專利名稱：與豬白細胞數(shù)相關(guān)的分子標(biāo)記及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于家畜分子標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種與豬白細胞數(shù)相關(guān)的分子標(biāo)記及應(yīng)用。本發(fā)明包括與豬白細胞數(shù)相關(guān)的SN基因變異位點的發(fā)現(xiàn)、檢測方法及其在豬標(biāo)記輔助選擇中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近10年以來，現(xiàn)代育種技術(shù)使豬的生產(chǎn)性能(生長，胴體與肉質(zhì)性狀)得到了顯著的改良，而對豬健康及抵抗疾病能力的遺傳改良卻重視不夠。疾病控制一直是畜牧業(yè)生產(chǎn)中的ー項重要環(huán)節(jié)，提高管理水平、改善衛(wèi)生環(huán)境、注射藥物和疫苗等預(yù)防性措施，在預(yù)防疾病發(fā)生中確實起了重要的作用。但它們都不能從根本上解決預(yù)防疾病這個難題，提高機體的自然抗病カ成了目前研究的重點，尤其是抗病育種。
豬繁通與呼吸綜合征(PorcineReproductive and Respiratory Syndrom, PRRS)是由PRRSV引起懷孕母豬發(fā)熱、厭食、早產(chǎn)、晩期流產(chǎn)、死胎、弱仔和木乃伊胎兒等繁殖障礙，以及仔豬的呼吸系統(tǒng)癥狀和高死亡率的接觸性傳染病(童光志等，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分離鑒定及其分子流行病學(xué)分析.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報.2007，29(5)323-327.)。自1987年該病首先在美國爆發(fā)以來，先后在加拿大、德國、法國、意大利、波蘭、丹麥、馬耳他等歐美國家。該病給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的損失，國際獸醫(yī)局(OIE)將該病列為B類傳染病。sialoadhesin(Sn)是豬繁通與呼吸綜合征病毒(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrom Virus, PRRSV)的兩個受體。目前已經(jīng)證明PRRSV的受體有4個Sn (Delputte P L 等，Analysis of porcine reproductive and respiratory syndromevirus attachment and internalization -distinctive roles for heparan sulphateand sialoadhesin. J Gen Virol,2005,86 (Pt 5) :1441-1445), HS(heparan sulphate)(Delputte P L 等，Involvement of the matrix protein in attachment of porcinereproductive and respiratory syndrome virus to a heparinlike receptor onporcine alveolar macrophages. 2002,J Virol,76 (9) :4312-4320)、CD151(ShanmukhappaK 等，Role of CD151, A tetraspanin, in porcine reproductive and respiratorysyndrome virus infection. Virol J, 2007,4 :62)和 CD163 分子(Calvert, J. G 等，CD163expression confers susceptibility to porcine reproductive and respiratorysyndrome viruses. J Virol, 2007,81 (14) :737 ト7379)。有囊膜的病毒通過病毒蛋白與細胞膜上的受體相互作用，激活細胞內(nèi)的信號通路，引起病毒粒子與細胞膜的融合，進入細胞，釋放病毒基因組，進而在宿主細胞內(nèi)大量繁殖，引起細胞裂解和死亡，釋放病毒粒子，完成感染過程。PRRSV首先與HS接觸,但并不發(fā)生病毒內(nèi)化,在Sn的參與下,病毒大量的吸附細胞，并發(fā)生內(nèi)化，進入宿主細胞。Sn是PRRSV的ー個重要受體，是I型糖基化跨膜蛋白，屬于Ig超家族中的ー員，是ー個具有17個結(jié)構(gòu)域的復(fù)雜蛋白，在病毒感染細胞的過程中介導(dǎo)病毒吸附和內(nèi)化。研究表明，Sn蛋白的單克隆抗體可以完全阻止PRRSV對細胞的感染。