專利名稱：一種瘤菌根真菌及其在促進(jìn)環(huán)草石斛生長中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種瘤菌根真菌及其在促進(jìn)環(huán)草石斛生長中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蘭科植物與其菌根真菌存在著密切關(guān)系，在自然狀態(tài)下蘭科植物種子萌發(fā)成原球莖(根狀莖)到第一片真葉長出階段都需要菌根真菌，甚至有些有葉幼苗的生長發(fā)育完全依賴或部分依賴菌根真菌，菌根真菌可為蘭科植物提供N源、C源和礦物質(zhì)。研究表明同種真菌可與多種蘭科植物共生，研究報(bào)道蘭科菌根真菌分泌B族維生素和赤霉素，對植物生長有影響。環(huán)草石斛(Dendrobium loddigesii Rolfe)為蘭科石斛屬多年生草本植物，為貴州地道藥材，是我國傳統(tǒng)名貴中藥。環(huán)草石斛生長緩慢，自然繁殖系數(shù)低，但需求量卻日益增多，雖然環(huán)草石斛組培已經(jīng)成功，但組培苗移栽成活率低且生長緩慢，這阻礙著環(huán)草石斛的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。目前未見用外源蘭科植物菌根真菌對環(huán)草石斛生長方面的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有環(huán)草石斛生長緩慢，繁殖系數(shù)低、成活率低的缺陷，提供一種瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株及其在促進(jìn)環(huán)草石斛生長中的應(yīng)用。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明利用蘭科植物與其內(nèi)生真菌專一性低的特點(diǎn)，用春蘭(JJymbidium georingii Rchb. f.)菌根真菌與環(huán)草石斛接種共生，篩選出促進(jìn)環(huán)草石斛組培苗生長的菌株，以期提高環(huán)草石斛組培苗移栽成活率和提高產(chǎn)量，為生產(chǎn)促進(jìn)環(huán)草石斛生長的微生物肥料打下基礎(chǔ)。本發(fā)明瘤菌根真菌Epulorhiza repens CGO!35菌株。將貴州春蘭( georingii Rchb. f.)的根洗凈，參照單菌絲團(tuán)分離法(專利號ZL200610051196. 2)，接種在PDA培養(yǎng)基上，純化，保存于4°C備用，培養(yǎng)后與環(huán)草石斛共生，經(jīng)系列生長指標(biāo)評價(jià)試驗(yàn)篩選獲得。該CG035菌株已保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，地址湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)生科院保藏中心；郵編430072)，其保藏編號是CCTCC NO. M 2010370， 保藏日期為2010年12月觀日，分類命名為瘤菌根真菌，拉丁文學(xué)名為劭WorAi擬 repens。上述瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株的生物學(xué)形態(tài)特征描述為在標(biāo)準(zhǔn)BDPDA培養(yǎng)基上生長，早期菌絲貼培養(yǎng)基生長，菌絲乳白色，蠟質(zhì)，菌落邊緣整齊，厚度均勻，菌落邊緣侵入培養(yǎng)基生長，后期產(chǎn)生稀疏白色蛛網(wǎng)狀氣生菌絲，菌絲生長速度0. 088mm/ h,菌絲直徑2. 27 5. 37 μ m,細(xì)胞長13. 05 98. 65 μ m,念珠狀細(xì)胞球形，常形成長鏈，大小6. 17 18. 25X7. 47 16. 35 μ m，菌絲有隔，細(xì)胞核為雙核，菌絲隔為桶孔隔膜，桶孔覆墊無穿孔，弧形。
前述瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1。前述瘤菌根真菌Epulorhiza repens CGO!35 菌株 CCTCC NO. M2010370 在促進(jìn)環(huán)草石斛生長中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株CCTCC NO. M2010370與環(huán)草石斛共生培養(yǎng)的方法將在PDA培養(yǎng)基上活化的瘤菌根真菌 Epulorhiza repens CG035菌株用孔徑為5. Omm的打孔器打取菌片，接種在共生培養(yǎng)基上， 培養(yǎng)15天，在無菌條件下將3 4葉組培苗接入共生培養(yǎng)基中，自然條件下的溫度和光照培養(yǎng)。上述方法中所述的共生培養(yǎng)基是由蛭石、鋸木屑和苔鮮組成，其體積比為1:1:1。前述共生培養(yǎng)基在121°C滅菌1小時，1天后同樣方法再滅菌一次。上述技術(shù)方案中的瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株CCTCC NO. M2010370的微生物學(xué)特征如下
