 秒；c5.重復(fù)四次步驟 c2 c4 ； c6. 72 °C，10 分鐘；c7.降溫至4°C ；
所得的產(chǎn)物為第一輪PCR擴(kuò)增的目標(biāo)基因片段；
d.以步驟a中提取的樣本總RNA為模版，進(jìn)行一步法RT-PCR。所用引物分別為乙型腦炎病毒正向和反向引物JEV-F和JEV-R、登格熱病毒I型正向和反向引物DEN I-F和DEN 1-R、登格熱病毒II型正向和反向引物DEN 2-F和DEN 2-R、登格熱病毒III型正向和反向引物DEN 3-F和DEN 3-R、登格熱病毒IV型正向和反向引物DEN 4-F和DEN 4-R、腸道病毒 EV71型正向和反向引物EV71-F和EV71-R。各引物序列如下 JEV-F CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCCGAGAGAATTCAGGAGGTG JEV-R TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGCGAGCATGCGGTGTTCAC DEN I-F :CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCGTGCAATATGGTACATGTGG DEN I-R :TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCATTCTGAAGATCATCCTCTG DEN 2-F :CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTCGGCACGTGAGGCTGTTG DEN 2-R :TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCCACTCCGCTCAGAGAGTTC DEN 3-F :CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGGCAGTAGAGCTATATGGTAC DEN 3-R :TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGTGTCCCAACCAGCTGTGTC DEN 4-F :CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTTAGGAGAGTTTGGCAGAGC DEN 4-R :TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTTCTTGTCTATCTCCTCCAGG EV71-F CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGCAGCCCAAAAGAACTTCAC EV71-R TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAACACAGCGTGTCTCAATCAT。e.在PCR管中加入下列物質(zhì)5 X RT-PCR緩沖液5uL、四種脫氧核糖核苷酸luL、酶 IuL,RNA 酶抑制劑 0. 5uL、濃度為 20umol/L PCR 引物 F 0. 25uL、濃度為 20umol/L PCR 引物 R 0. 25uL、RNA 模板 IuL,超純水 21uL。使用Biometra T personal PCR儀，PCR過(guò)程條件為el. 50°C，30 分鐘；e2. 94°C, 15 分鐘；e3. 94°C，30 秒；e4. 50 °C，30 秒；e5. 72 °C，30 秒；e6.重復(fù)四次步驟 e3 e5 ；e7. 72°C，10 分鐘；e8.降溫至 4°C ；
所得的產(chǎn)物為第一輪PCR擴(kuò)增的目標(biāo)基因片段。f.以含有第一輪PCR擴(kuò)增的目標(biāo)基因片段的溶液為模板進(jìn)行第二輪PCR，在PCR 管中加入下列物質(zhì)10 XPCR緩沖液5uL、四種脫氧核糖核苷酸luL、濃度為20umol/L的通用引物 Universal-F luL、濃度為 20umol/L 的通用引物 Universal-R luL,Taq DNA 聚合酶 luL、第一輪PCR的產(chǎn)物2uL和超純水39uL ；
g.將PCR管放入PCR儀，PCR反應(yīng)過(guò)程條件為gl. 94°C，5分鐘；g2. 94°C，30秒；g3. 60 °C，30 秒；g4. 72 °C，30 秒；g5.重復(fù)四次步驟 g2 g4 ； g6. 72 °C，10 分鐘；g7.降溫至4°C ；
得到第二輪PCR的產(chǎn)物為帶有生物素標(biāo)記的目標(biāo)基因溶液。h.分別把特異性檢測(cè)探針以共價(jià)方式結(jié)合到給定顏色的微球上，用雜交緩沖液 (1.5 X TMAC，氯化四甲銨)稀釋，使得每微升含有100個(gè)微球，各探針序列如下JEV-probe =NH2-(CH2)12 CCAGCTATGTCACGGAGGAT
DEN 1-probe =NH2-(CH2)12 GGAATCTTTGATATGTCTCTGA
DEN 2-probe =NH2- (CH2) 12GAACCAGTGATCTTCATTCAG
DEN 3-probe =NH2- (CH2) 12TCACGCGAGAACCAGTGGT
DEN 4-probe =NH2- (CH2) 12CTCTGCCAAACCAGTGATCT
EV71-probe =NH2- (CH2) 12TCAGCAGCTTGGAGTGCTGG
ADV-probe =NH2- (CH2) 12GCRCGGGCRAACTGCACCA
Herpes Virus 1-probe: NH2-(CH2) 12CATCTTACCCCCGTAGATGAC
Herpes Virus 2-probe: NH2-(CH2) 12CATCTTGCCCCCGCAGATGAC。i.將帶有生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物分別與結(jié)合了探針的微球在棕色容器中進(jìn)行雜交，雜交體系為50uL，其中微球33uL，PCR產(chǎn)物5uL，加入TE補(bǔ)充體積至50uL。96°C變性 5min后，55°C雜交15min，加入親和素-藻紅蛋白55°C雜交5min，得到熒光標(biāo)記的目標(biāo)基因與探針結(jié)合的產(chǎn)物。j.用LuminexlOO儀器分別讀取經(jīng)步驟i雜交后的9種微球上的熒光標(biāo)記的目標(biāo)基因與探針結(jié)合的產(chǎn)物的熒光檢測(cè)值。k.當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為乙型腦炎病毒引物JEV-F及 JEV-R,步驟h的探針為乙型腦炎病毒探針JEV-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為1844，確認(rèn)樣品含有乙型腦炎病毒；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒I型引物DEN I-F及 DEN 1-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN Ι-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為15，確認(rèn)樣品不含登格熱病毒I型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒II型引物DEN 2-F及 DEN 2-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 2-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為19，確認(rèn)樣品不含登格熱病毒II型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒III型引物DEN 3-F及 DEN 3-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 3-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為23，確認(rèn)樣品不含登格熱病毒III型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒IV型引物DEN 4-F及 DEN 4-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 