產(chǎn)生促進(jìn)富磷環(huán)境中菌根真菌的萌發(fā)和植物根部定殖的信號的協(xié)同微生物和營養(yǎng)素的應(yīng)用
【專利說明】產(chǎn)生巧進(jìn)富磯環(huán)境中菌根真菌的萌發(fā)和植物根部定殖的信 號的協(xié)同微生物和營養(yǎng)轟的應(yīng)用
[0001]相關(guān)申請的香叉引用
[0002] 本申請要求于2013年3月15日提交的美國非臨時專利申請第_號的 權(quán)益，其要求于2012年4月20日提交的美國臨時專利申請第61/687, 210號的權(quán)益，并是 其非臨時申請；在此將上述兩項(xiàng)專利申請的公開內(nèi)容均全文并入作為參考。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明設(shè)及將協(xié)同微生物組合起來，W產(chǎn)生對于促進(jìn)菌根真菌萌發(fā)和植物 根部定殖所必需的信號。通過菌根真菌的植物根部定殖導(dǎo)致植物對營養(yǎng)素的利用 (availability)、病原體的控制增加^及±壤結(jié)構(gòu)和/或±壤質(zhì)量改善。具體地，本發(fā)明 的示例性實(shí)施方式設(shè)及將植酸鹽作為營養(yǎng)素來源與綠色木霉（TrichodermaVirens)、解淀 粉芽抱桿菌炬acillusamyloliquefaciens)和包括W下已知物種；根內(nèi)球囊霉（Glomus intraradices)、幼套球囊霉（Glomusetunicatum)、聚叢球囊霉（Glomusaggregatum)、摩 西球囊霉（Glomusmosseae)的菌根真菌的組合結(jié)合起來，目的在于取代、加倍或提高標(biāo)準(zhǔn) 的含磯肥料化合物例如10-34-0、9-18-9、3-18-18肥料或其他NPK肥料組合的效果。
【背景技術(shù)】
[0004] 植酸[當(dāng)為鹽的形式時稱作六磯酸肌醇（inositolhexakis地OS地ate,IP6)或植 酸鹽]是磯在許多植物組織特別是慷和種子中的主要存貶形式。植酸鹽也是有機(jī)磯在上壤 剖面內(nèi)的主要形式，通常構(gòu)成±壤有機(jī)磯的20% -50%。
[0005] 木霉屬（Trichoderma)是含有大約20個物種的真菌屬。屬名稱的同義詞包括 Aleurisma和 Sporoderma。綠色木霉（Trichoderma virens)也稱作綠粘靑霉（Gliocladium Virens),是該屬的成員。該些真菌的天然生境包括±壤和植物材料。屬成員哈茨木霉 (Trichoderma harzianum)K化-AG2(ATCC 20847)也稱作菌株T-22,被用作生物控制劑，其 作為種子或±壤處理劑應(yīng)用，或應(yīng)用于桿插和移植。物種綠色木霉的菌株也已經(jīng)用于植物 立枯病的控制。例如，綠色木霉（綠粘靑霉）G^21是已知的，并化合理的價格市售，W商標(biāo) SoilGuard惠)12G銷售巧PA注冊號；70051-3和EPA編制號；067250-比-001)。它由 Iliermo Trilogy Co;rporation of Columbia, MD制造。其他已知的市售綠色木霉菌株包括W下ATCC 檢索號的菌株；10043、10044、10045、13213、13362、204067、204443、204444、204445、20903、 20904、20906、24290、42955、44327、44734、48179、52045、52199、58676、58677、58678、 62399、64271、74180、9645、MYA-297、MYA-298、MYA-649 和 MYA-650。
