專利名稱：植物調(diào)節(jié)序列的制作方法
植物調(diào)節(jié)序列本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域并且涉及多種調(diào)節(jié)序列。特別地說，本發(fā)明涉及一 種調(diào)節(jié)核苷酸序列，該調(diào)節(jié)核苷酸序列的至少一部分具有指導(dǎo)將感興趣的可操作地連接的 編碼蛋白的多核苷酸表達(dá)到基本上所有植物組織上、但基本上排除了表達(dá)于該植物的繁殖 性結(jié)構(gòu)的組織中、特別地花粉和/或雄花穗的組織中的轉(zhuǎn)錄起始功能，從而沒有表達(dá)產(chǎn)物 以任何顯著的程度存在于所述組織中。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括與一種感興趣的編碼可表達(dá) 的蛋白的多核苷酸連接的所述調(diào)節(jié)序列的多種 嵌合基因以及表達(dá)盒并且分別地涉及包括 所述嵌合基因和表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物，這些嵌合基因和表達(dá)盒將感興趣的編碼蛋白的多核 苷酸表達(dá)于基本上所有植物組織中，但基本上排除表達(dá)于該植物的繁殖性結(jié)構(gòu)的組織中、 特別地花粉和/或雄花穗的組織中，從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織 中。
背景技術(shù)：
在許多農(nóng)作物例如玉米中，破壞性害蟲傾向于以營養(yǎng)性組織例如葉、莖和根為食 并且還以繁殖性組織例如穗為食。用于保護(hù)植物免受害蟲的一種技術(shù)是使用化合物。一種 替代的技術(shù)涉及基因重組，其中一個或多個基因被引入該植物中以表達(dá)蛋白產(chǎn)物，這些蛋 白產(chǎn)物直接或間接地涉及這些害蟲生物的防治。目前通過基因重組所生產(chǎn)的蛋白產(chǎn)品是組 成型表達(dá)的，即貫穿該植物一生在所有時間并且在大多數(shù)組織和器官中表達(dá)。這類蛋白產(chǎn) 品或者應(yīng)答于特定的刺激物或者局限于特定的細(xì)胞或組織亦被特異性地表達(dá)。相比之下， 本發(fā)明包括將感興趣的蛋白或多核苷酸表達(dá)于基本上所有植物組織中，但基本上排除表達(dá) 于該植物的繁殖性結(jié)構(gòu)的組織、特別地該花粉和/或雄花穗的組織中，從而沒有表達(dá)產(chǎn)物 以任何顯著的程度存在于所述組織中。幾種昆蟲控制性狀基因靶向發(fā)育的幼蟲階段。在某些情況下，這些蛋白還影響非 預(yù)期的昆蟲，這些昆蟲不是玉米害蟲，但偶爾以玉米花粉為食。這些昆蟲可以被在花粉組織 中表達(dá)的殺蟲蛋白傷害。在早期BT-玉米事件中這被看做問題，BT-玉米事件在花粉中具 有高殺蟲性的蛋白表達(dá)。通過開發(fā)替代的轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)，這個問題在后來的BT-玉米事 件中得以解決。這些最近的事件仍然有效地對抗目標(biāo)害蟲并且在花粉中積累較少的殺蟲蛋 白，但由于在花粉中存在殺蟲蛋白，這些最新的事件仍然被視為對非目標(biāo)害蟲具有潛在的 危害。在一些情況中，有用的昆蟲防治性狀基因還可以連累該植物的繁殖性結(jié)構(gòu)的發(fā) 育，像例如雄花穗。因此，提供排除了該轉(zhuǎn)基因表達(dá)于該植物的繁殖性結(jié)構(gòu)的組織(例如花粉和/或 雄花穗的組織)中的植物、特別地玉米植物，是令人希望的。這可以通過以下步驟在本發(fā)明 的范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)，即提供一種調(diào)節(jié)核苷酸序列，該調(diào)節(jié)核苷酸序列的至少一部分具有指導(dǎo)將 感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸表達(dá)于基本上所有植物組織上、但基本上排 除表達(dá)于該植物的雄性繁殖性結(jié)構(gòu)的組織中、特別地該花粉和/或雄花穗的組織中的轉(zhuǎn)錄 起始功能，從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于在所述組織中。然后可以使用這種 調(diào)節(jié)核苷酸序列來開發(fā)表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)能夠有效地將感興趣的多肽或蛋白(像例如一種殺蟲蛋白)累積于目標(biāo)害蟲正常地以之為食的組織中，并且消除或減少將該殺蟲蛋白 累積于非目標(biāo)組織或器官中和/或可能被感興趣的多肽或蛋白損害的那些組織中。發(fā)明概述 在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物包括被穩(wěn)定地整合入 其基因組中的嵌合多核苷酸構(gòu)建體、特別地嵌合構(gòu)建體，該嵌合構(gòu)建體包括感興趣的多核 苷酸、特別地感興趣的編碼多肽或蛋白的多核苷酸，該感興趣的編碼多肽或蛋白的多核苷 酸與調(diào)節(jié)核苷酸序列連接和/或處于其控制之下，該調(diào)節(jié)核苷酸序列的至少一部分具有一 種轉(zhuǎn)錄起始功能，該轉(zhuǎn)錄起始功能指導(dǎo)所述感興趣的編碼蛋白的多核苷酸表達(dá)于所述植物 的基本上所有組織、特別地目標(biāo)昆蟲正常地以之為食的組織中，但基本上排除該繁殖性植 物結(jié)構(gòu)的組織、特別地花粉和/或雄花穗的組織中，從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度 存在于所述組織中。