4-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為10，確認(rèn)樣品不含登格熱病毒IV型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為腸道病毒EV71引物EV71-F及 EV71-R,步驟g的探針為登格熱病毒I型探針EV71-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為18，確認(rèn)樣品不含腸道病毒EV71 ；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為腺病毒引物ADV-F及ADV-R，步驟g 的探針為流感病毒B型探針ADV-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為M，確認(rèn)樣品不含腺病毒；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為單純皰疹病毒引物Herpes Virus-F 及Herpes Virus-R，步驟g的探針為單純皰疹病毒I型探針Herpes Virus 1-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為93，確認(rèn)樣品不含單純皰疹病毒I型；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為單純皰疹病毒引物Herpes Virus-F及Herpes Virus-R，步驟g的探針為單純皰疹病毒II型探針Herpes Virus 2-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為98，確認(rèn)樣品不含單純皰疹病毒II型； 該檢測(cè)結(jié)果與樣品已知的結(jié)果完全一致。實(shí)例2
已知樣品中含有登格熱病毒I型(DEN -1)，按本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟與實(shí)例1相同，熒光檢測(cè)值的結(jié)果如下
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為乙型腦炎病毒引物JEV-F及JEV-R， 步驟h的探針為乙型腦炎病毒探針JEV-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為414，確認(rèn)樣品中不含乙型腦炎病毒；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒I型引物DEN I-F及 DEN 1-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN Ι-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為915，確認(rèn)樣品中含有登格熱病毒I型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒II型引物DEN 2-F及 DEN 2-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 2-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為44，確認(rèn)樣品不含登格熱病毒II型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒III型引物DEN 3-F及 DEN 3-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 3-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為9，確認(rèn)樣品不含登格熱病毒III型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒IV型引物DEN 4-F及 DEN 4-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 4-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為11，確認(rèn)樣品不含登格熱病毒IV型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為腸道病毒EV71引物EV71-F及 EV71-R,步驟g的探針為登格熱病毒I型探針EV71-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為31，確認(rèn)樣品不含腸道病毒EV71 ；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為腺病毒引物ADV-F及ADV-R，步驟g 的探針為流感病毒B型探針ADV-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為8，確認(rèn)樣品不含腺病毒；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為單純皰疹病毒引物Herpes Virus-F 及Herpes Virus-R，步驟g的探針為單純皰疹病毒I型探針Herpes Virus 1-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為13，確認(rèn)樣品不含單純皰疹病毒I型；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為單純皰疹病毒引物Herpes Virus-F 及Herpes Virus-R，步驟g的探針為單純皰疹病毒II型探針Herpes Virus 2-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為四，確認(rèn)樣品不含單純皰疹病毒II型； 該檢測(cè)結(jié)果與樣品已知的結(jié)果完全一致。實(shí)例3
已知樣品中含有登格熱病毒II型(DEN _2)，按本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟與實(shí)例1相同，熒光檢測(cè)值的結(jié)果如下
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為乙型腦炎病毒引物JEV-F及JEV-R， 步驟h的探針為乙型腦炎病毒探針JEV-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為479，確認(rèn)樣品中不含乙型腦炎病毒；
12當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒I型引物DEN I-F及 DEN 1-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN Ι-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為15，確認(rèn)樣品中不含登格熱病毒I型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒II型引物DEN 2-F及 DEN 2-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 2-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為744，確認(rèn)樣品中含有登格熱病毒II型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒III型引物DEN 3-F及 DEN 3-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 3-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為19，確認(rèn)樣品不含登格熱病毒III型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒IV型引物DEN 4-F及 DEN 4-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 4-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為1，確認(rèn)樣品不含登格熱病毒IV型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為腸道病毒EV71引物EV71-F及 