[0006] 芽抱桿菌炬acillus)是椿狀的革蘭氏陽性需氧或（一些條件下）厭氧的細(xì)菌屬。 芽抱桿菌物種在±壤和水中得W廣泛發(fā)現(xiàn)，一些已經(jīng)用于控制包括根腐病的植物疾病。解 淀粉芽抱桿菌炬acillusamyloliquefaciens)是該屬中形成抱子的成員。解淀粉芽抱桿 菌L.L.Campbell菌株F(ATCC23350)是該物種的模式菌株。其他已知的市售解淀粉芽抱 桿菌菌株包括W下ATCC檢索號的菌株；23842、23843、23844、23845、31592、49763、53495和 BAA-390(Int. J. Sys. Bacteriol. 37:69-71, 1987 ;J. Bacteriol. 94:1124-1130, 1967)。
[0007] 在過去，在正式改名W確認(rèn)該微生物是新的物種之前，解淀粉芽抱桿菌 也被也被一些研究者稱作解淀粉枯草芽抱桿菌變種炬acillussubtilisvar. amyloliquefaciens)。解淀粉枯草芽抱桿菌變種產(chǎn)生的蛋白酶通常用作生肉產(chǎn)品的嫩化 劑。根據(jù)美國環(huán)境保護(hù)署巧PA)，解淀粉枯草芽抱桿菌變種的菌株FZB24是天然微生物，并 廣泛分布于環(huán)境中。解淀粉枯草芽抱桿菌變種FZB24(EPA注冊號；72098-5,EPA編制號； 73386-D抓-001)是已知的，并W合理的價格市售，由Brookfield,WI的Novozymes,Inc.W 商標(biāo)Taegro⑥銷售。
[0008] 叢枝菌根真菌是其中真菌穿透維管植物根部皮層細(xì)胞的菌根類型。叢枝菌根真菌 有助于植物從±壤中捕獲營養(yǎng)素，例如磯、硫、氮和微量營養(yǎng)素。據(jù)信叢枝菌根共生的發(fā)展 在植物在±地上的最初定殖中W及在維管植物的進(jìn)化中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
[0009] 叢枝菌根真菌在根部定殖之前的發(fā)展稱作前共生（presymbiosis)，其包括=個階 段；繁殖體萌發(fā)、菌絲生長W及宿主識別和附著胞形成。繁殖體是厚壁的多核休眠結(jié)構(gòu)。給 予適當(dāng)?shù)摹廊阑|(zhì)條件、溫度、二氧化碳濃度、pH和磯濃度，叢枝菌根真菌繁殖體可W萌發(fā)。 繁殖體的萌發(fā)被認(rèn)為不處于植物的直接控制之下，因?yàn)樵隗w外和在±壤中均在不存在植物 的情況下在實(shí)驗(yàn)條件下萌發(fā)出繁殖體。但是，繁殖體萌發(fā)的速度可W通過植物宿主根部滲 出物得W增加。
[0010] 叢枝菌根菌絲通過±壤的生長受宿主根部滲出物和±壤磯濃度控制。叢枝菌根真 菌定殖在營養(yǎng)素貧瘡的±壤中較高，并隨著磯肥的加入而降低。低的±壤磯濃度增加菌絲 生長和分枝，W及誘導(dǎo)植物分泌控制菌絲分枝強(qiáng)度的化合物的滲出物。叢枝菌根真菌還具 有趨藥性能力，其能夠使菌絲朝著潛在宿主植物的根部生長。
[0011] 菌根學(xué)（mycorrhizologist)的主要挑戰(zhàn)在于理解極度和諧的叢枝菌根真菌宿主 信號傳導(dǎo)機(jī)制和定殖過程。該種和諧共生關(guān)系反映于真菌的專性活體營養(yǎng)性質(zhì)，其不能在 不存在宿主的情況下培養(yǎng)。盡管在實(shí)現(xiàn)與無菌±壤中生長的作物植物的有效菌根結(jié)合方面 已經(jīng)取得成功，當(dāng)其可W可靠地用于提高未熏制（nonfumigated) ±壤中生長的作物的性 能時，泡囊叢枝菌根（VAM)真菌用于農(nóng)業(yè)用途的最終成功將會實(shí)現(xiàn)。