Sn蛋白N末端的結(jié)構(gòu)域在PRRSV吸附病毒肺巨卩遼細胞的過程中有重要作用(Delputte P L等,Porcine arterivirusattachment to the macrophage-specmc receptor sialoadhesin is dependent onthe sialic acid-binding activity of the N—terminal immunoglobulin domain ofsialoadhesin. J Virol. 2007,81(17) :9546-9550)。Tong-Qing An 等(2009)構(gòu)建了 SN 基因的一系列的突變體，發(fā)現(xiàn)只有Sn蛋白N末端的19-150位氨基酸對于PRRSV吸附PK-15細胞有決定作用，缺失這段區(qū)域的蛋白突變體不能介導(dǎo)病毒的吸附。Sn蛋白參與了病毒吸附細胞和內(nèi)化的過程，在病毒感染細胞過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，對于感染是必需的。研究該基因的變異位點在群體中的多態(tài)性，并與白細胞數(shù)進行關(guān)聯(lián)分析，為把這個基因做為豬白細胞數(shù)性狀候選基因?qū)ふ易C據(jù)，為分子育種提供素材。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)SN基因已知序列，尋找SN基因的變異位點以及基因多態(tài)性的檢測方法，獲得ー個與白細胞數(shù)相關(guān)的分子標(biāo)記。 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)從豬SN基因片段中克隆得到一種作為豬標(biāo)記輔助選擇的與豬白細胞數(shù)相關(guān)的分子標(biāo)記，它的核昔酸序列如序列表SEQ ID NO I和圖2所不。在SEQ ID NO I所不序列的第699位堿基處有ー個堿基突變(該等位基因的突變和堿基替換見圖2的699位所示)，即在圖4所示序列的第367位堿基處有ー個367G-367A的堿基突變，該突變位于第4外顯子內(nèi)，能夠引起氨基酸精氨酸到組氨酸的改變，導(dǎo)致Hin6I-RFLP多態(tài)性。擴增SN基因部分mRNA的引物對，其核苷酸序列如下所示SNcd3F 5' CTATGACTACTC AGGCAAGCG 3'SNcd3R 5' GGTGT CAGGCATCAG GCTC 3'擴增SN基因部分DNA序列的引物對，其核苷酸序列如下所示SNsnpF 5' CGGCTGCTGTAGCTCTGATTG 3'SNsnpR 5' GCCTTGGCCTGGTTTCCTTA 3'申請人:提供了一種篩選豬白細胞數(shù)的分子標(biāo)記的方法，按照以下步驟從NCBI數(shù)據(jù)庫中的獲取豬SN基因的mRNA信息，設(shè)計引物，擴增部分mRNA序列。分別提取“通城豬”和“長白豬”肺組織的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)設(shè)計的引物(SNm3F和SNcd3R)，分別擴増“通城豬”和“長白豬”肺組織SN基因的cDNA序列，克隆，測序。分析測序結(jié)果，在參照序列(Genebank登錄號DQ176853)的878位存在堿基G-A突變。NCBI數(shù)據(jù)庫中調(diào)取SN基因組DNA信息設(shè)計引物(SNsnpF和SNsnpR)，從豬血液中提取總DNA，PCR擴增，應(yīng)用PCR-RFLP的方法檢測該變異位點在群體中的多態(tài)性，并初步進行該突變位點與豬白細胞數(shù)性狀之間的關(guān)聯(lián)分析。本發(fā)明為豬的分子育種提供了新的分子標(biāo)記。依照本發(fā)明，所述的豬白細胞數(shù)相關(guān)分子標(biāo)記可應(yīng)用在豬標(biāo)記輔助選擇中。


序列表SEQ ID NO 1是本發(fā)明克隆的白細胞數(shù)相關(guān)SN基因的mRNA序列。
序列表SEQ ID NO :2_5是本發(fā)明所用引物對的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO 6是本發(fā)明克隆與白細胞數(shù)相關(guān)分子標(biāo)記的核苷酸序列。圖I :是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。圖2 :篩查SN基因SNPs的mRNA序列。在該序列的699bp處有ー個699G-699A的堿基替換(括號內(nèi)顯示該等位基因的替換)，導(dǎo)致Hin6I-RFLP多態(tài)性圖3 :篩查SN基因SNPs的測序峰圖(箭頭所指堿基為說明中的堿基突變?yōu)槲稽c)。其中圖3A是“通城豬”肺臟cDNA擴增產(chǎn)物的部分測序結(jié)果圖3B是“大白豬”肺臟cDNA擴增產(chǎn)物的部分測序結(jié)果。圖4 :本發(fā)明中豬SN基因用于PCR-RFLP檢測的DNA片段。所用的引物序列用下劃線標(biāo)注，突變位點用斜體字和括號標(biāo)出。 圖5 :是本發(fā)明中豬SN基因Hin6I-RFLP的三種基因型(GG AG AA)電泳結(jié)果。圖中DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000。