EV71-R,步驟g的探針為登格熱病毒I型探針EV71-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為33，確認(rèn)樣品不含腸道病毒EV71 ；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為腺病毒引物ADV-F及ADV-R，步驟g 的探針為流感病毒B型探針ADV-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為23，確認(rèn)樣品不含腺病毒；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為單純皰疹病毒引物Herpes Virus-F 及Herpes Virus-R，步驟g的探針為單純皰疹病毒I型探針Herpes Virus 1-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為41，確認(rèn)樣品不含單純皰疹病毒I型；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為單純皰疹病毒引物Herpes Virus-F 及Herpes Virus-R，步驟g的探針為單純皰疹病毒II型探針Herpes Virus 2-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為14，確認(rèn)樣品不含單純皰疹病毒II型；
該檢測(cè)結(jié)果與樣品已知的結(jié)果完全一致。
實(shí)例 4:
已知樣品中含有登格熱病毒III型(DEN _3)，按本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟與實(shí)例1相同，熒光檢測(cè)值的結(jié)果如下
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為乙型腦炎病毒引物JEV-F及JEV-R， 步驟h的探針為乙型腦炎病毒探針JEV-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為212，確認(rèn)樣品中不含乙型腦炎病毒；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒I型引物DEN I-F及 DEN 1-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN Ι-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為22，確認(rèn)樣品中不含登格熱病毒I型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒II型引物DEN 2-F及 DEN 2-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 2-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為19，確認(rèn)樣品中不含登格熱病毒II型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒III型引物DEN 3-F及 DEN 3-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 3-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為619，確認(rèn)樣品中含有登格熱病毒III型；當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒IV型引物DEN 4-F及 DEN 4-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 4-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為33，確認(rèn)樣品不含登格熱病毒IV型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為腸道病毒EV71引物EV71-F及 EV71-R,步驟g的探針為登格熱病毒I型探針EV71-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為6，確認(rèn)樣品不含腸道病毒EV71 ；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為腺病毒引物ADV-F及ADV-R，步驟g 的探針為流感病毒B型探針ADV-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為11，確認(rèn)樣品不含腺病毒；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為單純皰疹病毒引物Herpes Virus-F 及Herpes Virus-R,步驟g的探針為單純皰疹病毒I型探針Herpes Virus 1-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為20，確認(rèn)樣品不含單純皰疹病毒I型；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為單純皰疹病毒引物Herpes Virus-F 及Herpes Virus-R，步驟g的探針為單純皰疹病毒II型探針Herpes Virus 2-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為32，確認(rèn)樣品不含單純皰疹病毒II型；
該檢測(cè)結(jié)果與樣品已知的結(jié)果完全一致。
實(shí)例 5
已知樣品中含有登格熱病毒IV型(DEN _4)，按本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟與實(shí)例1相同，熒光檢測(cè)值的結(jié)果如下
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為乙型腦炎病毒引物JEV-F及JEV-R， 步驟h的探針為乙型腦炎病毒探針JEV-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為465，確認(rèn)樣品中不含乙型腦炎病毒；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒I型引物DEN I-F及 DEN 1-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN Ι-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為124，確認(rèn)樣品中不含登格熱病毒I型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒II型引物DEN 2-F及 DEN 2-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 2-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為44，確認(rèn)樣品中不含登格熱病毒II型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒III型引物DEN 3-F及 DEN 3-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 3-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為19，確認(rèn)樣品中不含登格熱病毒III型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒IV型引物DEN 4-F及 DEN 4-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 4-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為933，確認(rèn)樣品中含有登格熱病毒IV型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為腸道病毒EV71引物EV71-F及 EV71-R,步驟g的探針為登格熱病毒I型探針EV71-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為91，確認(rèn)樣品不含腸道病毒EV71 ；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為腺病毒引物ADV-F及ADV-R，步驟g 的探針為流感病毒B型探針ADV-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為31，確認(rèn)樣品不含腺病毒；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為單純皰疹病毒引物Herpes Virus-F及Herpes Virus-R，步驟g的探針為單純皰疹病毒I型探針Herpes Virus 1-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為陽(yáng)，確認(rèn)樣品不含單純皰疹病毒I型；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為單純皰疹病毒引物Herpes Virus-F 及Herpes Virus-R，步驟g的探針為單純皰疹病毒II型探針Herpes Virus 2-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為42，確認(rèn)樣品不含單純皰疹病毒II型； 該檢測(cè)結(jié)果與樣品已知的結(jié)果完全一致。實(shí)例6
已知樣品中含有腸道病毒EV71型，按本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟與實(shí)例1相同，熒光檢測(cè)值的結(jié)果如下
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為乙型腦炎病毒引物JEV-F及JEV-R， 步驟h的探針為乙型腦炎病毒探針JEV-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為324，確認(rèn)樣品中不含乙型腦炎病毒；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒I型引物DEN I-F及 DEN 1-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN Ι-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為M，確認(rèn)樣品中不含登格熱病毒I型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒II型引物DEN 2-F及 DEN 2-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 2-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為74，確認(rèn)樣品中不含登格熱病毒II型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒III型引物DEN 3-F及 DEN 3-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 3-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為19，確認(rèn)樣品中不含登格熱病毒III型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒IV型引物DEN 4-F及 DEN 4-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 4-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為90，確認(rèn)樣品中不含登格熱病毒IV型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為腸道病毒EV71引物EV71-F及 EV71-R,步驟g的探針為登格熱病毒I型探針EV71-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為1901，確認(rèn)樣品中含有腸道病毒EV71 ；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為腺病毒引物ADV-F及ADV-R，步驟g 的探針為流感病毒B型探針ADV-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為3，確認(rèn)樣品不含腺病毒；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為單純皰疹病毒引物Herpes Virus-F 及Herpes Virus-R，步驟g的探針為單純皰疹病毒I型探針Herpes Virus 1-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為12，確認(rèn)樣品不含單純皰疹病毒I型；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為單純皰疹病毒引物Herpes Virus-F 及Herpes Virus-R，步驟g的探針為單純皰疹病毒II型探針Herpes Virus 2-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為40，確認(rèn)樣品不含單純皰疹病毒II型； 該檢測(cè)結(jié)果與樣品已知的結(jié)果完全一致。實(shí)例7
已知樣品中含有腺病毒(ADV)，按本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟與實(shí)例1相同，熒光檢測(cè)值的結(jié)果如下當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為乙型腦炎病毒引物JEV-F及JEV-R， 步驟h的探針為乙型腦炎病毒探針JEV-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為257，確認(rèn)樣品中不含乙型腦炎病毒；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒I型引物DEN I-F及 DEN 1-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN Ι-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為34，確認(rèn)樣品中不含登格熱病毒I型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒II型引物DEN 2-F及 DEN 2-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 2-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為45，確認(rèn)樣品中不含登格熱病毒II型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒III型引物DEN 3-F及 DEN 3-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 3-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為76，確認(rèn)樣品中不含登格熱病毒III型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒IV型引物DEN 4-F及 DEN 4-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 4-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為23，確認(rèn)樣品中不含登格熱病毒IV型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為腸道病毒EV71引物EV71-F及 EV71-R,步驟g的探針為登格熱病毒I型探針EV71-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為8，確認(rèn)樣品中不含腸道病毒EV71 ；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為腺病毒引物ADV-F及ADV-R，步驟g 的探針為流感病毒B型探針ADV-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為1090，確認(rèn)樣品中含有腺病毒； 當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為單純皰疹病毒引物Herpes Virus-F 及Herpes Virus-R，步驟g的探針為單純皰疹病毒I型探針Herpes Virus 1-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為51，確認(rèn)樣品不含單純皰疹病毒I型；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為單純皰疹病毒引物Herpes Virus-F 及Herpes Virus-R，步驟g的探針為單純皰疹病毒II型探針Herpes Virus 2-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為47，確認(rèn)樣品不含單純皰疹病毒II型；