[0012] 本發(fā)明提供W非常出人意料的方式提供產(chǎn)生繁殖體萌發(fā)和隨后的菌根根部定殖 的信號。早已知曉，種子W植酸鹽（IP6)存貶磯，并且萌發(fā)種子產(chǎn)生將植酸鹽分解成植物可 利用的形式的植酸酶，W便為幼苗提供營養(yǎng)素。也已經(jīng)知曉，植酸鹽（六磯的分子）被植酸 酶分解釋放出=摩爾無機(jī)磯（正磯酸鹽）和=磯酸肌醇（IP3)。植物需要無機(jī)形式的磯， 主要是正磯酸鹽，W將營養(yǎng)素吸收至根部。當(dāng)其不具有分解植酸鹽的有效方法時，植物利 用非常少的有機(jī)磯。=磯酸肌醇（IP3)被稱作第二信使，其可W促進(jìn)有機(jī)體之間的通訊和 /或響應(yīng)。通過用解淀粉芽抱桿菌植酸酶水解植酸鹽發(fā)生的肌醇的釋放對于植物-微生物 相互作用，特別是植物和固N(yùn)細(xì)菌之間的相互作用具有影響。負(fù)責(zé)菌根萌發(fā)和隨后菌根真 菌的植物根部定殖的信號是未知的。此外，沒有文獻(xiàn)表明IP3信號與菌根真菌響應(yīng)、繁殖體 萌發(fā)或根部定殖之間有任何關(guān)聯(lián)。事實(shí)上，眾所周知，菌根根部定殖可W在低磯±壤條件下 實(shí)現(xiàn)，但在高磯±壤條件下或高磯根際環(huán)境中，產(chǎn)生菌根萌發(fā)和根部定殖是極為困難的。因 此，事實(shí)還在于文獻(xiàn)的教導(dǎo)背離了W下觀點(diǎn)：即，使用植酸酶還原植酸鹽并在根際釋放植物 易于利用的磯，該會產(chǎn)生促進(jìn)菌根真菌的萌發(fā)和隨后的植物根部定殖的信號。
[0013] 由于已知菌根繁殖體的萌發(fā)可W在不存在植物根部的情況下發(fā)生；然而當(dāng)存在根 部時繁殖體萌發(fā)更有可能，本發(fā)明其他研究可能會產(chǎn)生雙重及可能多重的信號機(jī)制。該揭 示了未知的信號響應(yīng)。
[0014]
【背景技術(shù)】W美國專利第 4, 476, 881 ;4, 489, 161 ;4, 642, 131 ;4, 668, 512 ; 4, 678, 669 ;4, 713, 342 ;4, 724, 147 ;4, 748, 021 ;4, 818, 530 ;4, 828, 600 ;4, 877, 738 ; 4, 915, 944 ;4, 952, 229 ;5, 047, 239 ;5, 049, 379 ;5, 071，462 ;5, 068, 105 ;5, 084, 272 ; 5, 194, 258 ;5, 238, 690 ;5, 260, 213 ;5, 266, 316 ;5, 273, 749 ;5, 300, 127 ;5, 344, 647 ; 5, 401，655 ;5, 422, 107 ;5, 455, 028 ;5, 409, 509 ;5, 552, 138 ;5, 589, 381 ;5, 614, 188 ; 5, 628, 144 ;5, 632, 987 ;5, 645, 831 ;5, 665, 354 ;5, 667, 779 ;5, 695, 982 ;5, 702, 701 ; 5, 753, 222 ;5, 852, 054 ;5, 869, 042 ;5, 882, 641 ;5, 882, 915 ;5, 906, 818 ;5, 916, 029 ; 5, 919, 447 ;5, 922, 603 ;5, 972, 689 ;5, 974, 734 ;5, 994, 117 ;5, 998, 196 ;6, 015, 553 ; 6, 017, 525 ;6, 030, 610 ;6, 033, 659 ;6, 060, 051 ;6, 103, 228 ;和 7, 339, 091 號為特征；在此 將上述專利的公開內(nèi)容全文并入作為參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明的一個方面在于增加富磯環(huán)境中菌根真菌與宿主植物根部的有效結(jié)合。