在一個實(shí)施方案中，感興趣的多核苷酸、特別地感興趣的編碼多肽或蛋白的多核 苷酸，沒有以任何顯著的程度被轉(zhuǎn)錄于該繁殖性植物結(jié)構(gòu)的組織、特別地根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn) 基因植物的花粉和/或雄花穗組織中。因此，該感興趣的多核苷酸、特別地感興趣的編碼多 肽或蛋白的多核苷酸的表達(dá)基本上沒有出現(xiàn)在該雄性繁殖植物結(jié)構(gòu)的組織、特別地該花粉 和/或雄花穗的組織中，并且僅有殘留量的表達(dá)產(chǎn)物(如果有)可以在所述組織中被檢測 至IJ，該殘留量對于該表達(dá)產(chǎn)物是不足以在所述組織中(特別地，在該花粉和/或雄花穗的組 織中)實(shí)現(xiàn)它的想見的生物學(xué)功能的，并且因此也不能展示對以所述組織為食的昆蟲或?qū)?這些植物繁殖結(jié)構(gòu)的任何毒性影響。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，如在此所述提供了轉(zhuǎn)基因植物，其中嵌合多核苷酸 構(gòu)建體、特別地嵌合DNA構(gòu)建體，包括一種感興趣的多核苷酸、特別地一種感興趣的編碼多 肽或蛋白的多核苷酸，該感興趣的編碼多肽或蛋白的多核苷酸可操作地與一種調(diào)節(jié)核苷酸 序列連接和/或處于其可操作的控制之下，該調(diào)節(jié)核苷酸序列的至少一部分具有一種轉(zhuǎn)錄 起始功能并且可以從編碼肌動蛋白解聚因子3(ABP3)的基因中得到，該多肽或蛋白被高度 表達(dá)于該植物的大多數(shù)組織中但基本上排除花粉的組織中從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著 的程度存在于所述組織中。在一個實(shí)施方案中，所述肌動蛋白解聚因子3(ABP3)基因能夠從玉米中得到。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，如在此所述提供了轉(zhuǎn)基因植物，其中一種嵌合的多 核苷酸構(gòu)建體、特別地一種嵌合的DNA構(gòu)建體，包括一種感興趣的多核苷酸、特別地一種感 興趣的編碼多肽或蛋白的多核苷酸，該感興趣的編碼多肽或蛋白的多核苷酸可操作地與一 種調(diào)節(jié)核苷酸序列進(jìn)行連接和/或處于其可操作的控制之下，該調(diào)節(jié)核苷酸序列的至少一 部分具有一種轉(zhuǎn)錄起始功能并且可以從由DNA探針(特別地如SEQ ID NO :47至56中所述 的DNA序列的DNA探針)所表示的基因得到，該DNA探針在這些組織樣品中顯示一種信號 模式，該信號模式表明所述基因表達(dá)于所有組織中并且不或基本上不表達(dá)于花粉中。在一個實(shí)施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因 植物包括調(diào)節(jié)核苷酸序列或多核苷酸構(gòu)建體、特別地嵌合的多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合的多 核苷酸構(gòu)建體包括如在此所述的調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列的至少一部分具有一種轉(zhuǎn)錄起始功 能并且介導(dǎo)了將一種感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸表達(dá)于該植物的大多 數(shù)組織中但基本上排除花粉的組織之外從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中，該調(diào)節(jié)序列可以在PCR反應(yīng)中使用以下各項(xiàng)從玉蜀黍基因組DNA模板得到i)第一引物，該引物與如SEQ ID NO 1中所述的一種核苷酸序列(特別地SEQ ID NO 1的第一引物)具有至少90%，特別地至少91%，特別地至少92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%或99%序列同一性；或ii)第二引物，該引物與如SEQ ID NO :2中所述的一種核苷酸序列(特別地SEQ ID NO 2的第二引物)具有至少90%，特別地至少91%，特別地至少92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%或99%序列同一性；或iii)第一引物作為正向引物，該正向引物與如SEQ ID N0:1中所述的一種核苷 酸序列具有至少90%，特別地至少91%，特別地至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%序列同一性；并且第二引物作為反向引物，該反向引物與如SEQ ID NO :2中所 述的一種核苷酸序列具有至少90 %，特別地至少91 %，特別地至少92 %、93 %、94%、95 %、 96%、97%、98%或99%序列同一性，特別地SEQ ID NO :1的正向引物以及SEQ ID NO :2的 反向引物。 