專利名稱：用于增強(qiáng)植物中組成型基因表達(dá)的調(diào)節(jié)性核酸分子的制作方法
用于增強(qiáng)植物中組成型基因表達(dá)的調(diào)節(jié)性核酸分子發(fā)明描述本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域并且提供了用于產(chǎn)生高表達(dá)的組成型啟動(dòng)子和產(chǎn)生具有增強(qiáng)的核酸組成型表達(dá)的植物的方法，其中將增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸(NEENAs)與所述啟動(dòng)子功能性連接和/或?qū)胫参镏?。轉(zhuǎn)基因在植物中的表達(dá)強(qiáng)烈地受多種外部和內(nèi)部因素影響，從而導(dǎo)致變動(dòng)和不可預(yù)測水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。經(jīng)常不得不產(chǎn)生大量的轉(zhuǎn)化體并進(jìn)行分析，以鑒定具有合乎需要的表達(dá)強(qiáng)度的株系。由于轉(zhuǎn)化并篩選表達(dá)強(qiáng)度合乎需要的株系是昂貴和耗費(fèi)人力的，故需要一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因在植物中高表達(dá)。當(dāng)不得不在轉(zhuǎn)基因植物中協(xié)調(diào)表達(dá)幾個(gè)基因以實(shí)現(xiàn)特定效應(yīng)時(shí)，鑒于必須鑒定其中每個(gè)基因均強(qiáng)烈表達(dá)的植物，這個(gè)問題尤其嚴(yán)重。例如，取決于構(gòu)建體設(shè)計(jì)和各個(gè)轉(zhuǎn)化事件中T-DNA插入基因座的位置效應(yīng)，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可以顯著地變動(dòng)。強(qiáng)啟動(dòng)子可以部分地克服這些難題。然而，顯示強(qiáng)烈表達(dá)同時(shí)特異性合乎需要的合適啟動(dòng)子的可獲得性經(jīng)常是有限的。為了確保可獲得具有合乎需要的表達(dá)特異性的充足啟動(dòng)子，額外啟動(dòng)子的鑒定和表征可能有助于彌合這種缺口。然而，具有相應(yīng)特異性和強(qiáng)度的啟動(dòng)子的天然可獲得性和費(fèi)時(shí)的候選啟動(dòng)子表征阻礙了合適的新啟動(dòng)子的鑒定。為了克服這些難題，已經(jīng)顯示多樣的遺傳元件和/或基序積極地影響基因表達(dá)。 在它們當(dāng)中，已經(jīng)認(rèn)可一些內(nèi)含子作為具有改善基因表達(dá)的強(qiáng)大潛能的遺傳元件。雖然機(jī)制大多未知，但是已經(jīng)顯示一些內(nèi)含子積極地影響成熟mRNA的穩(wěn)態(tài)量，這可能通過增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性、改善mRNA成熟、增強(qiáng)胞核mRNA輸出和/或改善翻譯起始來影響(例如Huang和 Gorman, 1990 ；Le Hir等人，2003 ；Nott等人，2004)。由于顯示僅所選的內(nèi)含子增加表達(dá)，故剪接本身很可能解釋不了觀察到的效果。將內(nèi)含子與啟動(dòng)子功能性連接時(shí)觀察到的基因表達(dá)增加稱作內(nèi)含子介導(dǎo)的基因表達(dá)增強(qiáng)(IME)并且已經(jīng)在多種單子葉植物(例如Callis等人，1987 ；Vasil等人，1989 ； Bruce等人，1990 ；Lu等人，2008)和雙子葉植物(例如Chung等人，2006 ；Kim等人，2006 ； Rose等人，2008)得到顯示。在這個(gè)方面，顯示內(nèi)含子相對于翻譯起始位點(diǎn)(ATG)的位置對于內(nèi)含子介導(dǎo)的基因表達(dá)增強(qiáng)至關(guān)重要(Rose等人，2004)。繼一些內(nèi)含子增強(qiáng)基因表達(dá)的潛能之后，顯示這些內(nèi)含子還在植物中于其原有核苷酸環(huán)境下影響組織特異性。發(fā)現(xiàn)報(bào)道基因表達(dá)依賴于含有多達(dá)2個(gè)內(nèi)含子的基因組區(qū)域的存在(Sieburth等人，1997 ；Wang等人，2004)。也已經(jīng)報(bào)道5，UTR內(nèi)含子對啟動(dòng)子元件的恰當(dāng)功能性是重要的，這可能歸因于內(nèi)含子中存在的組織特異性基因控制元件(Fu等人， 1995a ；Fu等人，1995b ；Vitale等人，2003 ；Kim等人，2006)。然而，這些研究還顯示內(nèi)含子與異源啟動(dòng)子的組合可能對基因表達(dá)的強(qiáng)度和/或特異性產(chǎn)生強(qiáng)烈的不利影響(Vitale等人，2003 ；Kim 等人，2006、W02006/003186、W02007/098042)。例如，花椰菜花葉病毒 CaMV!35S 組成型強(qiáng)啟動(dòng)子因與芝麻&FAD2 5’ UTR內(nèi)含子組合而不利地影響表達(dá)(Kim等人，2006)。 與這些觀察結(jié)果相反，一些文獻(xiàn)顯示通過IME增強(qiáng)核酸的表達(dá)而不影響相應(yīng)啟動(dòng)子的組織特異性(Schiinmann 等人，2004)。
在本申請中，描述了與組成型啟動(dòng)子功能性連接時(shí)增強(qiáng)所述啟動(dòng)子的表達(dá)同時(shí)不影響其特異性的其他核酸分子。在本申請中將這些核酸分子描述為“增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸”(NEENA)。內(nèi)含子具有從分別的前mRNA剪接下來的內(nèi)在特征。與其相反，本申請中即將陳述的核酸不必要一定包含于mRNA中，或如果存在于mRNA中，沒有必要一定從mRNA中剪接下來，以增強(qiáng)源自與NEENA功能性連接的啟動(dòng)子的表達(dá)。發(fā)明詳述本發(fā)明的第一實(shí)施方案包括用于產(chǎn)生高表達(dá)的組成型啟動(dòng)子的方法，所述高表達(dá)的組成型啟動(dòng)子包含與啟動(dòng)子功能性連接的一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸(NEENA)分子，所述方法包括i)具有如SEQ ID NO :1至19、優(yōu)選地SEQ ID NO :1至9的任一者中所定義序列的核酸分子，或ii)具有下述序列的核酸分子，所述序列與如SEQ ID NO :1至19、優(yōu)選地SEQ ID NO :1至9所定義的任一序列具有80%或更大的同一性，優(yōu)選地，該同一性是85%或更大， 更優(yōu)選地，該同一性是90%或更大，甚至更優(yōu)選地，該同一性是95%或更大、96%或更大、 97 %或更大、98 %或更大或99 %或更大，在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，該同一性相對于如SEQ ID NO 1至19、優(yōu)選地SEQ ID NO :1至9所定義的任一序列是100%，或iii) i)或ii)的核酸分子的100個(gè)或更多連續(xù)堿基、優(yōu)選地150個(gè)或更多連續(xù)堿基、更優(yōu)選地200個(gè)或更多連續(xù)堿基、或甚至更優(yōu)選地250個(gè)或更多連續(xù)堿基的片段，所述片段具有如具備SEQ ID NO :1至19、優(yōu)選地SEQ ID NO :1至9所定義任一序列的相應(yīng)核酸分子那樣的增強(qiáng)表達(dá)活性，例如65%或更大、優(yōu)選地70%或更大、更優(yōu)選地75%或更大，甚至更優(yōu)選地80%或更大、85%或更大或90%或更大，在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，95%或更大的增強(qiáng)表達(dá)活性，或iv)作為前文在i)至iii)下提及的核酸分子中任一者的互補(bǔ)物或反向互補(bǔ)物的核酸分子，或ν)使用由 SEQ ID NO 20 至 57、優(yōu)選地如表 2 中所示 SEQ ID NO :20/21 ；26/27 ； 30/31 ；38/39 ；42/43 ；44/45 ；46/47 ；50 ；51和56/57描述的寡核苷酸引物，通過PCR可獲得的核酸分子，或vi) 100個(gè)或更多核苷酸、150個(gè)或更多核苷酸、200個(gè)或更多核苷酸或250個(gè)或更多核苷酸的核酸分子，所述核酸分子在等同于在50°C于7%十二烷基硫酸鈉(SDQ、0. 5M NaPO4UmM EDTA雜交，以及在50°〇或65°〇、優(yōu)選地651于2XSSC、0. 1% SDS中洗滌的條件下與包含由SEQ ID NO :1至19、優(yōu)選地SEQ ID NO 1至9描述的增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少50個(gè)、優(yōu)選地至少100、更優(yōu)選地至少150、甚至更優(yōu)選地至少200、最優(yōu)選地至少250個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸分子雜交。優(yōu)選地，所述核酸分子在等同于在50°C于 7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA雜交，以及在50°C或65°C、優(yōu)選地65°C于 IX SSC、0. SDS中洗滌的條件下與包含由SEQ ID NO :1至19、優(yōu)選地SEQ ID N0:1至9描述的增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少50個(gè)、優(yōu)選地至少100、更優(yōu)選地至少150、 甚至更優(yōu)選地至少200、最優(yōu)選地至少250個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸分子雜交；更優(yōu)選地，所述核酸分子在等同于在50°C于7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA雜交，以及在50°C或65°C、優(yōu)選地65°C于0. 1XSSC、0. SDS中洗滌的條件下與包含由SEQ ID NO:1至19、優(yōu)選地SEQ ID NO :1至9描述的增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少50個(gè)、 優(yōu)選地至少100、更優(yōu)選地至少150、甚至更優(yōu)選地至少200、最優(yōu)選地至少250個(gè)連續(xù)核苷
酸的核酸分子雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)NEENA相對于與NEENA功能性連接的啟動(dòng)子是異源的。如以上在ν)下所述，使用如表2中所示由SEQ ID NO :20至57、優(yōu)選地SEQ ID NO 20/21 ；26/27 ；30/31 ；38/39 ；42/43 ；44/45 ；46/47 ；50/51 和 56/57 所定義的寡核苷酸， 通過PCR可獲得的核酸分子是例如使用如下文實(shí)施例1中所述的條件，從來自擬南芥屬 (Arabidopsis)植物如擬南芥(A. thaliana)的基因組DNA中可獲得的。技術(shù)人員知曉變動(dòng)溫度特征、循環(huán)數(shù)和/或緩沖液組成或濃度以獲得相應(yīng)的 NEENA分子。表2中描述在用于獲得相應(yīng)NEENA分子的相應(yīng)PCR反應(yīng)中待使用的寡核苷酸的特定組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉用于使單向啟動(dòng)子變成雙向啟動(dòng)子的方法和使用啟動(dòng)子序列的互補(bǔ)物或反向互補(bǔ)物以產(chǎn)生與原始序列具有相同啟動(dòng)子特異性的啟動(dòng)子的方法。用于組成型及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的此類方法例如由Xie等人Q001) "Bidirectionalization of polar promoters in plants (植物中極性啟云力子的雙向化)，，nature biotechnology 19 第677-679頁描述。作者描述了添加最小啟動(dòng)子至任意給定啟動(dòng)子的5’引發(fā)端足以在兩個(gè)方向獲得啟動(dòng)子控制表達(dá)，同時(shí)具有相同的啟動(dòng)子特異性。因而，與如上文所述NEENA功能性連接的高表達(dá)啟動(dòng)子在互補(bǔ)或反向互補(bǔ)情況下是有功能的，并且因此所述NEENA在互補(bǔ)或反向互補(bǔ)情況下也是有功能的。如本文中所用的組成型啟動(dòng)子意指在基本上全部植物組織中貫穿植物或其部分的基本上整個(gè)生活期限表達(dá)的啟動(dòng)子。在基本上全部植物組織中表達(dá)的啟動(dòng)子也可以包括在主要植物組織如葉、莖和/或根的至少兩者中并且可以在或可以不在一些或全部次要組織或細(xì)胞如表皮、氣孔、毛狀體、花、種子或分生組織中表達(dá)的啟動(dòng)子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文中所意指的組成型啟動(dòng)子至少在綠色組織如葉和莖中表達(dá)。貫穿植物或其部分的基本上整個(gè)生活期限表達(dá)的啟動(dòng)子也可以包括在嫩的和已發(fā)育的組織中表達(dá)，但是可以在植物生活期限中的特定時(shí)間點(diǎn)或在特定條件下如在萌發(fā)和 /或衰老期間或在生物性和/或非生物性脅迫條件如真菌性或細(xì)菌性感染、干旱、熱或寒冷下缺少表達(dá)的啟動(dòng)子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，貫穿植物的基本上整個(gè)生活期限表達(dá)的組成型啟動(dòng)子至少在充分?jǐn)U大的組織中表達(dá)直至開始衰老。原則上，NEENA可以與任意的啟動(dòng)子如組織特異性、誘導(dǎo)型、發(fā)育特異性或組成型啟動(dòng)子功能性連接。相應(yīng)的NEENA將導(dǎo)致在與至少一種NEENA功能性連接的相應(yīng)啟動(dòng)子控制下的異源核酸的增強(qiáng)表達(dá)。增強(qiáng)除組成型啟動(dòng)子之外的啟動(dòng)子例如組織特異性啟動(dòng)子的表達(dá)將給予這些啟動(dòng)子的特異性。核酸在相應(yīng)啟動(dòng)子控制下的表達(dá)將是在無NEENA的情況下檢測不到所述核酸的轉(zhuǎn)錄物的額外組織或發(fā)育階段中可檢測的。因此，組織特異性或發(fā)育特異性或任意其他啟動(dòng)子可以通過將至少一種如上文所述的NEENA分子與所述啟動(dòng)子功能性連接而變成組成型啟動(dòng)子。因此，本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是提供用于將植物中有功能的任意給定啟動(dòng)子的特異性通過相應(yīng)啟動(dòng)子與NEENA分子連接而賦予組成型啟動(dòng)子的方法，其中所述NEENA分子包含如以上在i)至vi)下所述的序列。