1、形態(tài)特征在標(biāo)準(zhǔn)BDPDA培養(yǎng)基上生長，早期菌絲貼培養(yǎng)基生長，菌絲乳白色，蠟質(zhì)， 菌落邊緣整齊，厚度均勻，菌落邊緣侵入培養(yǎng)基生長，后期產(chǎn)生稀疏白色蛛網(wǎng)狀氣生菌絲， 菌絲生長速度0. 088mm/h,菌絲直徑2. 27 5. 37 μ m,細(xì)胞長13. 05 98. 65 μ m,念珠狀細(xì)胞球形，常形成長鏈，大小6. 17 18. 25 X 7. 47 16. 35 μ m，菌絲有隔，細(xì)胞核為雙核，菌絲隔為桶孔隔膜，桶孔覆墊無穿孔，弧形。2、生理生化特征纖維素酶活陽性，多酚氧化酶活陰性。3、菌絲體所含物質(zhì)菌絲體含有B族維生素和赤霉素。具有上述特征的菌株，參照(Currah R. S. et al.，1997)等資料，綜合生理生化特征，ITS序列結(jié)果，鑒定為瘤菌根真菌(^OThrAiza repens),命名為CG035。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明是一種新的瘤菌根真菌，鑒定為CG035菌株，保藏編號為 CCTCC N0.M2010370，發(fā)明人對其促進(jìn)環(huán)草石斛生長的作用進(jìn)行了驗(yàn)證
1、瘤菌根真菌^oWorAiza repens CG035菌株的分離
將貴州春蘭的根洗凈，參照單菌絲團(tuán)分離法(專利號ZL200610051196. 2)，接種在PDA 培養(yǎng)基上，純化，得瘤菌根真菌處WorAiza repens CG035菌株，保存于4°C備用。2、將在PDA培養(yǎng)基上活化的CG035菌株用孔徑為5. Omm的打孔器打取菌片， 接種在共生培養(yǎng)基質(zhì)(蛭石鋸木屑苔鮮的體積比為1 :1 :1，在121°C滅菌1小時，1天后同樣方法再滅菌一次)上，培養(yǎng)15天，在無菌條件下將3 4葉的組培苗接入共生培養(yǎng)基中，每瓶接種3顆苗，簇?fù)?，重?fù)5瓶，每瓶苗根數(shù)、莖長、莖粗細(xì)大致一致。自然條件下的溫度和光照，培養(yǎng)80天。3、環(huán)草石斛組培苗的生長和重量測定
接種前，在無菌情況下洗去祖培苗上的瓊脂，再用濾紙吸干表面水分，用電子天平準(zhǔn)確稱量環(huán)草石斛組培苗的重量，并記錄根的數(shù)量和長度，莖高和莖寬。培養(yǎng)80天后，將苗從組培瓶(罐頭瓶)中取出，小心洗去培養(yǎng)基及附著于根上的菌絲，用濾紙吸干表面水分，稱重， 與接種真菌前的苗重、苗高、根數(shù)、根長、莖粗相減即得苗重、苗高、根數(shù)、根長、莖粗增加；利用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果如表1所示。表1共培養(yǎng)80天瘤菌根真菌處WorAiza repens CG035菌株對環(huán)草石斛生長效應(yīng)
權(quán)利要求
1.瘤菌根真菌^OThrAizarepens CG035菌株，其保藏編號為CCTCC NO. M2010370。
2.按照權(quán)利要求1所述瘤菌根真菌Epulorhizarepens CG035菌株CCTCC N0.M2010370，其特征在于生物學(xué)形態(tài)特征描述為在標(biāo)準(zhǔn)BDPDA培養(yǎng)基上生長，早期菌絲貼培養(yǎng)基生長，菌絲乳白色，蠟質(zhì)，菌落邊緣整齊，厚度均勻，菌落邊緣侵入培養(yǎng)基生長， 后期產(chǎn)生稀疏白色蛛網(wǎng)狀氣生菌絲，菌絲生長速度0. 088mm/h，菌絲直徑2. 27 5. 37 μ m, 細(xì)胞長13. 05 98. 65 μ m,念珠狀細(xì)胞球形，常形成長鏈，大小6. 17 18. 25X7. 47 16. 35 μ m,菌絲有隔，細(xì)胞核為雙核，菌絲隔為桶孔隔膜，桶孔覆墊無穿孔，弧形。
3.按照權(quán)利要求1所述瘤菌根真菌Epulorhizarepens CG035菌株CCTCC NO. M2010370，其核苷酸序列如 SEQ ID NO :1。
4.瘤菌根真菌Epulorhizarepens CGO；35菌株CCTCC NO. M2010370在促進(jìn)環(huán)草石斛生長中的應(yīng)用。
5.瘤菌根真菌Epulorhizarepens CGOIB5菌株CCTCC NO. M2010370與環(huán)草石斛共生培養(yǎng)的方法，其特征在于將在PDA培養(yǎng)基上活化的瘤菌根真菌處WorAiza repens CG035 菌株用孔徑為5. Omm的打孔器打取菌片，接種在共生培養(yǎng)基上，培養(yǎng)15天，在無菌條件下將 3 4葉組培苗接入共生培養(yǎng)基中，自然條件下的溫度和光照培養(yǎng)。
6.按照權(quán)利要求5所述瘤菌根真菌Epulorhizarepens CG035菌株CCTCC NO. M2010370與環(huán)草石斛共生培養(yǎng)的方法，其特征在于所述共生培養(yǎng)基是由蛭石、鋸木屑和苔鮮組成，其體積比為1:1:1。
7.按照權(quán)利要求6所述瘤菌根真菌Epulorhizarepens CG035菌株CCTCC NO. M2010370與環(huán)草石斛共生培養(yǎng)的方法，其特征在于所述的共生培養(yǎng)基在121°C滅菌1 小時，1天后同樣方法再滅菌一次。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種瘤菌根真菌EpulorhizarepensCG035菌株及其在促進(jìn)環(huán)草石斛生長中的應(yīng)用，CG035菌株的保藏編號為CCTCC NO.M2010370，可用于與環(huán)草石斛共生培養(yǎng)以促進(jìn)環(huán)草石斛的生長。
文檔編號C12N1/14GK102154122SQ20111002307
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月21日
發(fā)明者劉作易, 朱國勝, 桂陽 申請人:貴州省果樹科學(xué)研究所