在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中提供該轉(zhuǎn)錄起始 功能的核苷酸序列具有與SEQ ID NO :13中所述的一種核苷酸序列至少80%至85%之間 的序列同一性(其中落在這個范圍內(nèi)的所有整數(shù)也被包括在其中)，特別地與SEQ ID NO 13中所述的一種核苷酸序列至少85%至90%之間的序列同一性(其中落在這個范圍內(nèi)的 所有整數(shù)也被包括在其中)，特別地與SEQ ID NO :13中所述的一種核苷酸序列至少90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，或其片段，并且其中所 述調(diào)節(jié)核苷酸序列或其片段介導(dǎo)了一種可操作地連接的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄、特別地一種 感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄從而所述感興趣的多核苷酸被轉(zhuǎn)錄 于大多數(shù)該植物的組織中但基本上排除該花粉的組織之外從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著 的程度存在于所述組織中。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中提供該轉(zhuǎn)錄起始 功能的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈能夠與SEQ ID NO: 13中所述的一種核苷酸序列進(jìn)行雜交，特別 地在中等程度雜交條件下，更特別地在嚴(yán)格雜交條件下，并且其中所述調(diào)節(jié)核苷酸序列介 導(dǎo)了一種可操作地連接的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄，特別地一種感興趣的可操作地連接的編碼 蛋白的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄，從而所述感興趣的多核苷酸被轉(zhuǎn)錄于大多數(shù)該植物的組織中但是 基本上排除轉(zhuǎn)錄于花粉的組織中從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中提供該轉(zhuǎn)錄起始 功能的核苷酸序列是SEQ ID NO :13中所述的序列或其片段，該片段作為轉(zhuǎn)錄起始序列仍然 展示全部的功能性。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn) 基因植物包括調(diào)節(jié)核苷酸序列或包含所述調(diào)節(jié)核苷酸序列的表達(dá)盒或多核苷酸構(gòu)建體，特 別地嵌合多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合多核苷酸構(gòu)建體包括所述調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列的至少 一部分具有一種可以從對一種肌動蛋白解聚因子3 (ABP3)進(jìn)行編碼的基因(特別地從玉米 肌動蛋白解聚因子3(ABP3)基因)得到的轉(zhuǎn)錄終止功能，該嵌合多核苷酸構(gòu)建體的調(diào)節(jié)序 列介導(dǎo)可操作地連接的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄，特別地感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的 多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄，從而所述感興趣的多核苷酸被轉(zhuǎn)錄于除花粉組織之外的該植物的大多數(shù)組織中但基本上排除在該花粉的組織之外，從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中，其中i)所述調(diào)節(jié)核苷酸序列包括轉(zhuǎn)錄終止序列，該轉(zhuǎn)錄終止序列與SEQID NO 14中所 述的一種核苷酸序列具有至少80%至85%之間的序列同一性，其中落在這個范圍內(nèi)的所 有整數(shù)也被包括其中，特別地至少85%至90%之間的序列同一性，其中落在這個范圍內(nèi)的 所有整數(shù)也被包括在其中，特別地至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%序列同一性；或其片段，該片段仍然展示終止序列的功能性；或ii)所述調(diào)節(jié)核苷酸序列的互補(bǔ)鏈與SEQ ID NO 14中所述的一種核苷酸序列進(jìn) 行雜交，特別地在中等程度的雜交條件下，更特別地在中等嚴(yán)格的雜交條件下，特別地在嚴(yán) 格的雜交條件下，并且介導(dǎo)了終止一種感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸的轉(zhuǎn) 錄；或iii)所述調(diào)節(jié)核苷酸序列具有如SEQ ID NO 