優(yōu)選地，一個(gè)或多個(gè)NEENA與任意的組成型啟動(dòng)子功能性連接并且將增強(qiáng)在所述啟動(dòng)子控制下的核酸分子的表達(dá)。待用于本發(fā)明任意方法中的組成型啟動(dòng)子可以源自植物例如單子葉或雙子葉植物、源自細(xì)菌和/或病毒或可以是合成性啟動(dòng)子。待使用的組成型啟動(dòng)子例如是來自歐芹(P.crispum)的Pc^bi-啟動(dòng)子(W0 2003102198)、來自玉米的 ZmUbi-啟動(dòng)子、來自編碼腈水解酶1的擬南芥基因At3g44310的AtNit-啟動(dòng)子、來自玄參 (figwort)花葉病毒的34S-啟動(dòng)子、來自煙草花葉病毒的35S-啟動(dòng)子、源自農(nóng)桿菌的nos 啟動(dòng)子和ocs啟動(dòng)子、ScBV-啟動(dòng)子(US 5 994 123)、SUPER-啟動(dòng)子(Lee等人2007，Plant. Phys.)、來自編碼鐵氧還蛋白NADH還原酶的擬南芥基因At5g66190的AtFNR-啟動(dòng)子、來自豌豆(Pisum sativum)的ptxA啟動(dòng)子(W0200508M50)、來自編碼磷酸三糖易位蛋白的擬南芥基因At5g46110的AtTPT-啟動(dòng)子、來自擬南芥基因At4gl4880和At4gl4890的雙向 AtOASTL-啟動(dòng)子、來自編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的擬南芥基因的Atlgl3440的PR00194 啟動(dòng)子、來自編碼二磷酸果糖醛縮酶的擬南芥基因At3g5^30的PR00162啟動(dòng)子、AHAS-啟動(dòng)子(W020081M4%)或咖啡酰輔酶A-MT啟動(dòng)子和來自稻的0sCP12 (W02006084868)。與NEENA功能性連接的本發(fā)明高表達(dá)的組成型啟動(dòng)子可以用于任意植物中，所述植物包括例如苔蘚、蕨類、裸子植物或被子植物，例如單子葉或雙子葉植物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與NEENA功能性連接的本發(fā)明所述啟動(dòng)子可以用于單子葉或雙子葉植物中， 優(yōu)選地是作物植物如谷物、大豆、卡諾拉油菜、棉屬植物、馬鈴薯、甜菜、稻、小麥、高粱、大麥、芭蕉屬植物、甘蔗、芒屬植物等。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與NEENA功能性連接的所述啟動(dòng)子可以用于單子葉作物植物如谷物、稻、小麥、高粱、芭蕉屬植物、芒屬植物、 甘蔗或大麥中。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，與NEENA功能性連接的啟動(dòng)子可以用于雙子葉作物植物如大豆、卡諾拉油菜、棉屬植物、甜菜或馬鈴薯中。如本申請中所用的高表達(dá)的組成型啟動(dòng)子意指例如與NEENA功能性連接的啟動(dòng)子，所述NEENA引起該啟動(dòng)子在植物或其部分中增強(qiáng)的組成型表達(dá)，其中源自功能性連接于NEENA的相應(yīng)啟動(dòng)子控制下的核酸分子的RNA積累或RNA合成速率比由缺少本發(fā)明 NEENA的相同啟動(dòng)子引起的表達(dá)高，優(yōu)選地顯著更高。優(yōu)選地，與相同條件下培育的包含不與本發(fā)明NEENA功能性連接的相同組成型啟動(dòng)子的同齡對照植物相比，植物中相應(yīng)核酸的 RNA的量和/或RNA合成速率和/或RNA穩(wěn)定性增加50%或更大，例如100%或更大、優(yōu)選地200%或更大、更優(yōu)選地5倍或更大、甚至更優(yōu)選地10倍或更大、最優(yōu)選地20倍或更大， 例如50倍。在本文中使用時(shí)，顯著更高指技術(shù)人員知曉如何確定的統(tǒng)計(jì)顯著性，例如通過對相應(yīng)的數(shù)據(jù)集合應(yīng)用統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)如t-檢驗(yàn)。用于檢測由啟動(dòng)子賦予的表達(dá)的方法是本領(lǐng)域已經(jīng)的。例如，該啟動(dòng)子可以與標(biāo)記基因如GUS、GFP或螢光素酶基因功能性連接，并且可以在植物或其部分中測定由相應(yīng)標(biāo)記基因編碼的相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性。作為代表性實(shí)例，下文詳細(xì)描述用于檢測螢光素酶的方法。其他方法例如是通過本領(lǐng)域已知的方法，例如RNA印跡分析法、qPCR、連綴(rim-on)測定法或本領(lǐng)域所述的其他方法測量受該啟動(dòng)子控制的核酸分子的RNA穩(wěn)態(tài)水平或合成速率。技術(shù)人員知曉多種用于功能性連接兩個(gè)或多個(gè)核酸分子的方法。此類方法可以包括限制性切割/連接法、不依賴連接酶的克隆法、重組工程法、重組或合成法。其他方法可以用來功能性連接兩個(gè)或多個(gè)核酸分子。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案是用于產(chǎn)生植物或其部分的方法，所述植物或其部分與相應(yīng)的對照植物或其部分相比具有一種或多種核酸分子的增強(qiáng)的組成型表達(dá)，所述方法包括步驟將包含如上文在i)至vi)下所定義核酸分子的一個(gè)或多個(gè)NEENA導(dǎo)入所述植物或其部分，和將所述一個(gè)或多個(gè)NEENA與啟動(dòng)子、優(yōu)選地組成型啟動(dòng)子并且與處在所述啟動(dòng)子、優(yōu)選地組成型啟動(dòng)子控制下的核酸分子功能性連接，其中NEENA對所述核酸分子為異源。NEENA可以相對于處在與NEENA功能性連接的所述啟動(dòng)子的控制下的核酸分子為異源，或它可以相對于該啟動(dòng)子和處在該啟動(dòng)子控制下的核酸分子均為異源。就核酸分子或DNA而言，術(shù)語“異源的”指這樣的核酸分子，所述核酸分子有效連接于，或受到操作以變得有效連接于自然界中不與該核酸分子有效連接或自然界中與該核酸分子在不同位置有效連接的第二種核酸分子。例如，本發(fā)明的NEENA在其天然環(huán)境中與其天然啟動(dòng)子功能性連接，而在本發(fā)明中，它與可以源自相同生物、不同生物或合成性啟動(dòng)子如SUPER-啟動(dòng)子的另一個(gè)啟動(dòng)子連接。它也可以意指本發(fā)明的NEENA與其天然啟動(dòng)子連接，但是處于所述啟動(dòng)子控制下的核酸分子相對于包含其天然NEENA的啟動(dòng)子為異源。 此外，應(yīng)當(dāng)理解，啟動(dòng)子和/或處在與本發(fā)明NEENA功能性連接的所述啟動(dòng)子控制下的核酸分子相對于所述NEENA為異源，原因是它們的序列已經(jīng)受到例如突變?nèi)绮迦?、缺失等操作?從而啟動(dòng)子和/或處在所述啟動(dòng)子控制下的核酸分子的天然序列被修飾并且因此已經(jīng)變得相對于本發(fā)明的NEENA為異源。也可以理解，當(dāng)NEENA與其天然啟動(dòng)子功能性連接，其中NEENA的位置相對于所述啟動(dòng)子改變，從而該啟動(dòng)子在這種操作后顯示更高表達(dá)時(shí)，該 NEENA相對于功能性連接至NEENA的核酸為異源。如本文中所意指的顯示增強(qiáng)的核酸分子組成型表達(dá)的植物意指與相同條件下培育的沒有與相應(yīng)核酸分子功能性連接的相應(yīng)NEENA的對照植物相比，具有更高的、優(yōu)選地統(tǒng)計(jì)顯著更高的核酸分子組成型表達(dá)的植物。這種對照植物可以是野生型植物或是包含控制與本發(fā)明植物中相同的基因的相同啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述啟動(dòng)子不與本發(fā)明的 NEENA連接。產(chǎn)生如本文中所用的植物包括用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的方法，如借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、粒子轟擊等將重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入植物或其部分并且任選地隨后再生出轉(zhuǎn)基因植物。它還包括用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化植物或其部分的方法，如病毒感染法或農(nóng)桿菌浸潤法。技術(shù)人員知曉用于穩(wěn)定和/或瞬時(shí)轉(zhuǎn)化植物或其部分的其他方法。方法如育種方法或原生質(zhì)體融合法可以用于本發(fā)明植物的產(chǎn)生并且由本發(fā)明涵蓋。本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于任意植物，例如裸子植物或被子植物，優(yōu)選地是被子植物，例如雙子葉或單子葉植物，優(yōu)選地是雙子葉植物。優(yōu)選的單子葉植物例如是谷物、小麥、 稻、大麥、高粱、芭蕉屬植物、甘蔗、芒屬植物和短柄草屬植物(Brachypodium)，特別優(yōu)選的單子葉植物是谷物、小麥和稻。優(yōu)選的雙子葉植物是例如大豆、油菜籽、卡諾拉油菜、亞麻、 棉屬植物、馬鈴薯、甜菜、萬壽菊和擬南芥屬植物(Arabidopsis)，特別優(yōu)選的雙子葉植物是大豆、油菜籽、卡諾拉油菜和馬鈴薯。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，如上文定義的方法包括以下步驟a)將包含如上文的i)至vi)中所定義核酸分子的一個(gè)或多個(gè)NEENA導(dǎo)入植物或其部分，和b)將所述一個(gè)或多個(gè)NEENA整合至所述植物或其部分的基因組中，從而所述一個(gè)或多個(gè)NEENA與相對所述一個(gè)或多個(gè)NEENA為異源的優(yōu)選地組成型表達(dá)的內(nèi)源核酸功能性連接，和任選地c)從所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生出包含所述一個(gè)或多個(gè)NEENA的植物或其部分。NEENA可以相對于處在與NEENA功能性連接的所述啟動(dòng)子的控制下的核酸分子為異源，或它可以相對于該啟動(dòng)子和處在該啟動(dòng)子控制下的核酸分子均為異源。可以將一個(gè)或多個(gè)NEENA分子借助粒子轟擊法、原生質(zhì)體電穿孔法、病毒感染法、 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法或本領(lǐng)域已知的任意其他方法導(dǎo)入植物或其部分?？梢詫EENA分子導(dǎo)入整合例如至質(zhì)粒或病毒DNA或病毒RNA中。NEENA分子也可以在導(dǎo)入植物或植物部分中之前包含于BAC、YAC或人工染色體上。也可以將NEENA分子作為包含NEENA序列的線性核酸分子導(dǎo)入，其中額外的序列可以緊鄰該核酸分子上的NEENA序列存在。毗鄰NEENA序列的這些序列可以長約20bp，例如20bp至數(shù)百堿基對，例如IOObp或更多，并且可以促進(jìn)整合至基因組中，例如通過同源重組?？梢允褂糜糜诨蚪M整合的任何其他方法，無論它是定向整合法，如同源重組，或隨機(jī)整合法，如非常規(guī)(illegitimate)重組。可以與NEENA分子功能性連接的優(yōu)選地組成型表達(dá)的內(nèi)源核酸可以是任意核酸， 優(yōu)選地是任意的組成型表達(dá)的核酸分子。