一種錐栗優(yōu)勢共生菌根菌的人工培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于菌根菌人工培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種錐栗菌根菌人工培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 外生菌根（Ectomycorrhizalfungi,ECMF)是由植物營養(yǎng)根系與土壤真菌共生形 成的，自然界中普遍存在。外生菌根真菌可以擴大宿主植物根系的吸收營養(yǎng)物質(zhì)的面積，產(chǎn) 生多種有機酸、酶、抗生素等物質(zhì)，加速生態(tài)系統(tǒng)中有機物和氮、磷、鉀、鈣、鎂等的無機物循 環(huán)，改善植土壤營養(yǎng)狀況，促進宿主植物生長，同時對根部土傳病害有拮抗作用，能增強植 物的抗逆性。外生菌根真菌影響宿主植物根際的微生物組成和數(shù)量，在建設(shè)苗圃、引進樹種 中應(yīng)用外生菌根真菌可以提高成活率，外生菌根真菌在干旱地及撂荒地等氣候條件惡劣的 地區(qū)造林作用更加明顯。外生菌根真菌侵染宿主植物根系后，一方面形成哈蒂氏網(wǎng)和菌套， 另一方面菌絲向外延伸形成致密的菌絲網(wǎng)，甚至形成菌索。由于多數(shù)外生菌根真菌對寄主 不具有嚴格的專一性，外延菌絲伸展過程中接觸到其它可與其共生的寄主植物的根系后也 可再度侵染，形成根間的菌絲橋。菌絲橋的建立使不同植株之間形成了源庫關(guān)系，使植物 間可傳遞N、P、K和水分等物質(zhì)，從而使受體植物的營養(yǎng)狀況得到改善。
[0003] 錐栗根系與外生菌根菌存在共生關(guān)系。在錐栗栗園林下，可以看到不同形狀和顏 色的錐栗菌根菌的子實體，如馬勃、餓膏菌、牛肝菌、紅菇和雞樅菌等。
[0004] 外生菌根真菌對錐栗的正常生長具有極其重要的作用，能提高錐栗根系對土壤中 水分和養(yǎng)分的吸收能力。錐栗多生長在山區(qū)，在土壤貧瘩的錐栗園，土壤養(yǎng)分含量低，施肥 困難。因此，山區(qū)的錐栗常因著生位置、株齡不同表現(xiàn)出植株營養(yǎng)狀況和生長勢很大差別。 在錐栗常規(guī)嫁接育苗中，由于苗床或培養(yǎng)基中缺乏能與錐栗根系共生的菌根菌，所以，移栽 到大田的常規(guī)嫁接苗，成活率低，生長發(fā)育遲緩。然而，錐栗根系與外生菌根菌的共生關(guān)系 十分復(fù)雜，許多菌根真菌的分離培養(yǎng)比較困難，錐栗菌根化研究還未有報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在提供一種錐栗菌根菌人工培養(yǎng)方法，培養(yǎng)得到與錐栗根系有良好共生 關(guān)系的錐栗菌根菌。
[0006] 本發(fā)明所述錐栗又名珍珠栗，拉丁名為Castaneahenryi(Skam)Rehd.etWils.， 殼斗科栗屬，落葉喬木，是我國重要木本糧食植物之一。其果實可制成栗粉或罐頭；木材堅 實，可供枕木、建筑等用；殼斗木材和樹皮含大量鞣質(zhì)，可提制栲膠，具有極大的經(jīng)濟價值。
[0007] 本發(fā)明所述錐栗優(yōu)勢共生菌根菌（簡稱錐栗菌根菌）為與錐栗根系具有優(yōu)勢共生 關(guān)系的外生菌根菌。具體包括與錐栗根系共生的馬勃、餓膏菌、牛肝菌、紅菇、雞樅菌等；優(yōu) 選為與錐栗根系共生的橙黃硬皮馬勃（SclerodermacitrinumPers.)或正紅燕（Russula vinosaLindblad1901)〇
[0008] 具體的，本發(fā)明提供了一種錐栗菌根菌人工培養(yǎng)方法，包括以下具體步驟：
[0009] (1)組織分離：采集野生錐栗菌根菌的子實體；從所述子實體的菌蓋與菌柄交匯 處，取菌肉組織塊；
[0010] (2)菌絲培養(yǎng)與提純：將所述菌肉組織塊接種在改良MMN平板培養(yǎng)基上，置于 25~28°C下培養(yǎng)至菌肉組織塊萌發(fā)出菌絲，將所述菌絲轉(zhuǎn)接至新的改良MMN平板培養(yǎng)基 上，在25~28°C下培養(yǎng)至菌絲長滿平板，獲得純化菌絲；
[0011] (3)液體發(fā)酵培養(yǎng)：挑取所述純化菌絲，接種到改良MMN液體培養(yǎng)基中，在25~ 28°C下振蕩培養(yǎng)10~15天，獲得菌液；
[0012] (4)菌種擴大培養(yǎng)：將所述菌液接種到擴大培養(yǎng)料中，在25~28°C下培養(yǎng)至菌絲 長滿培養(yǎng)容器，收集所述菌絲，即得。
[0013] 本發(fā)明步驟（1)所述采集錐栗菌根菌子實體時，采集中等成熟的子實體并連同子 實體附近土壤及錐栗根系一起采集。