該檢測(cè)結(jié)果與樣品已知的結(jié)果完全一致。
實(shí)例 8
已知樣品中含有單純皰疹病毒I型(Herpes Virus 1 )，按本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟與實(shí)例1相同，熒光檢測(cè)值的結(jié)果如下
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為乙型腦炎病毒引物JEV-F及JEV-R， 步驟h的探針為乙型腦炎病毒探針JEV-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為沈0，確認(rèn)樣品中不含乙型腦炎病毒；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒I型引物DEN I-F及 DEN 1-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN Ι-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為4，確認(rèn)樣品中不含登格熱病毒I型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒II型引物DEN 2-F及 DEN 2-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 2-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為38，確認(rèn)樣品中不含登格熱病毒II型；
16當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒III型引物DEN 3-F及 DEN 3-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 3-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為82，確認(rèn)樣品中不含登格熱病毒III型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒IV型引物DEN 4-F及 DEN 4-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 4-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為46，確認(rèn)樣品中不含登格熱病毒IV型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為腸道病毒EV71引物EV71-F及 EV71-R,步驟g的探針為登格熱病毒I型探針EV71-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為38，確認(rèn)樣品中不含腸道病毒EV71 ；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為腺病毒引物ADV-F及ADV-R，步驟g 的探針為流感病毒B型探針ADV-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為10，確認(rèn)樣品中不含腺病毒；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為單純皰疹病毒引物Herpes Virus-F 及Herpes Virus-R，步驟g的探針為單純皰疹病毒I型探針Herpes Virus 1-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為951，確認(rèn)樣品中含有單純皰疹病毒I型；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為單純皰疹病毒引物Herpes Virus-F 及Herpes Virus-R，步驟g的探針為單純皰疹病毒II型探針Herpes Virus 2-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為36，確認(rèn)樣品不含單純皰疹病毒II型；
該檢測(cè)結(jié)果與樣品已知的結(jié)果完全一致。
實(shí)例 9
已知樣品中含有單純皰疹病毒II型(Herpes Virus 2)，按本發(fā)明的方法進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟與實(shí)例1相同，熒光檢測(cè)值的結(jié)果如下
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為乙型腦炎病毒引物JEV-F及JEV-R， 步驟h的探針為乙型腦炎病毒探針JEV-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為109，確認(rèn)樣品中不含乙型腦炎病毒；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒I型引物DEN I-F及 DEN 1-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN Ι-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為沈，確認(rèn)樣品中不含登格熱病毒I型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒II型引物DEN 2-F及 DEN 2-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 2-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為61，確認(rèn)樣品中不含登格熱病毒II型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒III型引物DEN 3-F及 DEN 3-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 3-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為13，確認(rèn)樣品中不含登格熱病毒III型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為登格熱病毒IV型引物DEN 4-F及 DEN 4-R，步驟g的探針為登格熱病毒I型探針DEN 4-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為53，確認(rèn)樣品中不含登格熱病毒IV型；
當(dāng)步驟d第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為腸道病毒EV71引物EV71-F及 EV71-R,步驟g的探針為登格熱病毒I型探針EV71-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為38，確認(rèn)樣品中不含腸道病毒EV71 ；當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為腺病毒引物ADV-F及ADV-R，步驟g 的探針為流感病毒B型探針ADV-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為10，確認(rèn)樣品中不含腺病毒；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為單純皰疹病毒引物Herpes Virus-F 及Herpes Virus-R，步驟g的探針為單純皰疹病毒I型探針Herpes Virus 1-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為51，確認(rèn)樣品中不含單純皰疹病毒I型；