該核酸分子可以是編碼蛋白質(zhì)的核酸分子或非編碼性分子如反義 RNA、rRNA、tRNA、miRNA、ta-siRNA、siRNA、dsRNA、snRNA、snoRNA 或本領(lǐng)域已知的任何其他非編碼性RNA。技術(shù)人員知曉用于鑒定組成型表達(dá)的核酸分子的方法，例如通過微陣列芯片雜交、qPCR、RNA印跡分析、下一代測序法等，其中本發(fā)明的方法可以優(yōu)選地應(yīng)用于所述核酸分子。實(shí)施本發(fā)明方法的又一種方式可以是a)提供包含一個(gè)或多個(gè)NEENA的表達(dá)構(gòu)建體，所述NEENA包含如上文i)至vi) 中所定義的與啟動(dòng)子、優(yōu)選地組成型啟動(dòng)子并且與相對于所述一個(gè)或多個(gè)NEENA為異源并處在所述啟動(dòng)子、優(yōu)選地組成型啟動(dòng)子控制下的一種或多種核酸分子功能性連接的核酸分子，和b)將包含所述一個(gè)或多個(gè)NEENA的所述表達(dá)構(gòu)建體整合至所述植物或其部分的基因組中，和任選地c)從所述轉(zhuǎn)化的植物或其部分再生出包含所述一個(gè)或多個(gè)表達(dá)構(gòu)建體的植物或其部分。NEENA可以相對于處在與NEENA功能性連接的所述啟動(dòng)子的控制下的核酸分子為異源，或它可以相對于該啟動(dòng)子和處在該啟動(dòng)子控制下的核酸分子均為異源。表達(dá)構(gòu)建體可以借助本領(lǐng)域已知的任何方法整合至相應(yīng)植物的基因組中。使用如粒子轟擊法或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法的方法時(shí)，整合可以是隨機(jī)的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，整合借助定向整合，例如通過同源重組進(jìn)行。后一種方法將允許包含與NEENA功能性連接的高表達(dá)啟動(dòng)子的表達(dá)構(gòu)建體整合至有利的基因組區(qū)域中。有利的基因組區(qū)域例如是已知包含例如在種子中高度表達(dá)的基因的基因組區(qū)域，并且因而與顯示無轉(zhuǎn)錄活性的基因組區(qū)域相比，可以增加源自所述表達(dá)構(gòu)建體的表達(dá)。
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在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)NEENA與靠近所述異源核酸分子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的啟動(dòng)子、優(yōu)選地組成型啟動(dòng)子功能性連接。如本文中所意指的靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)包含一個(gè)或多個(gè)NEENA與距離所述異源核酸分子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)2500bp或更少、優(yōu)選地2000bp或更少、更優(yōu)選地1500bp或更少、甚至更優(yōu)選地IOOObp或更少并且最優(yōu)選地500bp或更少的啟動(dòng)子、優(yōu)選地組成型啟動(dòng)子功能性連接。應(yīng)當(dāng)理解，該NEENA可以距相應(yīng)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以相應(yīng)距離在上游或下游整合。因而，一個(gè)或多個(gè)NEENA不必一定包含于處在與所述一個(gè)或多個(gè)NEENA功能性連接的優(yōu)選地組成型啟動(dòng)子控制下的相應(yīng)異源核酸的轉(zhuǎn)錄物中。優(yōu)選地，一個(gè)或多個(gè)NEENA整合在相應(yīng)啟動(dòng)子、優(yōu)選地組成型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游的整合位點(diǎn)可以位于5’UTR、3’UTR、外顯子或內(nèi)含子中，或它可以替換內(nèi)含子或部分或完全地替換處于優(yōu)選地組成型啟動(dòng)子控制下的異源核酸的5，UTR或3，UTR。優(yōu)選地，一個(gè)或多個(gè)NEENA 整合在5’ UTR或內(nèi)含子中，或所述NEENA替換內(nèi)含子或部分或全部5’ UTR，最優(yōu)選地，它整合在相應(yīng)異源核酸的5’ UTR中。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案包括含有一個(gè)或多個(gè)NEENA的重組表達(dá)構(gòu)建體，其中所述的NEENA包含上文i)至vi)中所定義的核酸分子。重組表達(dá)構(gòu)建體可以還包含與一個(gè)或多個(gè)NEENA功能性連接的一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子，優(yōu)選地組成型啟動(dòng)子和任選地一個(gè)或多個(gè)表達(dá)的核酸分子，所述核酸分子相對于所述一個(gè)或多個(gè)NEENA為異源。NEENA可以相對于處在與NEENA功能性連接的所述啟動(dòng)子的控制下的核酸分子為異源，或它可以相對于該啟動(dòng)子和處在該啟動(dòng)子控制下的核酸分子均為異源。該表達(dá)構(gòu)建體可以包含與NEENA功能性連接的啟動(dòng)子、優(yōu)選地組成型啟動(dòng)子和待表達(dá)核酸分子的1個(gè)或多個(gè)，例如2個(gè)或更多個(gè)，例如5個(gè)或更多個(gè)，如10個(gè)或更多個(gè)組合，所述的待表達(dá)核酸分子相對于相應(yīng)的NEENA為異源。該表達(dá)構(gòu)建體也可以包含其他啟動(dòng)子，所述的其他啟動(dòng)子不包含與相對于相應(yīng)的啟動(dòng)子為同源或異源的待表達(dá)核酸分子功能性連接的NEENA。包含如上文定義的一個(gè)或多個(gè)重組表達(dá)構(gòu)建體的重組表達(dá)載體是本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案?？梢栽诒景l(fā)明中使用的多種表達(dá)載體是技術(shù)人員已知的。用于將包含這種表達(dá)構(gòu)建體的此種載體導(dǎo)入植物基因組中的方法和用于從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞恢復(fù)轉(zhuǎn)基因植物的方法也是本領(lǐng)域熟知的，其中所述的表達(dá)構(gòu)建體包含例如與NEENA功能性連接的啟動(dòng)子和任選地其他元件如終止子。取決于用于轉(zhuǎn)化植物或其部分的方法，完整載體可以整合至所述植物或其部分的基因組中，或者載體的某些組分可以整合至所述基因組中，例如T-DNA。本發(fā)明中還包括轉(zhuǎn)基因植物或其部分，其包含如上文i)至vi)中所定義的一種或多種異源NEENA。如果NEENA是合成的、源自另一種生物或源自相同生物，但是其天然基因組位置與對照植物例如野生型植物相比被改變，則將NEENA理解為相對于該植物是異源的。應(yīng)當(dāng)理解，改變的基因組位置意指，NEENA位于另一條染色體上或位于同一條染色體上，但是脫離例如在野生型植物中其天然基因組位置101Λ或更遠(yuǎn)，例如101Λ，優(yōu)選地51Λ 或更遠(yuǎn)，例如5kb，更優(yōu)選地IOOObp或更遠(yuǎn)，例如lOOObp，甚至更優(yōu)選地500bp或更遠(yuǎn)，例如 500bp，特別優(yōu)選地IOObp或更遠(yuǎn)，例如lOObp，最優(yōu)選地IObp或更遠(yuǎn)，例如10bp。包含如上文定義的重組表達(dá)載體或如上文定義的重組表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物或其部分是本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物或其部分可以選自細(xì)菌、真菌、酵母或植物、昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞或植物。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞是細(xì)菌、真菌、酵母或植物細(xì)胞。優(yōu)選的細(xì)菌是腸桿菌屬細(xì)菌如大腸桿菌(E.coli)和農(nóng)桿菌屬的細(xì)菌，例如根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)和發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)。優(yōu)選的植物是單子葉或雙子葉植物，例如單子葉或雙子葉作物植物，如谷物、 大豆、卡諾拉油菜、棉屬植物、馬鈴薯、甜菜、稻、小麥、高粱、大麥、芒屬植物、芭蕉屬植物、甘蔗等。優(yōu)選的作物植物是谷物、稻、小麥、大豆、卡諾拉油菜、棉屬植物或馬鈴薯。尤其優(yōu)選的雙子葉作物植物是大豆、卡諾拉油菜、棉屬植物或馬鈴薯。尤其優(yōu)選的單子葉作物植物是谷物、小麥和稻。源自如上文所定義的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或植物或其部分中的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)物、轉(zhuǎn)基因種子、部分或繁殖材料是本發(fā)明的其他實(shí)施方案，其中所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或植物或其部分包含如上文在i)至vi)中定義的所述異源NEENA或如上文定義的所述重組表達(dá)構(gòu)建體或所述重組載體。如本文中所意指的轉(zhuǎn)基因部分或繁殖材料包含含有相應(yīng)NEENA、重組表達(dá)構(gòu)建體或重組載體的全部組織和器官，例如葉、莖和果實(shí)以及用于植物繁殖和/或再生的材料如插條、接穗、壓條、枝條或幼苗。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案是如上文在i)至vi)中定義的NEENA或如上文定義的重組構(gòu)建體或重組載體用于增強(qiáng)植物或其部分中表達(dá)的用途。因而，本申請即將提供種子特異的和/或種子優(yōu)先的增強(qiáng)基因表達(dá)的核酸分子， 其包含一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子，優(yōu)選地是與一個(gè)或多個(gè)NEENA功能性連接的種子特異的和/或種子優(yōu)先的啟動(dòng)子。另外，提供了此類增強(qiáng)基因表達(dá)的核酸分子和包含此類增強(qiáng)基因表達(dá)的核酸分子的表達(dá)構(gòu)建體、表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因植物或其部分和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的用途。本發(fā)明中還包括源自如上文定義的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或植物或其部分中的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)物、轉(zhuǎn)基因種子、部分或繁殖材料用于生產(chǎn)食物、動(dòng)物飼料、種子、藥物或精細(xì)化學(xué)品的用途。定義縮寫NEENA-增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸，GFP-綠色熒光蛋白，⑶S-β -葡糖苷酸酶， ΒΑΡ-6-芐氨基嘌呤，2，4-D-2，4-二氯苯氧乙酸，MS-Murashige-Skoog 培養(yǎng)基，NAA-I-萘乙酸，MES，2-(N-嗎啉代)-乙磺酸，IAA:卩引哚乙酸，Kan 硫酸卡那霉素，GA3-赤霉酸， Timentin 替卡西林二鈉/克拉維酸鉀，microl 微升。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于具體的方法或方案。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語目的僅在于描述具體實(shí)施方案，并且不意圖限制本發(fā)明，本發(fā)明將僅受所附權(quán)利要求書限制。必須指出，如本文中和所附權(quán)利要求中所用，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指稱，除非上下文另外明確地指明并非如此。因此，例如，對“一個(gè)載體”的提及是對一個(gè)或多個(gè)載體的提及并且包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物等。術(shù)語“約”在本文中用來指大約、大
致、左右和在......范圍內(nèi)。當(dāng)術(shù)語“約”與一個(gè)數(shù)字范圍聯(lián)合使用時(shí)，它通過使界限值擴(kuò)