14中所述的序列，包括其互補(bǔ)序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn) 基因植物包括調(diào)節(jié)核苷酸序列或包含所述調(diào)節(jié)核苷酸序列的表達(dá)盒或多核苷酸構(gòu)建體，特 別地嵌合的多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合的多核苷酸構(gòu)建體包括所述調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列的 至少一部分具有分別地(respectively) —種轉(zhuǎn)錄起始功能和一種終止功能，該嵌合的多 核苷酸構(gòu)建體的調(diào)節(jié)核苷酸序列可以從對一種肌動蛋白解聚因子3(ABP3)進(jìn)行編碼的基 因(特別地從玉米肌動蛋白解聚因子3(ABP3)基因)得到，該對一種肌動蛋白解聚因子 3 (ABP3)進(jìn)行編碼的基因被表達(dá)于大多數(shù)植物的組織中但基本上排除該花粉的組織之外從 而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中，該嵌合的多核苷酸構(gòu)建體的調(diào)節(jié)核 苷酸序列包括分別地轉(zhuǎn)錄起始序列和轉(zhuǎn)錄終止序列，這些序列與SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO 14中所述核苷酸序列分別地具有至少80%至85%之間的序列同一性，其中落在這個 范圍內(nèi)的所有整數(shù)也被包括在其中，特別地至少85%至90%之間的序列同一性，其中落在 這個范圍內(nèi)的所有整數(shù)也被包括在其中，特別地至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%或99%的序列同一性，或其片段，該片段分別地作為轉(zhuǎn)錄起始序列和終止 序列仍然展示全部的功能性。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的轉(zhuǎn)基因植 物，該轉(zhuǎn)基因植物包括調(diào)節(jié)核苷酸序列或包含所述調(diào)節(jié)核苷酸序列的表達(dá)盒或多核苷酸構(gòu) 建體，特別地嵌合的多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合的多核苷酸構(gòu)建體包括所述調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié) 序列的至少一部分分別地具有一種轉(zhuǎn)錄起始功能和一種終止功能，該嵌合的多核苷酸構(gòu)建 體的調(diào)節(jié)核苷酸序列可以從對一種肌動蛋白解聚因子3 (ABP3)進(jìn)行編碼的基因(特別地從 玉米肌動蛋白解聚因子3(ABP3)基因)得到，該嵌合的多核苷酸構(gòu)建體被表達(dá)于該植物的 大多數(shù)組織中但基本上排除該花粉的組織之外從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在 于所述組織中，并且該嵌合的多核苷酸構(gòu)建體的調(diào)節(jié)核苷酸序列包括如SEQ ID N0:13中所 述的轉(zhuǎn)錄起始序列和如SEQ ID NO: 14中所述的轉(zhuǎn)錄終止序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn) 基因植物包括調(diào)節(jié)核苷酸序列或包括所述調(diào)節(jié)核苷酸序列的表達(dá)盒或多核苷酸構(gòu)建體，特 別地嵌合的多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合的多核苷酸構(gòu)建體包括所述調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列的 至少一部分分別地具有一種轉(zhuǎn)錄起始功能和一種終止功能，該嵌合的多核苷酸構(gòu)建體的調(diào)節(jié)核苷酸序列可以從由DNA探針?biāo)硎镜幕?、特別地如SEQ ID NO :47至56中所述的DNA 序列的DNA探針得到，該DNA探針顯示在這些組織樣品中的信號模式，該信號模式表明所述 基因表達(dá)于所有組織中但不或基本上不表達(dá)于花粉中。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，如在此所述提供了轉(zhuǎn)基因植物，其中該嵌合多核苷 酸構(gòu)建體，特別地該嵌合DNA構(gòu)建體，包括一種感興趣的多核苷酸，特別地一種感興趣的編 碼多肽或蛋 白的多核苷酸，該感興趣的編碼多肽或蛋白的多核苷酸可操作地與一種調(diào)節(jié)核 苷酸序列連接和/或處于其可操作的控制之下，該調(diào)節(jié)核苷酸序列的至少一部分具有一種 轉(zhuǎn)錄起始功能并且可以從植物基因組DNA、特別地從玉米基因組DNA得到，該多肽或蛋白被 表達(dá)于該植物的大多數(shù)組織中但基本上排除雄花穗的組織中從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯 著的程度存在于所述組織中。