當(dāng)步驟b第一輪PCR引物F及第一輪PCR引物R為單純皰疹病毒引物Herpes Virus-F 及Herpes Virus-R，步驟g的探針為單純皰疹病毒II型探針Herpes Virus 2-probe時(shí)，熒光檢測(cè)值為2096，確認(rèn)樣品中含有單純皰疹病毒II型； 該檢測(cè)結(jié)果與樣品已知的結(jié)果完全一致。上述實(shí)施例中，因?yàn)橛行悠分锌赡芎幸环N以上的病原體，因此，即使已檢測(cè)到某一種病原體，還需要檢測(cè)其是否還含有其它種類的病原體。上述實(shí)施例中，所采用的試劑盒由MASA液相芯片制成。 序列表
<110>中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所
<120>用液相芯片檢測(cè)蟲媒或接觸傳播病原的引物和探針及方法
<140>
<141>
<160>1
<170>
<210>1
<211>40
<212>DNA
<213>用于檢測(cè)乙型腦炎病毒的引物JEV-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>1
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCCGAGAGAATTCAGGAGGTG <210>2 <211>39 <212>DNA
<213>用于檢測(cè)乙型腦炎病毒的引物JEV-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>2
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGCGAGCATGCGGTGTTCAC<210>3
<211>41
<212>DNA
<213>用于檢測(cè)登格熱病毒I型的引物DEN I-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>3
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCGTGCAATATGGTACATGTGG
<210>4
<211>42
<212>DNA
<213>用于檢測(cè)登格熱病毒I型的引物DEN I-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>4
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCATTCTGAAGATCATCCTCTG
<210>5
<211>39
<212>DNA
<213>用于檢測(cè)登格熱病毒II型的引物DEN 2-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>5
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTCGGCACGTGAGGCTGTTG <210>6 <211>40 <212>DNA
<213>用于檢測(cè)登格熱病毒II型的引物DEN 2-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>6TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCCACTCCGCTCAGAGAGTTC
<210>7
<211>41
<212>DNA
<213>用于檢測(cè)登格熱病毒III型的引物DEN 3-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>7
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGGCAGTAGAGCTATATGGTAC <210>8 <211>40 <212>DNA
<213>用于檢測(cè)登格熱病毒III型的引物DEN 3-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>8
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGTGTCCCAACCAGCTGTGTC
<210>9
<211>41
<212>DNA
<213>用于檢測(cè)登格熱病毒IV型的引物DEN 4-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>9
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTTAGGAGAGTTTGGCAGAGC <210>10 <211>41 <212>DNA
<213>用于檢測(cè)登格熱病毒IV型的引物DEN 4-R
<220>
<221>
<222>
<223><400>10
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTTCTTGTCTATCTCCTCCAGG <210>11 <211>40 <212>DNA
<213>用于檢測(cè)腸道病毒EV71的引物EV71-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>11
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGCAGCCCAAAAGAACTTCAC <210>12 <211>40 <212>DNA
<213>用于檢測(cè)腸道病毒EV71的引物EV71-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>12
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAACACAGCGTGTCTCAATCAT
<210>13
<211>40
<212>DNA
<213>用于檢測(cè)腺病毒的引物ADV-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>13
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGARTGGKCDTACATGCACATC
<210>14
<211>40
<212>DNA
<213>用于檢測(cè)腺病毒的引物ADV-R
<220>
<221>
<222>
21<223> <400>14
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCGRTCBGTGGTCACRTCGTG
<210>15
<211>42
<212>DNA
<213>用于檢測(cè)單純皰疹病毒I型和II型的引物Herpes Virus-F
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>15
CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGCTCGAGTGCGAAAAAACGTTC <210>16 <211>41 <212>DNA
<213>用于檢測(cè)單純皰疹病毒I型和II型的引物Herpes Virus-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>16
TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGCGGTTGATAAACGCGCAGT
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>用于檢測(cè)乙型腦炎病毒的JEV-probe探針
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>17
NH2- (CH2) 12CCAGCTATGTCACGGAGGAT <210>18 <211>22 <212>DNA
<213>用于檢測(cè)登格熱病毒I型的DEN Ι-probe探針
<220>
<221><222> <223> <400>18
NH2- (CH2) 12GGAATCTTTGATATGTCTCTGA
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>用于檢測(cè)登格熱病毒II型的DEN 2-probe探針