展高于和低于所述數(shù)值而修飾該范圍。通常而言，術(shù)語“約”在本文中用來通過20%、優(yōu)選地10%之上或之下(更高或更低)變異而修飾高于和低于所述值的數(shù)值。如本文中所用， 詞匯“或”意指特定列出的任何一成員并且還包括該列出的成員的任意組合。在本說明書中及以下權(quán)利要求中使用時(shí)，詞匯“包含”、“包含著”、“包括”、“包括著”和“包括了”意圖指明一個(gè)或多個(gè)所述特征、整數(shù)、組分或步驟的存在，但是它們不排除一個(gè)或多個(gè)其他特征、 整數(shù)、組分、步驟或其組的存在或添加。為清晰起見，將本說明書中使用的某些術(shù)語如下定義并使用。反平行“反平行”在本文中指經(jīng)互補(bǔ)性堿基殘基之間氫鍵配對的兩個(gè)核苷酸序列，其中磷酸二酯鍵在一個(gè)核苷酸序列中以5’ -3’方向分布并且在另一個(gè)核苷酸序列中以 3’ -5’方向分布。反義術(shù)語“反義”指相對于其轉(zhuǎn)錄或發(fā)揮作用的正常方向?yàn)榉聪虿⑶覐亩磉_(dá)下述RNA轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列，其中所述的RNA轉(zhuǎn)錄物與宿主細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)的靶基因mRNA分子互補(bǔ)(例如，它可以借助Watson-Crick堿基配對作用與靶基因mRNA分子或單鏈基因組 DNA雜交)或與靶DNA分子(例如宿主細(xì)胞中存在的基因組DNA)互補(bǔ)。編碼區(qū)如本文中所用，術(shù)語“編碼區(qū)”在談及結(jié)構(gòu)基因使用時(shí)，指編碼在作為 mRNA分子翻譯結(jié)果的新生多肽中存在的氨基酸的核苷酸序列。在真核生物中，編碼區(qū)在5’ 側(cè)以編碼起始物甲硫氨酸的核苷酸三聯(lián)體“ATG”為界并且在3’側(cè)以特定終止密碼子的3 種三聯(lián)體(即TAA、TAG、TGA)為界。除含有內(nèi)含子之外，基因的基因組形式也可以包含位于 RNA轉(zhuǎn)錄物中存在的序列的5’ -及3’ -端的序列。這些序列稱作“側(cè)翼”序列或區(qū)(這些側(cè)翼序列位于mRNA轉(zhuǎn)錄物上存在的非翻譯序列的5’或3’)。5’ -側(cè)翼區(qū)可以含有控制或影響基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。3’ -側(cè)翼區(qū)可以含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止、轉(zhuǎn)錄后剪切和聚腺苷酸化的序列?；パa(bǔ)的“互補(bǔ)的”或“互補(bǔ)性”指包含反平行核苷酸序列的兩個(gè)核苷酸序列，其中一旦在反平行核苷酸序列中的互補(bǔ)性堿基殘基之間形成氫鍵，則所述反平行核苷酸序列能夠相互配對(通過堿基配對原則)。例如，序列5，-AGT-3，與序列5，-ACT-3，互補(bǔ)。互補(bǔ)性可以是“部分的”或“全部的”。“部分”互補(bǔ)性是其中一個(gè)或多個(gè)核酸堿基根據(jù)堿基配對規(guī)則未匹配的情況。核酸分子之間的“全部”或“完全”互補(bǔ)性是其中每個(gè)核酸堿基按照堿基配對規(guī)則與另一個(gè)堿基匹配的情況。核酸分子鏈之間互補(bǔ)性的程度對核酸分子鏈之間雜交的效率和強(qiáng)度具有明顯影響。如本文中所用的核酸序列“互補(bǔ)物”指這樣的核苷酸序列， 其核酸分子顯示與該核酸序列的核酸分子的全部互補(bǔ)性。雙鏈RNA “雙鏈RNA”分子或“dsRNA”分子包含核苷酸序列的有義RNA片段和該核苷酸序列的反義RNA片段，二者均包含彼此互補(bǔ)的核苷酸序列，因而允許有義RNA片段和反義RNA片段配對并形成雙鏈RNA分子。內(nèi)源的“內(nèi)源的”核苷酸序列指存在于未轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的基因組中的核苷酸序列。增強(qiáng)的表達(dá)“增強(qiáng)”或“增加”核酸分子在植物細(xì)胞中的表達(dá)在本文中同等地使用，并且意指該核酸分子在應(yīng)用本發(fā)明方法之后在植物、植物部分或植物細(xì)胞中的表達(dá)水平比其在應(yīng)用該方法之前在植物、植物部分或植物細(xì)胞中的表達(dá)更高，或與缺少本發(fā)明重組核酸分子的參照植物相比更高。例如，參照植物包含僅缺少相應(yīng)NEENA的相同構(gòu)建體。如本文中所用的術(shù)語“增強(qiáng)”或“增加”是同義的，并且在本文中意指待表達(dá)的核酸分子的更高、優(yōu)選地顯著更高的表達(dá)。如本文中所用的，“增強(qiáng)”或“增加”某物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、mRNA或 RNA)的水平意指相對于基本上相同條件下培育的、缺少本發(fā)明重組核酸分子(例如缺少本CN 102482684 A說明書10/38
發(fā)明的NEENA分子、重組構(gòu)建體或重組載體)的基本上相同植物、植物部分或植物細(xì)胞，該水平增加。如本文中所用的，“增強(qiáng)”或“增加”某物質(zhì)(例如由靶基因表達(dá)的前RNA、mRNA、 rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA和/或由其編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物)的水平意指相對于缺少本發(fā)明重組核酸分子的細(xì)胞或生物，該水平增加50%或更多，例如100%或更多，優(yōu)選地200%或更多，更優(yōu)選地5倍或更多倍，甚至更優(yōu)選地10倍或更多倍，最優(yōu)選地20倍或更多倍，例如50倍?？梢酝ㄟ^技術(shù)人員熟悉的方法測定所述增強(qiáng)或增加。因而，可以例如通過蛋白質(zhì)的免疫學(xué)檢測法確定核酸或蛋白質(zhì)量的增強(qiáng)或增加。另外，可以使用技術(shù)如蛋白質(zhì)測定法、熒光法、RNA雜交法、核酸酶保護(hù)測定法、逆轉(zhuǎn)錄法(定量RT-PCR)、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定法)、蛋白質(zhì)印跡法、放射免疫測定法(RIA)或其他免疫測定法和熒光激活的細(xì)胞分析(FACQ來測量植物或植物細(xì)胞中的特定蛋白質(zhì)或RNA。取決于所誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的類型，也可以確定其活性或?qū)ι锘蚣?xì)胞表型的影響。用于確定蛋白質(zhì)數(shù)量的方法是技術(shù)人員已知的。可以提到的實(shí)例是微量Biuret法(Goa J(1953) Scand J Clin Lab Invest 5 218-222)、Folin-Ciocalteau 法(Lowry OH 等人(1951) J Biol Chem 193:265-275)或測量 CBB G-250 的吸光度(Bradford MM(1976)Analyt Biochem 72 :248-254) 作為用于量化蛋白質(zhì)的活性的一個(gè)實(shí)例，在下文實(shí)施例中描述螢光素酶活性檢測法。表達(dá)“表達(dá)”指基因產(chǎn)物的生物合成，優(yōu)選地指細(xì)胞中核苷酸序列例如內(nèi)源基因或異源基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，在結(jié)構(gòu)基因的情況下，表達(dá)涉及結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄成mRNA 并且任選地隨后mRNA翻譯成一種或多種多肽。在其他情況下，表達(dá)可以僅指攜帶RNA分子的DNA的轉(zhuǎn)錄。表達(dá)構(gòu)建體如本文中所用的“表達(dá)構(gòu)建體”意指能夠指導(dǎo)特定核苷酸序列在適宜植物部分或植物細(xì)胞中表達(dá)的DNA序列，該DNA序列包含在導(dǎo)入此DNA序列的所述植物部分或植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子與任選地有效連接至終止信號的目的核苷酸序列有效連接。如果需要翻譯，該DNA序列一般還包含為正確翻譯所述核苷酸序列所需的序列。編碼區(qū)可以編碼目的蛋白，但也可以以有義或反義方向編碼功能性目的RNA，例如 RNAa, siRNA、snoRNA、snRNA、microRNA、ta-siRNA或任何其他非編碼的調(diào)節(jié)性RNA。包含目的核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體可以是嵌合的，這意指該表達(dá)構(gòu)建體的組件中一者或多者相對于該表達(dá)構(gòu)建體的其他組件中一者或多者是異源的。該表達(dá)構(gòu)建體也可以是一種這樣的表達(dá)構(gòu)建體，它天然地存在，但已經(jīng)以用于異源表達(dá)的重組形式獲得。然而，一般而言，該表達(dá)構(gòu)建體相對于宿主是異源，即，該表達(dá)構(gòu)建體的特定DNA序列不天然存在于宿主細(xì)胞中并且必須已經(jīng)通過轉(zhuǎn)化事件導(dǎo)入宿主細(xì)胞或該宿主細(xì)胞的祖先中。該表達(dá)構(gòu)建體中的核苷酸序列的表達(dá)可以處于組成型啟動(dòng)子或處于僅在宿主細(xì)胞暴露于一些特定外部刺激時(shí)才啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。在植物的情況下，該啟動(dòng)子也可以是針對特定組織或器官或發(fā)育階段特異的。外來術(shù)語“外來”指任何核酸分子(例如，基因序列)，所述核酸分子通過實(shí)驗(yàn)操作導(dǎo)入細(xì)胞的基因組中并且可以包括該細(xì)胞中存在的序列，只要導(dǎo)入的序列含有一些修飾 (例如，點(diǎn)突變、存在可選擇標(biāo)記基因等)和因此相對于天然存在序列是不同的。功能性連接將術(shù)語“功能性連接”或“功能性連接的”理解為意指例如調(diào)節(jié)性元件(例如啟動(dòng)子)與待表達(dá)的核酸序列并且根據(jù)需要與其他調(diào)節(jié)性元件(例如，終止子或 NEENA)以如此方式依次排列，從而每種調(diào)節(jié)性元件可以履行其目的功能以允許、修飾、促進(jìn)或影響所述核酸序列的表達(dá)。作為同義詞，可以使用“有效連接”或“有效連接的”?？梢愿鶕?jù)所述核酸序列相對于有義或反義RNA的排列，產(chǎn)生表達(dá)。為此目的，不是必需要求化學(xué)意義上的直接連接。遺傳控制序列例如增強(qiáng)子序列也能夠從遠(yuǎn)離的位置或甚至從其它DNA分子對靶序列產(chǎn)生其作用。優(yōu)選的排列是這樣的排列，其中待表達(dá)的核酸序列重組地位于充當(dāng)啟動(dòng)子的序列之后，從而這兩個(gè)序列相互共價(jià)地連接。該啟動(dòng)子序列與待重組表達(dá)的核酸序列之間的距離優(yōu)選地小于200堿基對、特別優(yōu)選地小于100堿基對、非常特別優(yōu)選地小于 50堿基對。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，待轉(zhuǎn)錄的核酸序列以如此方式位于啟動(dòng)子之后，其中轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)與本發(fā)明嵌合RNA的合乎需要的開端相同。功能性連接和表達(dá)構(gòu)建體可以借助如 (例如，在Maniatis TiFritsch EF禾口Sambrook J(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第二片反，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) ；Silhavy 等人(1984)Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) ；Ausubel 等人(1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience ；Gelvin 等人(編著)(1990)Plant Molecular Biology Manual ；Kluwer Academic Publisher，Dordrecht，The Netherlands) 所述的慣用重組和克隆技術(shù)產(chǎn)生。然而，其他序列，例如充當(dāng)帶限制性酶特定切割位點(diǎn)的接頭或充當(dāng)信號肽的序列，也可以位于這兩個(gè)序列之間。序列的插入也可以導(dǎo)致融合蛋白的表達(dá)。優(yōu)選地，由調(diào)節(jié)性區(qū)域例如啟動(dòng)子和待表達(dá)核酸序列的連接組成的表達(dá)構(gòu)建體可以以載體整合的形式存在并且被插入植物基因組，例如通過轉(zhuǎn)化法。基因術(shù)語“基因”指與能夠以某種方式調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物(例如，多肽或功能性RNA) 表達(dá)的適宜調(diào)節(jié)序列有效連接的區(qū)域。基因包括DNA中位于編碼區(qū)(可讀框，0RF)之前 (上游)和之后(下游)的不翻譯的調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、阻抑物等)，以及在可用的情況下，在各個(gè)編碼區(qū)(例如外顯子)之間的間插序列(例如內(nèi)含子)。如本文中所用的術(shù)語“結(jié)構(gòu)基因”意圖指轉(zhuǎn)錄成mRNA的DNA序列，其中所述的mRNA隨后翻譯成作為具體多肽的特征的氨基酸序列。基因組和基因組DNA 術(shù)語“基因組”或“基因組DNA，，指宿主生物的可遺傳信息。 所述基因組DNA包括胞核的DNA(也稱作染色體DNA)，還包括質(zhì)體(例如，葉綠體)和其他細(xì)胞器(例如，線粒體)的DNA。優(yōu)選地，術(shù)語“基因組”或“基因組DNA”指胞核的染色體 DNA。異源的就核酸分子或DNA而言，術(shù)語“異源的”指這樣的核酸分子，所述核酸分子有效連接于，或受到操作以變得有效連接于自然界中不與該核酸分子有效連接或自然界中與該核酸分子在不同位置有效連接的第二種核酸分子。包含核酸分子和與之連接的一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)性核酸分子(如啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止信號)的異源表達(dá)構(gòu)建體例如是源自實(shí)驗(yàn)操作的構(gòu)建體，在所述構(gòu)建體中，a)所述核酸分子或b)所述調(diào)節(jié)性核酸分子或c) 二者(即 (a)和(b))不位于其天然(原有)遺傳環(huán)境中或已經(jīng)因?qū)嶒?yàn)操作受到修飾，修飾的實(shí)例是一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基的置換、添加、缺失、倒位或插入。天然遺傳環(huán)境指源生物中的天然染色體基因座或指存在于基因組文庫中。在基因組文庫的情況下，優(yōu)選地保留，至少部分地保留該核酸分子的序列的天然遺傳環(huán)境。該環(huán)境分布在所述核酸序列的至少一側(cè)并且具有至少50bp，優(yōu)選地至少500bp，特別優(yōu)選地至少1，OOObp,非常特別優(yōu)選地至少5，OOObp序列長度。天然存在的表達(dá)構(gòu)建體例如啟動(dòng)子與相應(yīng)基因的天然存在組合-在通過非天然的