[0014] 本發(fā)明步驟⑵所述改良MMN平板培養(yǎng)基的pH值為5-6,包括以下成分： CaCl2O. 04 ~0? 06g，MgSO4O. 12 ~0? 16g，NaCl0? 02 ~0? 03g，濃度為 1 % 的FeCl3L0 ~ I. 5ml，KH2PO4O. 4 ~0? 6g，VitamibB180 ~120yg，KNO3O. 20 ~0? 30g，12Be'的麥芽汁 80~120ml，甘露醇15~20g，檸檬酸0? 15~0.25g，瓊脂15~20g，蒸餾水900ml。其中， 各成分的用量可以按照相同的比例擴大或縮小。
[0015] 所述MMN平板培養(yǎng)基的制作方法具體為：
[0016]①配制0?08 ~0?12mg/mlVitamibB1，過濾滅菌；
[0017] ②將瓊脂加入蒸餾水中加熱溶解，之后加入其余原料，用Imol/LNaoH或lmol/L HCl調(diào)節(jié)pH值為5~6左右，在121°C下滅菌20min，滅菌后放到無菌操作臺，冷卻到45~ 55 °C左右，得混合液備用；
[0018] ③在所述混合液中加入I. Oml步驟①所得過濾滅菌的VitamibBl;
[0019] ④將步驟③所得液體趁熱分裝到培養(yǎng)皿中，冷凝，即可。
[0020] 本發(fā)明所述步驟（3)中，每100mL液體改良MMN培養(yǎng)基中接種4~6個由所述純 化菌絲組成的菌餅，每個菌餅直徑3~7mm。
[0021] 所述改良MMN液體培養(yǎng)基的pH值為5-6,包括以下成分=CaCl2O. 04~0.06g， MgSO4O. 12 ~0? 16g，NaCl0? 02 ~0? 03g，濃度為 1 % 的FeCl3L0 ~I. 5ml，KH2PO4O. 4 ~ 0? 6g，VitamibB180 ~120yg，KNO3O. 20 ~0? 30g，12Be' 的麥芽汁 80 ~120ml，甘露醇 15~20g，檸檬酸0. 15~0. 25g，蒸餾水900ml。其中，各成分的用量可以按照相同的比例 擴大或縮小。所述改良MMN液體培養(yǎng)基按照本領(lǐng)域液體培養(yǎng)基的常規(guī)配制方法配制。
[0022] 步驟（3)所述振蕩培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為50~150r/min，進一步優(yōu)選為100r/min。
[0023] 本發(fā)明所述步驟⑷中，菌液以40~50ml/100g接種到擴大培養(yǎng)料中。
[0024] 所述擴大培養(yǎng)料中包含草炭土、玉米粉和珍珠巖。具體的，三者的質(zhì)量比為草炭 土：玉米粉：珍珠巖=6~8 :1~2 :1~2,優(yōu)選為7:1. 5:1. 5。
[0025] 本發(fā)明同時保護所述方法栽培得到的錐栗菌根菌。
[0026] 本發(fā)明進一步保護所述錐栗菌根菌在錐栗栽培中的應(yīng)用。所述應(yīng)用包括以下步 驟：在錐栗幼苗長出一對真葉時，以8~12g/株的接菌量將所述錐栗菌根菌接種于錐栗幼 苗根部。所述接種量優(yōu)選為IOg/株。
[0027] 本發(fā)明提供的錐栗菌根菌的人工培養(yǎng)方法操作簡單，將所述菌根菌回接錐栗幼苗 后，菌根侵染率高，幼苗的苗高高、地徑大，同時高徑比較小，有助于培育壯苗。本發(fā)明所得 的錐栗菌根菌可增強錐栗根系對養(yǎng)分的吸收能力，擴大吸收面積，還可分解土壤中難以分 解的養(yǎng)分，土壤干旱時，增強抗旱力，同時分泌激素和有機酸，提高根系的生理活性，具有廣 泛的應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0028]圖1為實施例1所得錐栗菌根菌在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)示意圖；
[0029]圖2為實施例1所得錐栗菌根菌在體式顯微鏡下的形態(tài)示意圖。
【具體實施方式】
[0030] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0031] 本發(fā)明各實施例中，所述錐栗菌根菌為與錐栗根系共生的橙黃硬皮馬勃。
[0032] 實施例1
[0033] 一種錐栗菌根菌的人工培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0034] (1)野生菌根菌子實體的采集與組織分離：
[0035] 在30齡的錐栗園林下，采集新鮮、健壯、中等成熟的野生菌根菌子實體及附帶土 壤及和錐栗根系，除去表面雜物后，裝入盆內(nèi)，不要擠壓，在48小時內(nèi)帶回后在75%酒精中 浸泡5秒消毒，之后再用無菌水清洗兩遍；在無菌操作臺上，將清洗、消毒后的子實體縱剖 為兩半，用鑷子鋏取菌蓋與菌柄交匯處，得到綠豆大小的菌肉組織塊；
[0036] (2)菌絲培養(yǎng)與提純：
[0037] 改良MMN平板培養(yǎng)基包括以下成分：CaCl2O. 045g，MgSO4O. 15g，NaCl0?025g，濃度 為 1% 的FeCl3L2ml，KH2PO4O. 45g，VitamibBIIOOyg，KNO3O. 25g，12Be' 的麥芽汁 100ml， 甘露醇20g，檸檬酸0