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>19
NH2- (CH2) 12GAACCAGTGATCTTCATTCAG <210>20 <211>19 <212>DNA
<213>用于檢測(cè)登格熱病毒III型的DEN 3-probe探針
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>20
NH2- (CH2) 12TCACGCGAGAACCAGTGGT <210>21 <211>20 <212>DNA
<213>用于檢測(cè)登格熱病毒IV型的DEN 4-probe探針
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>21
NH2- (CH2) 12CTCTGCCAAACCAGTGATCT <210>22 <211>20 <212>DNA
<213>用于檢測(cè)腸道病毒EV71的EV71-probe探針 <220><221> <222> <223> <400>22
NH2- (CH2) 12TCAGCAGCTTGGAGTGCTGG
<210>23
<211>19
<212>DNA
<213>用于檢測(cè)腺病毒的ADV-probe探針
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>23
NH2- (CH2) 12GCRCGGGCRAACTGCACCA
<210>24
<211>21
<212>DNA
<213>用于檢測(cè)單純皰疹病毒I型的Herpes Virus 1-probe探針
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>24
NH2- (CH2) 12CATCTTACCCCCGTAGATGAC
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>用于檢測(cè)單純皰疹病毒II型的Herpes Virus 2-probe探針
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>25
NH2- (CH2) 12CATCTTGCCCCCGCAGATGAC <210>26 <211>20 <212>DNA
<213>第二輪PCR反應(yīng)使用的通用引物Universal-F<220> <221> <222> <223> <400>26
TACAGTCGGTCGCGTGCCTC
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>第二輪PCR反應(yīng)使用的通用引物Universal-R
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>27
b iot in-CTGGTCCGTACTTCCGAGCG
2權(quán)利要求
1.一種用液相芯片檢測(cè)蟲媒或接觸傳播病原的引物，其特征是一種基于MASA液相芯片對(duì)臨床常見(jiàn)的蟲媒或接觸傳播的傳染病病原進(jìn)行檢測(cè)的引物，該引物是根據(jù)基因庫(kù)中能夠檢索到的目標(biāo)病毒所有的核苷酸序列分別進(jìn)行同源性分析和設(shè)計(jì)的，具體是(1)用于檢測(cè)乙型腦炎病毒的引物F、引物R的DNA序列 JEV-F CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCCGAGAGAATTCAGGAGGTG JEV-R TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGCGAGCATGCGGTGTTCAC(2)用于檢測(cè)登格熱病毒I型的引物F、引物R的DNA序列 DEN I-F :CTGGTCCGTACTTCCGAGCGCGTGCAATATGGTACATGTGG DEN I-R :TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTCATTCTGAAGATCATCCTCTG(3)用于檢測(cè)登格熱病毒II型的引物F、引物R的DNA序列 DEN 2-F :CTGGTCCGTACTTCCGAGCGTCGGCACGTGAGGCTGTTGDEN 2-R :TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCCACTCCGCTCAGAGAGTTC(4)用于檢測(cè)登格熱病毒III型的引物F、引物R的DNA序列 DEN 3-F :CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGGCAGTAGAGCTATATGGTAC DEN 3-R :TACAGTCGGTCGCGTGCCTCGTGTCCCAACCAGCTGTGTC(5)用于檢測(cè)登格熱病毒IV型的引物F、引物R的DNA序列 DEN 4-F :CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGTTAGGAGAGTTTGGCAGAGC DEN 4-R :TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTTCTTGTCTATCTCCTCCAGG(6)用于檢測(cè)腸道病毒EV71的引物F、引物R的DNA序列 EV71-F CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGCAGCCCAAAAGAACTTCAC EV71-R TACAGTCGGTCGCGTGCCTCAACACAGCGTGTCTCAATCAT(7)用于檢測(cè)腺病毒的引物F、引物R的DNA序列 ADV-F CTGGTCCGTACTTCCGAGCGARTGGKCDTACATGCACATC ADV-R TACAGTCGGTCGCGTGCCTCCGRTCBGTGGTCACRTCGTG(8)用于檢測(cè)單純皰疹病毒I型和II型的引物F、引物R的DNA序列相同，序列為 Herpes Virus-F CTGGTCCGTACTTCCGAGCGGCTCGAGTGCGAAAAAACGTTC Herpes Virus-R TACAGTCGGTCGCGTGCCTCTGCGGTTGATAAACGCGCAGT 。
2.一種用液相芯片檢測(cè)蟲媒或接觸傳播病原的探針，其特征是有9種探針，它們分別與權(quán)利要求1所述的8種引物對(duì)應(yīng)設(shè)計(jì)，所述探針的DNA序列為(1)用于檢測(cè)乙型腦炎病毒的JEV-probe探針的DNA序列 NH2- (CH2) 12 CCAGCTATGTCACGGAGGAT(2)用于檢測(cè)登格熱病毒I型的DENΙ-probe探針的DNA序列 NH2- (CH2) 12 GGAATCTTTGATATGTCTCTGA(3)用于檢測(cè)登格熱病毒II型的DEN2-probe探針的DNA序列 NH2- (CH2) 12GAACCAGTGATCTTCATTCAG(4)用于檢測(cè)登格熱病毒III型的DEN3-probe探針的DNA序列 NH2- (CH2) 12TCACGCGAGAACCAGTGGT(5)用于檢測(cè)登格熱病毒IV型的DEN4-probe探針的DNA序列 NH2- (CH2) 12CTCTGCCAAACCAGTGATCT(6)用于檢測(cè)腸道病毒EV71的EV71-probe探針的DNA序列 NH2- (CH2) 12TCAGCAGCTTGGAGTGCTGG(7)用于檢測(cè)腺病毒的ADV-probe探針的DNA序列 NH2- (CH2) 12GCRCGGGCRAACTGCACCA(8)用于檢測(cè)單純皰疹病毒I型的HerpesVirus 1-probe探針的DNA序列 NH2- (CH2) 12CATCTTACCCCCGTAGATGAC(9)用于檢測(cè)單純皰疹病毒II型的HerpesVirus 2-probe探針的DNA序列 NH2- (CH2) 12CATCTTGCCCCCGCAGATGAC。