14合成性“人工”方法例如誘變法修飾時(shí)變成轉(zhuǎn)基因表達(dá)構(gòu)建體。已經(jīng)描述了此類方法(US 5，565，350 ；WO 00/15815)。例如，與啟動(dòng)子有效連接的編碼蛋白質(zhì)的核酸分子相對于該啟動(dòng)子視為異源，其中所述的啟動(dòng)子不是該核酸分子的天然啟動(dòng)子。優(yōu)選地，異源DNA相對于導(dǎo)入該異源DNA的細(xì)胞不是內(nèi)源的或不天然與該細(xì)胞相關(guān)，但是已經(jīng)從另一種細(xì)胞獲得或已經(jīng)合成。異源DNA還包括含有一些修飾的內(nèi)源DNA序列、不天然存在的多拷貝內(nèi)源DNA 序列或這樣的DNA序列，該DNA序列不與同物理連接于所述DNA序列的另一個(gè)DNA序列天然接合。通常地但不是必需地，異源DNA編碼在細(xì)胞中表達(dá)的RNA或蛋白質(zhì)，而所述RNA或蛋白質(zhì)正常情況下不被所述細(xì)胞產(chǎn)生。高表達(dá)組成型啟動(dòng)子如本文中所用的“高表達(dá)組成型啟動(dòng)子”意指在植物或其部分中引起組成型表達(dá)的啟動(dòng)子，其中衍生自處于相應(yīng)啟動(dòng)子控制下的核酸分子中的RNA積累或合成速率或RNA穩(wěn)定性比缺少本發(fā)明NEENA的啟動(dòng)子所引起的表達(dá)更高，優(yōu)選地顯著更高。優(yōu)選地，相對于缺少本發(fā)明NEENA的組成型啟動(dòng)子，RNA的量和/或RNA合成速率和 /或RNA穩(wěn)定性增加50%或更大，例如100%或更多，優(yōu)選地200%或更多，更優(yōu)選地5倍或更多倍，甚至更優(yōu)選地10倍或更多倍，最優(yōu)選地20倍或更多倍，例如50倍。雜交如本文中所用，術(shù)語“雜交”包括“核酸分子的鏈通過堿基配對作用與互補(bǔ)鏈結(jié)合的任意過程”。(J. Coombs (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York)。雜交和雜交的強(qiáng)度(即，核酸分子之間結(jié)合的強(qiáng)度)受此類因素影響，如核酸分子之間的互補(bǔ)性程度、所涉及條件的嚴(yán)格性、所形成雜合體的Tm和核酸分子內(nèi)部的G C 比。如本文中所用，術(shù)語“Tm”用來指“解鏈溫度”。解鏈溫度是雙鏈核酸分子群體一半解離成單鏈的溫度。用于計(jì)算核酸分子的Tm的等式是本領(lǐng)域熟知的。如標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)所示，當(dāng)核酸分子處于IM NaCl的水溶液中時(shí)，可以通過等式Tm = 81. 5+0. 41 (% G+C)計(jì)算來進(jìn)行 Tm 值的簡單估計(jì)[見例如，Anderson 禾口 Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)]。其他參考文獻(xiàn)包括更復(fù)雜計(jì)算法，這些算法考慮了結(jié)構(gòu)特征及序列特征以計(jì)算Tm。嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可以在Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons，N. Y. (1989) ,6. 3. 1—6. 3. 6 中找到?！巴恍浴痹诒容^兩個(gè)或多個(gè)核酸或氨基酸分子使用時(shí)，“同一性”意指所述分子的序列共有某種程度的序列相似性，即所述序列是部分相同的。為確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸分子的同一性(同源性在本文可互換地使用) 百分?jǐn)?shù)，將所述序列以一個(gè)序列在另一個(gè)序列下的方式書寫以最佳比較(例如，可以將空位插入蛋白質(zhì)的序列或核酸的序列，旨在與另一種蛋白質(zhì)或另一種核酸產(chǎn)生最佳比對)。隨后在對應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置處比較氨基酸殘基或核酸分子。當(dāng)一個(gè)序列中的位置由另一個(gè)序列中對應(yīng)位置處的相同氨基酸殘基或相同核酸分子占據(jù)時(shí)，則所述分子在這個(gè)位置處是同源的(即，如本上下文中所用的氨基酸或核酸“同源性”對應(yīng)于氨基酸或核酸“同一性”。這兩個(gè)序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)是所述序列共有的相同位置的數(shù)值的函數(shù)(即同源性百分?jǐn)?shù)=相同位置的數(shù)值/位置總數(shù)X100)。術(shù)語“同源性”和“同一性”因而視為同義詞。為確定兩個(gè)或多個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)或多個(gè)核苷酸序列的同一性百分?jǐn)?shù)，已經(jīng)開發(fā)了幾個(gè)計(jì)算機(jī)軟件程序。兩個(gè)或更多序列的同一性可以用例如軟件fasta計(jì)算，其中軟件 fasta 已經(jīng)以 fasta 3 版本使用(W. R. Pearson 和 D. J. Lipman, PNAS 85,2444(1988)；W. R. Pearson, Methods in Enzymology 183,63(1990) ；W. R. Pearson 禾口 D. J. Lipman，PNAS 85,2444(1988) ；W. R. Pearson,Enzymology 183，63 (1990))。用于計(jì)算不同序列的同一性的另一種有用程序是標(biāo)準(zhǔn)blast程序，其中該程序包含于Biomax pedant軟件(聯(lián)邦德國慕尼黑Biomax)中。不幸地，該程序有時(shí)產(chǎn)生次優(yōu)結(jié)果，因?yàn)閎last不總是包含主題和查詢對象的完整序列。然而，由于該程序非常高效，因而它可以用于龐大數(shù)目序列的比較。以下設(shè)置通常用于這樣的序列比較 -ρ程序名稱[字符串]；-d數(shù)據(jù)庫[字符串]；默認(rèn)=nr ；-i查詢文件[File In]；默認(rèn)=stdin ；-e期望值(E) [Real]；默認(rèn)=10. O ；-m比對瀏覽選項(xiàng)0 =配對；1 =查詢-比上區(qū)域(query-anchored)，顯示同一性；2 =查詢-比上區(qū)域，不顯示同一性；3 =查詢-比上區(qū)域的屏文形式，顯示同一性；4 =查詢-比上區(qū)域的屏文形式，不顯示同一性；5 =查詢-比上區(qū)域，不顯示同一性和突然結(jié)束；6 =查詢-比上區(qū)域的屏文形式，不顯示同一性和突然結(jié)束；7 = XML Blast輸出；8 = TAB格式輸出；9帶注釋行的TAB格式輸出[整數(shù)]；默認(rèn)=O ；-ο BLAST報(bào)告輸出文件[File Out]任選；默認(rèn)=stdout ；-F過濾軟件查詢序列(DUST用blastn，SEG用其他方法)[字符串]；默認(rèn)=T ；-G空位開口成本(零激發(fā)默認(rèn)行為)[整數(shù)]；默認(rèn)=O ；-E開口延伸成本(零激發(fā)默認(rèn)行為)[整數(shù)]；默認(rèn)=O ；-X X空位比對的下降值(比特)(零激發(fā)默認(rèn)行為)；blastn 30，megablast 20，tblastx 0， 全部其他方法15[整數(shù)]；默認(rèn)=O ；-I在定義行中顯示GI' [T/F]；默認(rèn)=F;_q核苷酸錯(cuò)配罰分(僅blastn)[整數(shù)]；默認(rèn)=_3 ；-r核苷酸匹配回報(bào)(僅blastn)[整數(shù)]；默認(rèn)=1 ；-ν顯示對(V)的單-線描述的數(shù)據(jù)庫序列數(shù)[整數(shù)]；默認(rèn)=500 ；-b顯示對(B) 的比對結(jié)果的數(shù)據(jù)庫序列數(shù)[整數(shù)]；默認(rèn)=250 ；-f延伸命中的閾值，若為零，則默認(rèn)； blastpll, blastn O, blastx 12, tblastn 13 ；tblastx 13, megablast O[整數(shù)]；默認(rèn)= O ；-g執(zhí)行空位比對(對tblastx不可用)[T/F]；默認(rèn)=T ；-Q查詢使用的遺傳密碼[整數(shù)]；默認(rèn)=1;_D DB遺傳密碼子(僅用于tblast[nx])[整數(shù)]；默認(rèn)=1 使用的處理器數(shù)目[整數(shù)]；默認(rèn)=1 ；"O kqAlign文件[File Out]任選；-J相信查詢定義行[T/F]； 默認(rèn)=F ；-M矩陣[字符串]；默認(rèn)=BL0SUM62 ；-W字大小，如果為零，則默認(rèn)(blastn 11， megablast 28，全部其他方法3)[整數(shù)]；默認(rèn)=O ；-z數(shù)據(jù)庫的有效長度(對于真實(shí)大小， 使用零)[Real]；默認(rèn)=O ；-K來自保持區(qū)域的最佳命中數(shù)(默認(rèn)關(guān)閉；若使用，則推薦值為 100)[整數(shù)]；默認(rèn)=0;-P O用于多重命中；1用于單一命中[整數(shù)]；默認(rèn)=0;-Y搜索空間的有效長度(對真實(shí)大小，使用零)[Real]；默認(rèn)=O ；-S針對數(shù)據(jù)庫搜索的查詢鏈(對于 blast [nx]和tblastx) ；3用于兩者，1是頂端，2是底部[整數(shù)]；默認(rèn)=3 ；-T產(chǎn)生HTML輸出結(jié)果[T/F]；默認(rèn)=F ；-1限制數(shù)據(jù)庫搜索至GI ’ s列表[字符串]任選；-U使用FASTA 序列的較低事件過濾作用[T/F]任選；默認(rèn)=F ；-y無空位延伸的X下降值(比特)(0. O激發(fā)默認(rèn)行為)；blastn 20,megablast 10，全部其他方法7 [Real]；默認(rèn)=0. O ；-Z最終空位比對的X下降值(比特)(0. O激發(fā)默認(rèn)行為)；blastn/megablast50, tblastx 0，全部其他方法25 [整數(shù)]；默認(rèn)=O ；-R PSI-TBLASTN檢查點(diǎn)文件[File In]任選；_n MegaBlast搜索[T/F]；默認(rèn)=F ；-L查詢序列上的位置[字符串]任選；-A多重命中窗口大小，如果為零，則默認(rèn)(blastn/megablast 0，全部其他方法40[整數(shù)]；默認(rèn)=0 移碼罰分(00F算法用于blastx)[整數(shù)]；默認(rèn)=0 ；-t允許tblastn中用于聯(lián)系HSP的最大內(nèi)含子的長度 (0取消連接聯(lián)系)[整數(shù)]；默認(rèn)=0。