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，如在此所述提供了轉(zhuǎn)基因植物，其中該嵌合多核苷 酸構(gòu)建體，特別地該嵌合DNA構(gòu)建體，包括一種感興趣的多核苷酸，特別地一種感興趣的編 碼多肽或蛋白的多核苷酸，該感興趣的編碼多肽或蛋白的多核苷酸可操作地與一種調(diào)節(jié)核 苷酸序列連接和/或處于其可操作的控制之下，該調(diào)節(jié)核苷酸序列的至少一部分具有一種 轉(zhuǎn)錄起始功能并且可以從一個由一個DNA探針(特別地如SEQ ID NO :57至79中所述的一 種DNA序列的DNA探針)所表示的基因得到，該DNA探針在這些組織樣品中顯示一種信號 模式，該信號模式表明所述基因表達(dá)于所有組織中并且不或基本上不表達(dá)于雄花穗的組織 中。在一個實(shí)施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因 植物包括調(diào)節(jié)核苷酸序列或包含所述調(diào)節(jié)核苷酸序列的表達(dá)盒或多核苷酸構(gòu)建體，特別地 嵌合的多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合的多核苷酸構(gòu)建體包括如在此所述的調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序 列可以在PCR反應(yīng)中使用以下各項(xiàng)從玉蜀黍基因組DNA模板得到i)第一引物，該引物與如SEQ ID NO :19中所述的一種核苷酸序列(特別地SEQ ID NO 19的引物)具有至少90%，特別地至少91%,特別地至少92%,93%,94%,95%,96%, 97%、98%或99%序列同一性；或ii)第二引物，該引物與如SEQ ID NO 20中所述的一種核苷酸序列(特別地SEQ ID N0:20的反向引物)具有至少90%，特別地至少91%，特別地至少92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%或 99%序列同一性；或iii)第一引物作為正向引物，該正向引物與如SEQ ID NO :19中所述的一種核苷 酸序列具有至少90%，特別地至少91%，特別地至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%序列同一性；并且第二引物作為反向引物，該反向引物與如SEQ ID NO :20中所 述的一種核苷酸序列具有至少90 %，特別地至少91 %，特別地至少92 %、93 %、94%、95 %、 96%、97%、98%或99%序列同一性；特別地SEQ ID NO :19的正向引物以及SEQ ID NO 20 的反向引物。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中提供該轉(zhuǎn)錄起始 功能的核苷酸序列具有與SEQ ID NO 35中所述的一種核苷酸序列至少80%至85%之間 的序列同一性(其中落在這個范圍內(nèi)的所有整數(shù)也被包括在其中)，特別地與SEQ ID NO 35中所述的一種核苷酸序列至少85%至90%之間的序列同一性(其中落在這個范圍內(nèi)的 所有整數(shù)也被包括在其中)，特別地與SEQ ID NO 35中所述的一種核苷酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，或其片段，并且其中所 述調(diào)節(jié)核苷酸序列或其片段介導(dǎo)了一種可操作地連接的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄，特別地一種 感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄從而所述感興趣的多核苷酸被轉(zhuǎn)錄 于該植物的大多數(shù)組織中但基本上排除該雄花穗的組織之外從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯 著的程度存在于所述組織中。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中提供該轉(zhuǎn)錄起始 功能的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈能夠與SEQ ID NO :35中所述的一種核苷酸序列進(jìn)行雜交，特別 地在中等程度雜交條件下，更特別地在嚴(yán)格雜交條件下，并且其中所述調(diào)節(jié)核苷酸序列介 導(dǎo)了一種可操作地連接的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄，特別地一種感興趣的可操作地連接的編碼 蛋白的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄，從而所述感興趣的多核苷酸被轉(zhuǎn)錄于該植物的大多數(shù)組織中但是 基本上排除轉(zhuǎn)錄于雄花穗的組織中從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織 中 。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中提供該轉(zhuǎn)錄起始 功能的核苷酸序列是SEQ ID NO :35中所述的序列或其片段，該片段作為轉(zhuǎn)錄起始序列仍然 展示全部的功能性。