3.一種用液相芯片檢測(cè)蟲媒或接觸傳播病原的方法，其特征是采用權(quán)利要求1所述的引物和權(quán)利要求2所述的探針，通過(guò)兩輪PCR反應(yīng)，分子雜交，再用LuminexlOO系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，從而確定樣本中所含病原體的種類。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于該方法按下列步驟順序進(jìn)行a.分別提取樣本中總DNA和RNA；b.第一輪PCR反應(yīng)先以步驟a中提取的樣本總DNA為模版，分別用腺病毒特異性PCR引物ADV-F和ADV-R、 單純皰疹病毒I型、單純皰疹病毒II型通用特異性PCR引物Herpes Virus-F和Herpes Virus-R進(jìn)行第一輪PCR,在PCR管中加入下列物質(zhì)10XPCR緩沖液2. 5uL、四種脫氧核糖核苷酸0. 5uL、濃度為 20umol/L PCR引物F 0. 25uL、濃度為 20umol/L PCR引物R 0. 25uL、Taq DNA聚合酶 0. 5uL、 DNA模板0. 5uL和超純水20. 5uL,將PCR管放入PCR儀中進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，所得的產(chǎn)物為第一輪PCR擴(kuò)增的目標(biāo)基因片段；c.第一輪RT-PCR反應(yīng)以步驟a中提取的樣本總RNA為模版，進(jìn)行一步法RT-PCR，所用引物分別為乙型腦炎病毒正向和反向引物JEV-F和JEV-R、登格熱病毒I型正向和反向引物DEN I-F和DEN 1-R、 登格熱病毒II型正向和反向引物DEN 2-F和DEN 2-R、登格熱病毒III型正向和反向引物 DEN 3-F和 DEN 3-R、登格熱病毒IV型正向和反向引物DEN 4-F和 DEN 4-R、腸道病毒EV71 型正向和反向引物EV71-F和EV71-R，在PCR管中加入下列物質(zhì)5XRT-PCR緩沖液5uL、四種脫氧核糖核苷酸luL、酶luL、 RNA酶抑制劑0. 5u L、濃度為20umol/L PCR引物F 0. 25uL、濃度為20umol/L PCR引物R 0. 25uL、RNA 模板 IuL,超純水 21uL,然后將PCR管放入PCR儀中進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到的產(chǎn)物為第一輪PCR擴(kuò)增的目標(biāo)基因片段；d.第二輪PCR反應(yīng)以含有第一輪PCR擴(kuò)增的目標(biāo)基因片段的溶液為模板進(jìn)行第二輪PCR， 在PCR管中加入下列物質(zhì)10XPCR緩沖液5uL、四種脫氧核糖核苷酸luL、濃度為 20umol/L 的通用引物 Universal-F luL、濃度為 20umol/L 的通用引物 Universal-R luL、Taq DNA聚合酶luL、第一輪PCR的產(chǎn)物2uL和超純水39uL ；然后將PCR管放入PCR儀中進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，得到第二輪PCR的產(chǎn)物為帶有生物素標(biāo)記的目標(biāo)基因溶液；e.雜交分別把特異性檢測(cè)探針以共價(jià)方式結(jié)合到給定顏色的微球上，用雜交緩沖液稀釋，使得每微升含有100個(gè)微球；所述雜交緩沖液為1. 5 X TMAC的氯化四甲銨，所述特異性檢測(cè)探針為權(quán)利要求2所述探針，然后將帶有生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物分別與結(jié)合了探針的微球在棕色容器中進(jìn)行雜交， 得到熒光標(biāo)記的目標(biāo)基因與探針結(jié)合的產(chǎn)物；f.檢測(cè)用LuminexlOO儀器分別讀取經(jīng)步驟e雜交后的9種微球上的目標(biāo)基因與探針結(jié)合的產(chǎn)物的熒光檢測(cè)值；然后根據(jù)熒光檢測(cè)值判定樣品中是否含探針對(duì)應(yīng)的病毒種類。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于第一輪PCR反應(yīng)條件為bl.94°C，5分鐘； b2. 94°C，30 秒；b3. 57 °C，30 秒；b4. 72 °C，30 秒；b5.重復(fù) 29 次步驟 b2 b4 ；b6. 72 °C，10 分鐘；b7.降溫至4°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于第一輪RT-PCR反應(yīng)，其反應(yīng)條件為 cl. 50 "C，30 分鐘；c2. 94 "C，15 分鐘；c3. 94 "C，30 秒；c4. 50 "C，30 秒；c5. 72 "C，30 秒； c6.重復(fù)29次步驟c3 c5 ；c7. 72°C，10分鐘；c8.降溫至4°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于第二輪PCR反應(yīng)的條件為dl.94°C，5分鐘；d2. 94°C，30 秒；d3. 60 °C，30 秒；d4. 72 °C，30 秒；d5.重復(fù) 29 次步驟 d2 d4 ； d6. 72°C，10分鐘；d7.降溫至4°C ；該P(yáng)CR反應(yīng)使用的通用引物序列為Universal-F TACAGTCGGTCGCGTGCCTCUniversal-R biotin-CTGGTCCGTACTTCCGAGCG.。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于采用以下方法進(jìn)行雜交雜交體系為50uL， 其中微球3!3uL，PCR產(chǎn)物5uL，加入TE補(bǔ)充體積至50uL ；96°C變性5min后，55°C雜交15min ； 加入親和素-藻紅蛋白55°C雜交5min。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于采用以下方法根據(jù)熒光檢測(cè)值判斷樣本中是否含探針對(duì)應(yīng)的病毒種類對(duì)登格熱病毒I型、登格熱病毒II型、登格熱病毒III型、登格熱病毒IV型、腸道病毒EV71型、腺病毒、單純皰疹病毒1型和單純皰疹病毒II型的檢測(cè)，當(dāng)微球上的探針與帶有生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物雜交后的熒光檢測(cè)值> 200，則樣品中含有該探針對(duì)應(yīng)的病毒種類；當(dāng)熒光檢測(cè)值< 100，則樣品中不含該探針對(duì)應(yīng)的病毒種類；當(dāng) 100《熒光檢測(cè)值<200時(shí)，不能確定樣品中是否含探針對(duì)應(yīng)的病毒種類。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于采用以下方法根據(jù)熒光檢測(cè)值判斷樣本中是否含探針對(duì)應(yīng)的病毒種類對(duì)乙型腦炎病毒病原體的檢測(cè)，當(dāng)微球上的探針與帶有生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物雜交后的熒光檢測(cè)值> 1000，則樣品中含有該探針對(duì)應(yīng)的病毒種類； 當(dāng)熒光檢測(cè)值< 500，則樣品中不含該探針對(duì)應(yīng)的病毒種類；當(dāng)500《熒光檢測(cè)值<1000 時(shí)，不能確定樣品中是否含探針對(duì)應(yīng)的病毒種類。
全文摘要
本發(fā)明是用液相芯片檢測(cè)蟲媒或接觸傳播病原的引物和探針及方法，其用于9種臨床常見(jiàn)的蟲媒或接觸傳播的傳染病病原的檢測(cè)。本發(fā)明基于MASA液相芯片技術(shù)對(duì)9種臨床常見(jiàn)的蟲媒或接觸傳播的傳染病病原進(jìn)行檢測(cè)，主要根據(jù)基因庫(kù)中能夠檢索到的9種目標(biāo)病毒所有的核苷酸序列分別進(jìn)行同源性分析，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物和特異性探針，通過(guò)兩輪PCR，分子雜交，再用Luminex100系統(tǒng)檢測(cè)，確定樣本中所含病原體的種類。本發(fā)明提供的對(duì)這9種臨床常見(jiàn)的蟲媒或接觸傳播的傳染病病原的檢測(cè)及早期診斷，對(duì)于采取正確的治療方案和及時(shí)的應(yīng)對(duì)措施以防止疾病的傳播至關(guān)重要。本發(fā)明具有檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單、敏感性高、特異性好和利于推廣應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102181532SQ20111006702
公開(kāi)日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月21日
發(fā)明者尹飛飛, 王華林, 胡志紅, 袁勤芬, 鄧菲 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所