通過使用Needleman和Wunsch或者Smith和Waterman算法獲得高質(zhì)量的結(jié)果。因而，優(yōu)選基于所述算法的程序。有利地，可以用程序PileUp(J. Mol. Evolution.， 25,351 (1987), Higgins 等人，CABIOS 5,151(1989))或優(yōu)選地用均基于 Needleman 和 Wunsch 算法(J. Mol. Biol. 48 ；443 (1970))的程序 “Gap” 與 “Needle” 和基于 Smith 和 Waterman (Adv. App 1. Math. 2 ； 482(1981))算法的"BestFit” 進(jìn)行序列的比較。“Gap” 禾口 "BestFit"是 GCG 軟件包[Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA53711 (1991) ；Altschul 等人(Nucleic Acids Res. 25，3389(1997))， "Needle” 是歐洲分子生物學(xué)開放軟件包(The European Molecular Biology Open Software Suite(EMBOSS))的部分(Trends in Genetics 16 (6)，276 (2000))。因而，優(yōu)選地，用程序“Gap”或“Needle”在所述序列的整個(gè)范圍內(nèi)進(jìn)行確定序列同一性百分?jǐn)?shù)的計(jì)算。用于比較核酸序列的以下標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整用于“Needle”:矩陣EDNAFULL，空位罰分10. 0，延伸罰分0. 5。用于比較核酸序列的以下標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整用于“Gap”:空位權(quán)重50，長度權(quán)重3，平均匹配10. 000，平均錯(cuò)配0. 000。例如，將聲稱在核酸水平與序列SEQ ID NO 1具有80 %同一性的序列理解為意指，通過上述程序“Needle”以設(shè)置的上述參數(shù)與序列SEQ ID NO :1所代表的序列比較時(shí)具有80%同一性的序列。優(yōu)選地，在查詢序列例如SEQ ID NO :1的完整長度上計(jì)算同一性。內(nèi)含子指基因內(nèi)部的DNA區(qū)段(間插序列)，該DNA區(qū)段不編碼該基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的部分，并且從該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA中在該mRNA從細(xì)胞核輸出之前剪切下來。內(nèi)含子序列指內(nèi)含子的核酸序列。因而，內(nèi)含子是DNA序列的這些區(qū)域，它們隨編碼序列(外顯子)一起轉(zhuǎn)錄但是在成熟mRNA形成期間被除去。內(nèi)含子可以位于實(shí)際編碼區(qū)內(nèi)部或位于前mRNA(未剪接的mRNA)的5’或3’非翻譯前導(dǎo)序列中。初級轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子被切下并且編碼序列同時(shí)且精確地連接以形成成熟的mRNA。內(nèi)含子和外顯子的交界形成剪接位點(diǎn)。 內(nèi)含子的序列始于⑶并止于AG。另夕卜，在植物中，已經(jīng)描述AU-AC內(nèi)含子的兩個(gè)實(shí)例來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的RecA樣蛋白基因第14內(nèi)含子和G5基因第7內(nèi)含子是AT-AC含子。含有內(nèi)含子的前mRNA具有3種短序列，連同其他序列，這些短序列對于精確剪接內(nèi)含子是必需的。這些序列是5’剪接位點(diǎn)、3’剪接位點(diǎn)和分支點(diǎn)。mRNA剪接是除去初級mRNA轉(zhuǎn)錄物中存在的間插序列(內(nèi)含子)并接合或連接外顯子序列。這又稱作順式剪接作用，所述順式剪接作用將相同RNA上的兩個(gè)外顯子接合，同時(shí)除去間插序列(內(nèi)含子)。內(nèi)含子的功能性元件包含由剪接體的特定蛋白質(zhì)組分(例如其剪接內(nèi)含子末端處的共有序列)識別并結(jié)合的序列。功能性元件與剪接體的相互作用導(dǎo)致從不成熟mRNA除去內(nèi)含子序列和外顯子序列的再接合。內(nèi)含子具有3種短序列，這些短序列對于精確剪接內(nèi)含子是必需的，但是并非足夠的。這些序列是5’剪接位點(diǎn)、3’剪接位點(diǎn)和分支點(diǎn)。分支點(diǎn)序列是在植物中剪接過程和剪接位點(diǎn)選擇方面重要的。分支點(diǎn)序列通常位于3’剪接位點(diǎn)上游10-60個(gè)核苷酸處。同基因的除可以因存在或不存在異源DNA序列而不同之外，在遺傳上相同的生物(例如植物)。分離的如本文中所用的術(shù)語“分離”意指材料已經(jīng)通過人工取出并且離開其原來的天然環(huán)境存在并且因此不是自然界的產(chǎn)物。分離的材料或分子(如DNA分子或酶)可以以純化的形式存在或可以存在于非天然環(huán)境中如例如存在于轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中。例如，活植物中存在的天然存在多核苷酸或多肽不是分離的，然而與該天然系統(tǒng)中一些或全部共存物質(zhì)分開的相同多核苷酸或多肽是分離的。此類多核苷酸可以是載體的一部分和/或此類多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，和是分離的，因?yàn)檫@種載體或組合物不是其最初環(huán)境的一部分。優(yōu)選地，術(shù)語“分離的”相對于核酸分子使用時(shí)，如在“分離的核酸序列”中， 指被鑒定并且與該核酸序列天然來源中通常與其接合的至少一種雜質(zhì)性核酸分子分開的核酸序列。分離的核酸分子是這樣的核酸分子，其在與自然界中找到該核酸分子的形式或環(huán)境不同的形式或環(huán)境下存在。相反，未分離的核酸分子是以其在自然界中存在的狀態(tài)所找到的核酸分子如DNA和RNA。例如，在宿主細(xì)胞染色體上相鄰基因附近找到給定的DNA序列(例如，基因)；作為與編碼多種蛋白質(zhì)的眾多其他mRNA的混合物，在細(xì)胞中找到RNA序列，如編碼特定蛋白質(zhì)的特定mRNA序列。然而，包含例如SEQ ID NO :1的分離的核酸序列包括例如在細(xì)胞中通常含有SEQ ID NO :1的此類核酸序列，其中所述核酸序列位于不同于天然細(xì)胞的染色體或染色體外位置中，或側(cè)翼分布有不同于自然界中存在的核酸序列。分離的核酸序列可以以單鏈或雙鏈形式存在。當(dāng)分離的核酸序列用來表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)，該核酸序列將最少含有有義鏈或編碼鏈的至少一部分(即，該核酸序列可以是單鏈的)。備選地， 它可以含有有義鏈和反義鏈(即，該核酸序列可以是雙鏈的)。最小啟動(dòng)子在缺少上游激活情況下無活性或啟動(dòng)子活性大大降低的啟動(dòng)子元件，尤其是TATA元件。在合適的轉(zhuǎn)錄因存在下，最小啟動(dòng)子發(fā)揮作用以引起轉(zhuǎn)錄。NEENA 參見“增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸”。非編碼術(shù)語“非編碼”指核酸分子中不編碼所表達(dá)蛋白質(zhì)的部分或全部的序列。 非編碼序列包括但不限于內(nèi)含子、增強(qiáng)子、啟動(dòng)子區(qū)、3’非翻譯區(qū)和5’非翻譯區(qū)。增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸(NEENA)術(shù)語“增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸”指這樣的序列和/或核酸分子，其是具有在與NEENA功能性連接的啟動(dòng)子的控制下增強(qiáng)核酸表達(dá)的內(nèi)在特性的特定序列。不同于啟動(dòng)子序列，NEENA本身不能驅(qū)動(dòng)表達(dá)。為了履行增強(qiáng)與NEENA功能性連接的核酸分子表達(dá)的職能，NEENA本身應(yīng)當(dāng)與啟動(dòng)子功能性連接。與本領(lǐng)域已知的增強(qiáng)子序列的區(qū)別在于，NEENA以順式方式而不以反式方式起作用，并且必需靠近待表達(dá)核酸的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)存在。核酸和核苷酸術(shù)語“核酸”和“核苷酸”指天然存在的或合成的或人工核酸或核苷酸。術(shù)語“核酸”和“核苷酸”包括處于單鏈或雙鏈、有義或反義形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其任何核苷酸類似物和聚合物或雜合體。除非另外說明，特定核酸序列也隱含地包括其保守方式修飾的變體(例如簡并密碼子置換)和互補(bǔ)序列，以及明確指出的序列。術(shù)語“核酸”在本文中與“基因”、“DNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”互換地使用。核苷酸類似物包括在堿基、糖和/或磷酸酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有修飾的核苷酸，所述修飾包括但不限于5-位置嘧啶修飾、8-位置嘌呤修飾、胞嘧啶環(huán)外環(huán)胺處的修飾、5-溴-尿嘧啶置換等；和2'-位置糖修飾，包括但不限于糖修飾的核糖核苷酸，其中2' -OH由選自 H、OR、R、鹵素、SH、SR、NH2、NHR、N 或CN的基團(tuán)替換。短發(fā)夾RNA(shRNA)也可以包含非天然元件如非天然堿基，例如，肌苷和黃嘌呤，非天然糖，例如，2'-甲氧基核糖，或非天然磷酸二酯鍵，例如甲基磷酸酯、硫代磷酸酯和肽。核酸序列短語“核酸序列”指從5’ -端至3’ -端讀取的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的單鏈或雙鏈聚合物。它包括染色體DNA、自我復(fù)制型質(zhì)粒、DNA或RNA的感染性聚合物、和主要發(fā)揮結(jié)構(gòu)性作用的DNA或RNA?！昂怂嵝蛄小币仓复砗塑账岬目s寫、字母、字符或字的連續(xù)串。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸可以是“探針”，所述探針是相對短的核酸，通常長度小于100個(gè)核苷酸。經(jīng)常地，核酸探針具有約50個(gè)核苷酸長度至約10個(gè)核苷酸長度。 核酸的“靶區(qū)域”是核酸中被鑒定為有目標(biāo)的部分。核酸的“編碼區(qū)”是核酸的部分，其中置于適宜的調(diào)節(jié)性序列控制下時(shí)，所述部分以序列特異性方式轉(zhuǎn)錄和翻譯以產(chǎn)生特定的多肽或蛋白質(zhì)。稱該編碼區(qū)編碼這種多肽或蛋白質(zhì)。寡核苷酸術(shù)語“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其模擬物的低聚物或聚合物，以及具有類似發(fā)揮作用的非天然存在部分的寡核苷酸。此類修飾或取代的寡核苷酸因合乎需要的特性，例如增強(qiáng)的細(xì)胞攝取、增強(qiáng)的核酸靶親和力和在核酸酶存在下增加的穩(wěn)定性而經(jīng)常優(yōu)選地勝過其天然形式。寡核苷酸優(yōu)選地包括通過鍵(例如，磷酸二酯鍵)或取代鍵(substitute linkage)相互共價(jià)偶聯(lián)的兩個(gè)或多個(gè)核苷酸單體 (nuc1eomonomer)0突出端“突出端”是雙鏈寡核苷酸分子的5’ -或3’ -羥基端上相對短的單鏈核苷酸序列(也稱作“延伸”、“伸出端”或“粘末端”)。植物通常理解為意指能夠光合作用的任何真核單細(xì)胞或多細(xì)胞生物或其細(xì)胞、組織、器官、部分或繁殖材料(如種子或果實(shí))。為本發(fā)明的目的，包括植物界(Plant Kingdom)的全部屬和物種的高等和低等植物。優(yōu)選地一年生、多年生、單子葉和雙子葉植物。該術(shù)語包括成熟植物、種子、幼苗和籽苗及其衍生部分、繁殖材料(如種子或微孢子)、 植物器官、組織、原生質(zhì)體、愈傷組織和其他培養(yǎng)物(例如細(xì)胞培養(yǎng)物)，和歸并成產(chǎn)生功能單元或結(jié)構(gòu)單元的任何其他類型的植物細(xì)胞。成熟植物指在除籽苗之外的任何目的發(fā)育階段的植物。籽苗指在早期發(fā)育階段的年幼不成熟植物。一年生、二年生、單子葉和雙子葉植物是用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)選宿主生物?；虻谋磉_(dá)在全部觀賞植物、用材樹或觀賞樹、花、切花、灌木或草坪草中是更進(jìn)一步有利的?？梢杂门e例方式、但非限制方式提到的植物是被子植物、苔蘚植物例如獐耳細(xì)辛屬(Hepaticae)(地錢類(liverwort))和蘚綱(Musci)(蘚類植物)；蕨類植物如蕨類、木賊類和石松類；裸子植物如松柏類植物、 蘇鐵植物、銀杏(ginkgo)和買麻藤科(Gnetaeae)植物；藻類如綠藻綱(Chlorophyceae)、 褐藻綱(Phaeophpyceae)、紅藻綱(Rhodophyceae)、粘藻綱(Myxophyceae)、黃藻綱 (Xanthophyceae) > iiig^ (Bacillariophyceae) ( iiig^l )禾0 (Euglenophyceae)。 優(yōu)選地用于食物或飼料目的的植物，如豆科(Leguminosae)如豌豆、苜蓿和大豆；禾本科 (Gramineae)如稻、玉米、小麥、大麥、高粱、黑麥、黑小麥或燕麥；傘形科(Umbelliferae)， 具體地是胡蘿卜屬(Daucus)(非常特別地是物種胡蘿卜(carota))和芹屬(Apium)(非常特別地是物種旱芹(Graveolens dulce (celery)))及眾多其它植物；茄科(Solanaceae)， 特別地是番茄屬(Lycopersicon)，非常特別地是物種番茄(tomato)，和茄屬(Solanum)， 非常特別地是物種馬鈴薯(tomato)和茄子(aubergine)和眾多其它植物(如煙草 (tcAacco))，和辣椒屬(Capsicum)，非常特別地是物種辣椒(Capsicum annum (pepper)) 物種及眾多其它植物；豆科(Leguminosae)，特別地是大豆屬(Glycine)，非常特別地是物種大豆(soybean)、苜蓿、豌豆、紫花苜蓿、菜豆或花生及眾多其它植物；和十字花科(Brassicacae)，特別地是蕓苔屬(Brassica)，非常特別地是物種歐洲油菜(oilseed rape)、蕓苔(beet)、甘藍(lán)(Brassica oleracea cv Tastie (卷心菜))、花椰菜(Brassicaoleracea cv Snowball Y (花挪菜))禾口花蓮甘藍(lán)(oleracea cv Emperor (broccoli))；禾口擬南芥屬，非常特別地是物種擬南芥及眾多其它植物；菊科(Compositae)，具體地是萵苣屬(Lactuca)，非常特別地是物種萵苣(lettuce)及眾多其它植物；菊科(Asteraceae)如向日葵、萬壽菊、萵苣或金盞花及眾多其它植物；葫蘆科(Cucurbitaceae)如甜瓜、西葫蘆/ 南瓜或夏南瓜，和亞麻。更優(yōu)選地是棉屬植物、甘蔗、大麻、亞麻、辣椒和多種樹、堅(jiān)果和藤本 (wine)物種。多肽術(shù)語“多肽”、“肽”、“寡肽”、“多肽”、“基因產(chǎn)物”、“表達(dá)產(chǎn)物”和“蛋白質(zhì)”在