本 發(fā)明的另一方面在于通過信號分子觸發(fā)的菌根繁殖體的萌發(fā)和隨后的根部定殖。本發(fā)明的 再另一方面在于IP3信號分子的存在。本發(fā)明的再另一方面在于由于化yC基因的存在，產(chǎn) 生植酸酶的細(xì)菌在高磯環(huán)境中的用途。本發(fā)明的再另一方面在于微生物組分木霉屬真菌的 用途，上述真菌產(chǎn)生可W破壞穩(wěn)定化合物例如磯酸S巧上的鍵并釋放化++離子的磯酸酶。
[0016] 如本文所用，除非在使用該些術(shù)語的上下文明確指出不同的含義時，W下術(shù)語及 其變化方式具有下述含義：
[0017] 除非上下文另外指出其用處，本文所用的"一種"、"一"和"該及類似指示對象 應(yīng)當(dāng)理解成涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)。
[0018] "大約"是指在所陳述參數(shù)或測量結(jié)果的1 %內(nèi)，優(yōu)選在該些參數(shù)或測量結(jié)果的 0. 1% 內(nèi)。
[0019] "包括"及該術(shù)語的變化形式，例如"包括有"和"包含"無意于排除其他的添加劑、 組分、整數(shù)或步驟。
[0020] "E"是指"乘W10的幕"。
[0021] "示例性"、"示范性"和"優(yōu)選的"是指"另一"。
[0022] 本發(fā)明的示例性實(shí)施方式包括主要營養(yǎng)素、微量營養(yǎng)素、真菌和細(xì)菌的組合，其W 與可比較于或優(yōu)于應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)肥料化學(xué)的方式增加植物的產(chǎn)量。
[0023] 在使用中，本發(fā)明的示例性實(shí)施方式產(chǎn)生協(xié)同作用，該協(xié)同作用在適當(dāng)類型和適 當(dāng)比例的營養(yǎng)素、真菌和細(xì)菌W對植物提供增加植物產(chǎn)量或種子產(chǎn)量的可利用營養(yǎng)素的方 式放在一起時發(fā)生。
[0024] 本發(fā)明的一示例性實(shí)施方式包括；多種營養(yǎng)素（其可W是或者不是植物可利用 的），其在種子、植物或根的存在下與多種真菌、多種細(xì)菌組合。
[0025] 本發(fā)明的一示例性實(shí)施方式是包括如下步驟的方法；W在組分之間產(chǎn)生協(xié)同作用 的方式產(chǎn)生由營養(yǎng)素、真菌和細(xì)菌組成的混合物；將混合物應(yīng)用于種子或者將混合物應(yīng)用 于與種子接觸或靠近種子的帶化and)中或者±壤混合物中，其中所述真菌和所述細(xì)菌將 所述營養(yǎng)素還原成植物可利用的形式，從而使菌根真菌在植物可利用的營養(yǎng)素的存在下定 殖于根部，并增加植物產(chǎn)量或種子產(chǎn)量。
[0026] 在一示例性實(shí)施方式中，本發(fā)明是一種物質(zhì)組合物，其包括；植酸鹽和多種微生物 的組合，上述微生物包括綠色木霉真菌或其他巧溶解真菌或可溶性巧組分、解淀粉芽抱桿 菌細(xì)菌或其他產(chǎn)生植酸酶的細(xì)菌或植酸酶W及菌根真菌或多種菌根真菌，將其W使得物質(zhì) 組合物中的所述多種微生物定殖于所述植物根部的方式置于植物根部附近。
[0027] 在另一示例性實(shí)施方式中，本發(fā)明是一種增加植物產(chǎn)量的方法，其包括：將植酸鹽 和多種微生物的組合W使得所述微生物定殖到植物根部的方式置于所述植物根部附近，上 述微生物包括綠色木霉真菌或其他巧溶解真菌或可溶性巧組分、解淀粉芽抱