具體實施例方式實施例I、SN基因SNPs的篩選I. I引物設(shè)計根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中SN基因的mRNA信息(GenBank登錄號DQ176853)，在第2夕卜顯子和第7外顯子上設(shè)計ー對引物，用來擴增“通城豬”(中國地方豬品種血緣，湖北省通城縣地方品種商用品種，ー種公知公用的品種)和“長白豬”(引進的具有外國豬血緣的品種，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國家家畜工程中心從美國引進，ー個大規(guī)模推廣應(yīng)用的外國商用豬品種)SN基因的mRNA.設(shè)計的引物對的核苷酸序列如下所示SNcd3F 5' CTATGACTACTC AGGCAAGCG 3'，SNcd3R 5' GGTGT CAGGCATCAG GCTC 3'。1.2PCR 擴增PCR反應(yīng)總體積10 μ 1，其中含“通城豬“和”長白豬“肺組織RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA約lOOng，含I XPCRbuffer (購自寶生物工程大連有限公司)，dNTP終濃度為150ymol/L，引物終濃度為0·4μπιΟ1/1，0· 5U Taq DNA聚合酶(購自寶生物工程大連有限公司)。PCR擴增程序是94°C 4min，35X (94°C 30s，56°C 30s, 72°C lmin20s)，最后 72°C延伸5min. PCR反應(yīng)產(chǎn)物用I. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。得到1444bp特異擴增片段(見序列表 SEQ ID NO 1)οI. 3PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測序PCR產(chǎn)物的純化在紫外燈下從低熔點瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入I. 5ml Ependorff管中，于70°C溫育至凝膠完全融化，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購自北京原平皓生物技術(shù)有限公司)純化PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說明書操作。連接反應(yīng)將純化的PCR產(chǎn)物與載體pMD18-T (購自寶生物工程大連有限公司)連接，連接反應(yīng)總體積是5μ 1，其中包括2. 5μ I 2 X buffer, O. 5μ I的載體，2 μ I的純化PCR產(chǎn)物，滅菌水置4°C水浴過夜。感受態(tài)細胞的制備-J人37°C培養(yǎng)了 16 20h的新鮮平板上挑取ー個DH5 α單菌落接種于2ml LB中，于37°C振蕩培養(yǎng)3h，轉(zhuǎn)接Iml菌液于含有IOOml LB的試劑瓶中，繼續(xù)在37°C振蕩培養(yǎng)約4h，待0D600達到O. 3 O. 4時將試劑瓶從搖床取出置冰浴冷卻10 15min，然后將菌液轉(zhuǎn)入離心管中于4°C 4，OOOg離心IOmin以收集細胞，將離心管倒置以棄凈培養(yǎng)液，用IOml冰預(yù)冷的O. lmol/L的CaCl2重懸沉淀，冰浴30min,重復(fù)4°C 4，OOOg離心IOmin —次，用4ml冰預(yù)冷的O. lmol/L的CaCl2和甘油重懸沉淀，置4°C保存?zhèn)溆?。轉(zhuǎn)化無菌狀態(tài)下取100 120 μ I感受態(tài)細胞于I. 5ml Ependorff管中，將5 μ I的連接產(chǎn)物加入混勻，在冰上放置30min，42°C熱激90s，其間不要搖動Ependorff管，取出后冰浴3 4min，加入400 μ I無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)45min。取100 μ I涂布于已提前涂布氨芐青霉素(50yg/ml)的LB培養(yǎng)基瓊脂平板上，37°C平放Ih后倒置培養(yǎng)。I. 4單克隆的測序挑取平板上的單菌落，接種于Iml LB中，37°C 220r/min培養(yǎng)8h。取I μ I菌液PCR擴增驗證后，用雙脫氧末端終止法在DNA自動測序儀上對重組質(zhì)粒采進行測序，序列測定由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成。用DNASTAR軟件中的Seqman程序進行拼接和比對，發(fā) 現(xiàn)在序列的第699位為ー突變位點，(如圖2所示)。測序“通城豬”在該位點為Α，“長白豬”為G.。