文中互換地使用，用來指連續(xù)氨基酸殘基的聚合物或低聚物。前蛋白正常情況下靶向細(xì)胞器如葉綠體并且仍包含其轉(zhuǎn)運(yùn)肽的蛋白質(zhì)。初級轉(zhuǎn)錄物如本文中所用的術(shù)語“初級轉(zhuǎn)錄物”指基因的不成熟RNA轉(zhuǎn)錄物?！俺跫夀D(zhuǎn)錄物”例如仍包含內(nèi)含子和/或仍不包含聚腺苷酸尾或帽結(jié)構(gòu)和/或是缺少對其作為轉(zhuǎn)錄物正常發(fā)揮作用必需的其他修飾，例如修剪或編輯。啟動(dòng)子術(shù)語“啟動(dòng)子”或“啟動(dòng)子序列”是等同物并且如本文中所用的，指與目的核苷酸序列連接時(shí)能夠控制目的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄成RNA的DNA序列。此類啟動(dòng)子可以例如在以下公共數(shù)據(jù)庫中 http//www, grassius. org/grasspromdb. html、http://mendel. cs. rhul. ac. uk/mendel. php ？ topic = plantprom、http://ppdb. gene, nagoya-u. ac. jp/ cgi-bin/index. cgi找到。其中所列的啟動(dòng)子可以用于本發(fā)明的方法并且在此引用而包括。 啟動(dòng)子位于由該啟動(dòng)子控制轉(zhuǎn)錄成mRNA的目的核苷酸序列的5’ (即，上游)，靠近其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并且為RNA聚合酶和用于轉(zhuǎn)錄起始的其他轉(zhuǎn)錄因子的特異性結(jié)合提供位點(diǎn)。所述啟動(dòng)子包含靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)例如至少101Λ，例如51Λ或21Λ。它也可以包含靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至少1500bp，優(yōu)選地至少lOOObp，更優(yōu)選地至少500bp，甚至更優(yōu)選地至少400bp，至少 300bp，至少200bp或至少lOObp。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子包含靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至少50bp，例如至少25bp。啟動(dòng)子不包含外顯子和/或內(nèi)含子區(qū)或5’非翻譯區(qū)。啟動(dòng)子可以例如相對于相應(yīng)植物為異源或同源。如果多核苷酸序列源自外來物種，或如果來自相同物種，但從其原有形式中被修飾，則它相對于某生物或第二多核苷酸序列為“異源”。例如，與異源編碼序列有效連接的啟動(dòng)子指編碼序列來自不同于衍生該啟動(dòng)子的物種中，或， 如果來自相同物種，編碼序列與該啟動(dòng)子不天然接合(例如基因修飾的編碼序列或來自不同生態(tài)型或品種的等位基因)。合適的啟動(dòng)子可以源自其中應(yīng)當(dāng)出現(xiàn)表達(dá)的宿主細(xì)胞的基因或源自該宿主細(xì)胞的病原體(例如，植物或植物病原體如植物病毒)。植物特異性啟動(dòng)子是適于調(diào)節(jié)植物中表達(dá)的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子可以源自植物，也可以源自植物病原體，或它可以是由人設(shè)計(jì)的合成性啟動(dòng)子。如果啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，則轉(zhuǎn)錄的速率應(yīng)答于誘導(dǎo)劑而增加。另外，啟動(dòng)子可以以組織特異性或組織優(yōu)先的方式受到調(diào)節(jié)，從而它僅僅或優(yōu)勢地在特定組織類型如葉、根或分生組織中轉(zhuǎn)錄所接合的編碼區(qū)方面有活性。用于啟動(dòng)子時(shí)，術(shù)語“組織特異性”指這樣的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)目的核苷酸序列在特定類型的組織(例如，花瓣)中選擇性表達(dá)，同時(shí)相同目的核苷酸序列在不同類型組織(例如，根) 中相對缺少的表達(dá)。可以例如通過這樣的方式評價(jià)啟動(dòng)子的組織特異性將報(bào)道基因與該啟動(dòng)子序列有效連接以產(chǎn)生報(bào)道構(gòu)建體，將報(bào)道構(gòu)建體導(dǎo)入植物的基因組，從而該報(bào)道構(gòu)建體整合至所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物的每種組織中，并且檢測報(bào)道基因在轉(zhuǎn)基因植物的不同組織中的表達(dá)(例如，檢測mRNA、蛋白質(zhì)或由報(bào)道基因編碼的蛋白質(zhì)的活性)。相對于報(bào)道基因在其他組織中的表達(dá)水平，檢測到該報(bào)道基因在一種或多種組織中的更大表達(dá)水平表明該啟動(dòng)子對其中檢測到更大表達(dá)水平的組織是特異性的。用于啟動(dòng)子時(shí)，術(shù)語“細(xì)胞類型特異的”指這樣的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)目的核苷酸序列在特定類型的細(xì)胞中選擇性表達(dá)，同時(shí)相同目的核苷酸序列在相同組織內(nèi)部的不同類型細(xì)胞中相對缺少的表達(dá)。用于啟動(dòng)子時(shí)，術(shù)語“細(xì)胞類型特異的”還意指能夠促進(jìn)目的核苷酸序列在單一組織內(nèi)部的某區(qū)域中選擇表達(dá)的啟動(dòng)子。使用本領(lǐng)域熟知的方法，例如GUS活性染色法、GFP蛋白法或免疫組織化學(xué)染色法，可以評估啟動(dòng)子的細(xì)胞類型特異性。談及啟動(dòng)子或源自啟動(dòng)子的表達(dá)時(shí)，術(shù)語“組成型”意指能夠指導(dǎo)有效連接的核酸分子在刺激物(例如，熱休克、化學(xué)品、光等)不存在下在大部分植物組織和細(xì)胞中貫穿植物或植物部分的基本上整個(gè)生活期限轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。一般而言，組成型啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因在基本上任何細(xì)胞和任何組織中的表達(dá)。啟動(dòng)子特異性談及啟動(dòng)子時(shí)，術(shù)語“特異性”意指由相應(yīng)啟動(dòng)子引起的表達(dá)的樣式。特異性描述了植物或其部分的組織和/或發(fā)育狀態(tài)，在其中該啟動(dòng)子引起處于相應(yīng)啟動(dòng)子控制下的核酸分子表達(dá)。啟動(dòng)子的特異性也可以包含環(huán)境條件，在所述環(huán)境條件下可以激活或下調(diào)該啟動(dòng)子，如由生物脅迫或環(huán)境脅迫如寒冷、干旱、受傷或感染誘導(dǎo)或阻遏。純化如本文中所用，術(shù)語“純化的”指從其天然環(huán)境取出、分離或分開的分子，即核酸序列或氨基酸序列?！盎旧霞兓摹狈肿又辽?0%沒有、優(yōu)選地至少75%沒有和更優(yōu)選地至少90%沒有與它們天然結(jié)合在一起的其他組分。純化的核酸序列可以是分離的核酸序列。重組就核酸分子而言，術(shù)語“重組”指通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的核酸分子。重組核酸分子也可以包括本身不存在于自然界中但是被人修飾、改變、突變或操縱的分子。優(yōu)選地，“重組核酸分子”是在序列方面與天然存在的核酸分子有至少一個(gè)核酸不同的非天然存在的核酸分子?！爸亟M核酸分子”也可以包括“重組構(gòu)建體”，其包含不天然地以這種順序存在的一系列核酸分子，所述核酸分子優(yōu)選地有效地連接。用于產(chǎn)生所述重組核酸分子的優(yōu)選方法可以包括克隆技術(shù)、定向或非定向誘變法、合成或重組技術(shù)。有義術(shù)語“有義”理解為意指核酸分子，其具有與靶序列互補(bǔ)或相同的序列，例如與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和參與給定基因表達(dá)的序列。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，該核酸分子包含目的基因和允許表達(dá)該目的基因的元件。顯著的增加或減少大于測量技術(shù)中固有誤差幅度的增加或減少，例如在酶活性或在基因表達(dá)方面，優(yōu)選地是對照酶的活性或?qū)φ占?xì)胞中的表達(dá)增加或減少約2倍或更多，更優(yōu)選地增加或減少約5倍或更多，并且最優(yōu)選地增加或減少約10倍或更多。小核酸分子“小核酸分子”理解為由核酸或其衍生物如RNA或DNA組成的分子。 它們可以是雙鏈或單鏈的，并且其長度在約15和約30bp之間，例如在15和30bp之間，更優(yōu)選地在約19和約^bp之間，例如在19和^bp之間，甚至更優(yōu)選地在約20和約25bp之間，例如在20和25bp之間。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，寡核苷酸的長度在約21和約 24bp之間，例如在21和Mbp之間。在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，小核酸分子的長度是約 2Ibp 和約 24bp，例如 2Ibp 和 24bp?；旧匣パa(bǔ)的在最廣意義上，本文中就核苷酸序列相對于參比或靶核苷酸序列而言使用時(shí)，術(shù)語“基本上互補(bǔ)的”意指這樣的核苷酸序列，其具有在基本上互補(bǔ)的核苷酸序列和所述參比或靶核苷酸序列的完全互補(bǔ)序列之間至少60%，更希望地至少70%，更
21希望地至少80%或85%，優(yōu)選地至少90%，更優(yōu)選地至少93%，仍更優(yōu)選地至少95%或 96 %，仍舊更優(yōu)選地至少97 %或98 %，依舊更優(yōu)選地至少99 %或最優(yōu)選地100 %的同一性百分?jǐn)?shù)(后者等同于本上下文中的術(shù)語“同一的”)。優(yōu)選地，在至少19個(gè)核苷酸長度、優(yōu)選地至少50個(gè)核苷酸長度、更優(yōu)選地核酸序列的全部長度范圍內(nèi)針對所述參比核苷酸序列評估同一性(如果不是，則另外在下文說明)。使用威斯康辛大學(xué)GCG的默認(rèn)GAP分析， GAP 的 SEQWEB 應(yīng)用，基于 Needleman 和 Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch(1970) J Mol. Biol. 48 :443-453;如上文定義)實(shí)施序列比較。與參比核苷酸序列“基本上互補(bǔ)的”核苷酸序列與該參比核苷酸序列在低嚴(yán)格性條件、優(yōu)選地中等嚴(yán)格性條件、最優(yōu)選地高嚴(yán)格性條件(如上文定義)下雜交。轉(zhuǎn)基因如本文中所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”指通過實(shí)驗(yàn)操作導(dǎo)入細(xì)胞的基因組中的任何核酸序列。轉(zhuǎn)基因可以是“內(nèi)源DNA序列”或“異源DNA序列”(即，“外來DNA”)。術(shù)語 “內(nèi)源DNA序列”指這樣的核苷酸序列，其天然存在于導(dǎo)入該核苷酸序列的細(xì)胞中，只要它相對于天然存在序列不含有一些修飾(例如，點(diǎn)突變、存在可選擇標(biāo)記基因等)。轉(zhuǎn)基因的當(dāng)提及生物時(shí)，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的”意指用重組DNA分子轉(zhuǎn)化生物，優(yōu)選地穩(wěn)定轉(zhuǎn)化生物，其中所述重組DNA分子優(yōu)選地包含與目的DNA序列有效連接的合適啟動(dòng)子。載體如本文中所用，術(shù)語“載體”指能夠運(yùn)輸已經(jīng)與之連接的另一個(gè)核酸分子的核酸分子。一種類型的載體是基因組整合的載體，或“整合的載體”，所述載體可以整合至宿主細(xì)胞的染色體DNA中。另一個(gè)類型的載體是游離型載體，即，能夠進(jìn)行染色體外復(fù)制的核酸分子。本文中將能夠指導(dǎo)與它們有效連接的基因表達(dá)的載體稱作“表達(dá)載體”。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”互換地使用，除非從上下文顯而易見并非如此。設(shè)計(jì)旨在體外或體內(nèi)產(chǎn)生如本文所述RNA的表達(dá)載體可以含有被任何RNA聚合酶識別的序列，所述的RNA聚合酶包括線粒體RNA聚合酶、RNA pol I、RNA pol II和RNA pol III。這些載體可以用來在根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄想要的RNA分子。將植物轉(zhuǎn)化載體理解為適用于植物轉(zhuǎn)化過程中的載體。野生型就生物、多肽或核酸序列而言，術(shù)語“野生型”、“天然”或“天然來源”意指所述生物是天然存在的或是在至少一種天然存在生物中可獲得的，其沒有被改變、突變或由人類操作。
實(shí)施例化學(xué)品和常用方法除非另外說明，如(Sambrook等人，1989)所述為本發(fā)明的目的進(jìn)行克隆過程，包括限制性消化、瓊脂糖凝膠電泳、核酸的純化、核酸的連接、細(xì)菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、選擇和培養(yǎng)。使用Sanger技術(shù)(Sanger等人，1977)，用激光熒光DNA測序儀(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)進(jìn)行重組DNA的序列分析。除非另外描述，從Sigma Aldrich (Sigma Aldrich, St. Louis, USA)、Promega (Madison, WI, USA)、Duchefa (Haarlem, The Netherlands)或hvitrogen (Carlskid，CA，USA)獲得化學(xué)品和試劑。限制性核酸內(nèi)切酶來自 New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)或 Roche Diagnostics GmbH(Penzberg, Germany) ο 寡核苷酸由 Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Germany)合成。實(shí)施例1 從具有組成型表達(dá)的基因鑒定增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸(NEENA)
1. 1從擬南芥(A. thaliana)基因鑒定NEENA分子使用公開可獲得的基因組DNA序列(例如http //www. ncbi. nlm. nih. gov/ genomes/PLANTS/PlantList. html)禾口轉(zhuǎn)錄物表達(dá)數(shù)據(jù)(例如 http //www, weigelworld. org/resources/microarray/AtGenExpress/)，選擇源自高度表達(dá)性組成型基因的擬南芥 (Arabidopsis thaliana)轉(zhuǎn)錄物中的一組18個(gè)潛在NEENA候選物用于詳細(xì)分析。此外，該分析中還包括源自歐芹的推定的NEENA分子。候選物命名如下表1 組成型 NEENA 候選物(NEENAc)。
權(quán)利要求
1.用于產(chǎn)生高表達(dá)組成型植物啟動(dòng)子的方法，包括將一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸 (NEENA)分子與啟動(dòng)子功能性連接，其中所述增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸(NEENA)分子相對于所述啟動(dòng)子是異源的，其包含i)具有如SEQID NO :1至19、優(yōu)選地SEQ ID NO :1至9中所定義序列的核酸分子，或ii)具有與SEQID NO 1至19、優(yōu)選地SEQ ID NO :1至9具備至少80%同一性的序列的核酸分子，或iii)i)或ii)的核酸分子的100個(gè)或更多連續(xù)堿基的片段，所述片段具有如具有SEQ ID NO 1至19、優(yōu)選地SEQ ID NO :1至9的序列的相應(yīng)核酸分子那樣的增強(qiáng)表達(dá)活性，或iv)作為前述在i)或ii)下提及的任一核酸分子的互補(bǔ)物或反向互補(bǔ)物的核酸分子，或ν)使用表 2 中所示的由 SEQ ID NO 20 至 57、優(yōu)選地 SEQ ID NO 20/21 ；26/27 ；30/31 ； 38/39 ；42/43 ；44/45 ；46/47 ；50 ；51和56/57描述的寡核苷酸引物，通過PCR可獲得的核酸分子，或vi)核酸分子，其在等同于50°C于7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5MNaP04UmM EDTA雜交，以及5(rC于2XSSC、0.1%SDS中洗滌的條件下與包含由SEQ ID NO 1至19、優(yōu)選地SEQ ID NO :1至9或其互補(bǔ)物描述的增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列的至少50個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸分子雜交。
2.用于產(chǎn)生植物或其部分的方法，所述植物或其部分與相應(yīng)的對照植物或其部分相比具有一種或多種核酸分子的增強(qiáng)的組成型表達(dá)，所述方法包括步驟a)將包含權(quán)利要求1的i)至vi)中所定義核酸分子的一個(gè)或多個(gè)NEENA導(dǎo)入所述植物或其部分；禾口b)將所述一個(gè)或多個(gè)NEENA與組成型啟動(dòng)子和與處在所述組成型啟動(dòng)子控制下的核酸分子功能性連接，其中NEENA對所述核酸分子為異源。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的方法，包括步驟a)將包含權(quán)利要求1的i)至vi)中所定義核酸分子的一個(gè)或多個(gè)NEENA導(dǎo)入植物或其部分，和b)將所述一個(gè)或多個(gè)NEENA整合至所述植物或其部分的基因組中，從而所述一個(gè)或多個(gè)NEENA與相對所述一個(gè)或多個(gè)NEENA為異源的內(nèi)源組成型表達(dá)的核酸功能性連接，和任選地c)從所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生出包含所述一個(gè)或多個(gè)NEENA的植物或其部分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的方法，包括步驟a)提供包含一個(gè)或多個(gè)NEENA的表達(dá)構(gòu)建體，所述NEENA包含權(quán)利要求1的i)至vi) 中所定義的、與組成型啟動(dòng)子和與相對于所述一個(gè)或多個(gè)NEENA為異源并處在所述組成型啟動(dòng)子控制下的一種或多種核酸分子功能性連接的核酸分子，和b)將包含所述一個(gè)或多個(gè)NEENA的所述表達(dá)構(gòu)建體整合至所述植物或其部分的基因組中，和任選地c)從所述轉(zhuǎn)化的植物或其部分再生出包含所述一個(gè)或多個(gè)表達(dá)構(gòu)建體的植物或其部分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4所述的方法，其中所述植物是單子葉或雙子葉植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物，其中所述植物是雙子葉植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的植物，其中所述植物是單子葉植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)NEENA與靠近所述異源核酸分子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的組成型啟動(dòng)子功能性連接。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)NEENA與距離所述異源核酸分子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)2500bp或更少、優(yōu)選地2000bp或更少、更優(yōu)選地1500bp或更少、甚至更優(yōu)選地IOOObp或更少并且最優(yōu)選地500bp或更少的組成型啟動(dòng)子功能性連接。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)NEENA與核酸分子的翻譯起始位點(diǎn)上游的組成型啟動(dòng)子功能性連接，所述核酸分子的表達(dá)處在所述組成型啟動(dòng)子的控制下。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10所述的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)NEENA與核酸分子的5’UTR 內(nèi)部的組成型啟動(dòng)子功能性連接，所述核酸分子的表達(dá)處在所述組成型啟動(dòng)子的控制下。
12.包含一個(gè)或多個(gè)NEENA的重組表達(dá)構(gòu)建體，所述的NEENA包含權(quán)利要求1的i)至 vi)中所定義的核酸分子。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的包含一個(gè)或多個(gè)NEENA的重組表達(dá)構(gòu)建體，其包含權(quán)利要求1的i)至vi)中所定義的核酸分子，所述核酸分子與一個(gè)或多個(gè)組成型啟動(dòng)子和與相對于所述一個(gè)或多個(gè)NEENA為異源的一種或多種表達(dá)的核酸分子功能性連接。
14.重組表達(dá)載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的一個(gè)或多個(gè)重組表達(dá)構(gòu)建體。
15.轉(zhuǎn)基因植物或其部分，其包含權(quán)利要求1的i)至vi)中所定義的一種或多種異源 NEENA。
16.轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物或其部分，其包含權(quán)利要求14中所述的重組表達(dá)載體或根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的重組表達(dá)構(gòu)建體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物或其部分，其選自或衍生自細(xì)菌、 真菌、酵母或植物。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的轉(zhuǎn)基因植物或其部分，其中所述植物或其部分是雙子葉植物。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的轉(zhuǎn)基因植物或其部分，其中所述植物或其部分是單子葉植物。
20.衍生自根據(jù)權(quán)利要求15至19所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或植物或其部分的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)物、轉(zhuǎn)基因種子、部分或繁殖材料，其包含權(quán)利要求1的i)至vi)中所定義的所述異源 NEENA、權(quán)利要求12或13的重組表達(dá)構(gòu)建體或權(quán)利要求14的重組載體。
21.權(quán)利要求1的i)至vi)中所定義的NEENA或權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)所定義的重組構(gòu)建體或重組載體的用途，用于增強(qiáng)在植物或其部分中的表達(dá)。
22.權(quán)利要求20中所述的衍生自轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或植物的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)物、轉(zhuǎn)基因種子、轉(zhuǎn)基因植物、部分或繁殖材料的用途，用于食物、動(dòng)物飼料、種子、藥物或精細(xì)化學(xué)品的生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域并且提供了用于產(chǎn)生高表達(dá)的組成型啟動(dòng)子的方法和產(chǎn)生具有增強(qiáng)的核酸組成型表達(dá)的植物的方法，其中將增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸(NEENAs)與所述啟動(dòng)子功能性連接和/或?qū)胫参镏小?br> 文檔編號C12N15/82GK102482684SQ201080038708
公開日2012年5月30日 申請日期2010年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月31日
發(fā)明者E·杜維尼哥, J·M·庫恩, L·P·洛亞爾, M·西伯特 申請人:巴斯夫植物科學(xué)有限公司