I. 5DNA序列同源性檢索鑒定通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI, National Center for BiotechnologyInformation, http://www. ncbi. nlm. nin. gov)網(wǎng) 占 StJ BLAST (Basic Local AlignmentSearch Tool)軟件,將測序后獲得的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的序列同源性比較，確認(rèn)測序得到的序列為SN基因mRNA序列的一部分。實施例2SN基因PCR-RFLP診斷方法的建立2. I引物序列設(shè)計了ー對包含第4外顯子的用于擴增豬SN基因組序列的引物對，檢測該變異位點在群體中的多態(tài)性。該引物對名稱和核苷酸序列如下所示SNsnpF 5' CGGCTGCTGTAGCTCTGATTG 3'SNsnpR 5' GCCTTGGCCTGGTTTCCTTA 3'2. 2PCR擴增條件PCR反應(yīng)總體積10 μ 1，其中豬基因組DNA約lOOng，含IXPCR buffer(購自寶生物工程大連有限公司)dNTP終濃度為150ymol/L，引物終濃度為0. 4ymol/L，0. 5U TaqDNA聚合酶(購自寶生物工程大連有限公司)。PCR擴增程序是94°C 3min，35X (94°C 30s，61°C 30s, 72 °C 25s)，最后72°C延伸5min. PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到530bp特異擴增片段(如圖4)，該片段中第367位堿基突變367G-367A可造成Hin6I (G/CGC)酶切位點的丟失。 2. 3PCR-RFLP 檢測條件PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體積是10 μ 1，其中IXbuffer I μ 1，PCR產(chǎn)物4 μ 1，限制性內(nèi)切酶Hin6I為0. I μ 1(2U)，用滅菌雙蒸水定容至10 μ 1，將樣品混勻后離心，37°C水浴8h，用2. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，記錄基因型，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照。當(dāng)?shù)?67bp位置是367A吋，Hin6I酶切位點不存在，Hin6I酶切后檢測結(jié)果只有I個片段，其長度是530bp (定為等位基因A)，但存在367A-367G的替換時，其結(jié)果導(dǎo)致Hin6I酶切位點的產(chǎn)生，得到2個片段，其長度分別為365bp和165bp (定為等位基因G)，三種基因型AA(530bp)，AG(530bp+365bp+165bp)，GG(365+165bp)如圖 5 所示。2. 4本發(fā)明的分子標(biāo)記在與豬免疫性狀關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用試驗共檢測了 145個豬個體中國地方豬“通城豬”純種26頭，引進給外國血緣的“大白豬”純種31頭，“長白豬”純種27頭，中國地方豬與外來豬的雜交豬“大長通”(大白豬X長白豬X通城豬)31頭和長大通(長白豬X大白豬X通城豬)30頭的多態(tài)，確定其基因型，并進行基因突變位點與紅細胞計數(shù)，白細胞數(shù)，血清中IgG含量的關(guān)聯(lián)分析。建立如下所述的最小ニ乘模型yuk = μ +Gi+Cj+B,+ ε ，其中，yuk是性狀觀察值，μ為總體均數(shù)，Gi為基因型效應(yīng)，Cj為品種效應(yīng)，Bk為批次效應(yīng)，為隨機誤差，假定相互獨立，服從Ν(0，σ2)分布?；蛐蜋z測結(jié)果表明在145個個體中AA基因型有47個個體，AG基因型有61個個體，GG基因型有37個個體?；蛲蛔兾稽c與性狀關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果是SN 基因在Hin6I-RFLP多態(tài)位點與血液中白細胞數(shù)量(WBC)含量顯著相關(guān)(P = O. 0492)，AA 基因型個體與GG基因型個體差異顯著(P < O. 05)(表I)，等位基因G與等位基因A在各個群體中的分布情況見表2，通過觀察可以看出在“通城豬”和“大白豬”中，A等位基因為優(yōu)勢等位基因，而在長白豬中，G等位基因為優(yōu)勢等位基因。表I. SN基因SNP與白細胞數(shù)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種與豬白細胞數(shù)相關(guān)的分子標(biāo)記，其核苷酸序列如下所示，CTATGACTACTCAGGCAAGCGCCTGGTAGTGAGCCACTCCAGGAACCCAAAGGTGGTGGAGAACCACTTCCAAGGCCGGGCCCTGCTGTTGGGGCAGGTTGAGCAGAGGACGTGCAGCCTGCTGCTGAAGGACCTGCAGCCCCAGGACTCGGGCTCCTATAACTTCCGCTTTGAGATCAGCGAGGGCAACCGCTGGTCAGATGTCAAAGGCACAGTTGTCACCGTGACAGAGGTGCCCAGCGTGCCCACCATTGCCTTGCCAGCCAAGCTGCATGAGGGCATGGAGGTGGACTTCAACTGCTCCACTCCCTATGTGTGCCCGACGGAGCCGGTCAACCTACAGTGGCAAGGCCAGGATCCCACCCGCTCCGTCACCTCCCACCTCCAGAAGCTTGAGCCCTCGGGCACCAGCCACATGGAGACCCTGCACATGGCCCTGTCCTGGCAGGACCATGGCCGGATCCTGAGCTGCCAGGTCTCAGCAGCCGAACGCAGGATGCAGAAGGAGATTCACCTCCAAGTGCAGTATGCCCCCAAGGGTGTGGAGATCCTTTTCAGCCACTCCGGACGGAACGTCCTTCCAGGTGATCTGGTCACCCTCAGCTGCCAGGTGAATAGCAGCAACCCTCAGGTCAGTTCCGTGCAGTGGGTCAAGGATGGGACGAAGCTCAAAGACCAGAAACGTGTACTTCAGTTGC(G/A)CCGGGCAGCCTGGGCTGATGCTGGCGTCTACACCTGCCAAGCCGGGAATGCCGTGGGCTCTTCAGTCTCACCCCCGGTCAGCCTCCACGTCTTCATGGCTGAGGTCCAGGTAAGCCCTGTGGGCTCCATCCTGGAGAACCAGACGGTGACGCTGGCCTGCAATACACCTAAGGAAGCGCCCAGCGAGCTGCGCTACAGCTGGTACAAGAACCACGCCCTGCTGGAGGGCTCTCACAGCCGCACCCTCCGGCTGCACTCAGTCACCAGGGCGGATTCGGGCTTCTACTTCTGCGAGGTGCAGAACGCCCGGGGCAGAGAGCGCTCTCCCCCTGTCAGCGTGGTGGTCAGCCACCCACCCCTCACCCCGGACCTAACTGCCTTCCTGGAGACACAGGCGGGGCTGGTGGGCATCCTCCAATGCTCTGTGGTCAGCGAGCCCCCAGCTACTCTGGTGTTGTCACACGGGGGCCTCATCTTGGCCTCTACCTCCGGGGAGGGTGACCACAGCCCACGCTTCAGTGTCGCCTCTGCCCCCAACTCCCTGCGCCTGGAGATTCAAGACCTGGGGCCAACAGACAGTGGGGAATACATGTGCTCAGCCAGCAGTTCTCTTGGGAATGCGTCCTCCACCCTGGACTTCCATGCCAATGCAGCCCGCCTCCTCATCAGCCCAGCAGCAGAGGTGGTGGAAGGGCAGGCGGTGACACTGAGCTGCAGGAGCAGCCTGAGCCTGATGCCTGACACC ； 在所述序列的699bp處有ー個699G-699A的堿基替換，導(dǎo)致Hin6I_RFLP多態(tài)性。
2.擴增SN基因部分mRNA的引物對，其核苷酸序列如下所示SNcd3F 5' CTATGACTACTC AGGCAAGCG 3',SNcd3R 5' GGTGT CAGGCATCAG GCTC 3'。
3.擴增SN基因片段的引物對，其核苷酸序列如下所示SNsnpF 5' CGGCTGCTGTAGCTCTGATTG 3'，SNsnpR 5' GCCTTGGCCTGGTTTCCTTA 3'。
4.權(quán)利要求I所述的分子標(biāo)記在豬白細胞數(shù)標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2或3所述的引物對在豬白細胞數(shù)標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于家畜分子標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種作為豬標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用的與豬白細胞計數(shù)相關(guān)的分子標(biāo)記及應(yīng)用。所述的分子標(biāo)記為SN基因的片段，其mRNA核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示。在該序列表的第699bp處存在一個等位基因突變，即如附圖4所示序列的第367位bp處存在一個367G-367A的突變，導(dǎo)致Hin6I-RFLP多態(tài)性。本發(fā)明還公開了擴增SN基因核苷酸序列所用的引物對及其多態(tài)性檢測方法，本發(fā)明還包括制備的分子標(biāo)記在豬白細胞數(shù)關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用，豬的標(biāo)記輔助選擇提供了新的分子標(biāo)記。
文檔編號C12Q1/68GK102676507SQ20111005601
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月8日
發(fā)明者劉榜, 彭中鎮(zhèn), 徐學(xué)文, 王鳳麗, 邱海芳 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)