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn) 基因植物包括調(diào)節(jié)核苷酸序列或包含所述調(diào)節(jié)核苷酸序列的表達(dá)盒或多核苷酸構(gòu)建體，特 別地嵌合多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合多核苷酸構(gòu)建體包括所述調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列的至少 一部分具有一種可以從植物基因組DNA得到(特別地玉米基因組DNA)的轉(zhuǎn)錄終止功能，并 且介導(dǎo)可操作地連接的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄，特別地感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的 多核苷酸的轉(zhuǎn)錄，從而所述感興趣的多核苷酸被轉(zhuǎn)錄于該植物的大多數(shù)組織中但基本上排 除在該雄花穗的組織之外，從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中，其中i)所述調(diào)節(jié)核苷酸序列包括轉(zhuǎn)錄終止序列，該轉(zhuǎn)錄終止序列與SEQID NO 36中所 述的一種核苷酸序列具有至少80%至85%之間的序列同一性，其中落在這個范圍內(nèi)的所 有整數(shù)也被包括其中，特別地至少85%至90%之間的序列同一性，其中落在這個范圍內(nèi)的 所有整數(shù)也被包括在其中，特別地至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%序列同一性；或其片段，該片段作為轉(zhuǎn)錄起始序列仍然展示全部的功能性；或ii)所述調(diào)節(jié)核苷酸序列的互補(bǔ)鏈與SEQ ID NO 36中所述的一種核苷酸序列進(jìn) 行雜交，特別地在中等程度的雜交條件下，特別地在中等嚴(yán)格的雜交條件下，特別地在嚴(yán)格 的雜交條件下，并且介導(dǎo)了終止一種感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸的轉(zhuǎn) 錄；或iii)所述調(diào)節(jié)序列具有如SEQ ID NO 36中所述的序列，或其片段，其中該片段作 為轉(zhuǎn)錄起始序列仍然展示全部的功能性，包括其互補(bǔ)序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn) 基因植物包括調(diào)節(jié)核苷酸序列或包含所述調(diào)節(jié)核苷酸序列的表達(dá)盒或多核苷酸構(gòu)建體，特 別地嵌合的多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合的多核苷酸構(gòu)建體包括所述調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列的 至少一部分具有分別地(respectively) —種轉(zhuǎn)錄起始功能和一種終止功能，該嵌合的多 核苷酸構(gòu)建體的調(diào)節(jié)核苷酸序列可以從植物基因組DNA(特別地從玉米基因組DNA)得到， 并且被表達(dá)于該植物的大多數(shù)組織中但基本上排除該雄花穗的組織之外從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中，該嵌合的多核苷酸構(gòu)建體的調(diào)節(jié)核苷酸序列包括 分別地轉(zhuǎn)錄起始序列和轉(zhuǎn)錄終止序列，這些序列與SEQ IDN0:35和SEQ ID NO :36中所述 核苷酸序列分別地具有至少80%至85%之間的序列同一性，其中落在這個范圍內(nèi)的所有 整數(shù)也被包括在其中，特別地至少85%至90%之間的序列同一性，其中落在這個范圍內(nèi)的 所有整數(shù)也被包括在其中，特別地至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%的序列同一性，包括其片段，該片段分別地作為轉(zhuǎn)錄起始序列和終止序列仍然展示 全部的功能性。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn) 基因植物包括調(diào)節(jié)核苷酸序列或包括所述調(diào)節(jié)核苷酸序列的表達(dá)盒或多核苷酸構(gòu)建體，特 別地嵌合的多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合的多核苷酸構(gòu)建體包括所述調(diào)節(jié)序列，該嵌合的多核 苷酸構(gòu)建體的調(diào)節(jié)序列的至少一部分分別地具有一種轉(zhuǎn)錄起始功能和一種終止功能，該調(diào) 節(jié)核苷酸序列可以從植物基因組DNA、特別地玉米基因組DNA得到，并且被表達(dá)于該植物的 大多數(shù)組織中但基本上排除在該雄花穗的組織之外，從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度 存在于所述組織中，嵌合的多核苷酸構(gòu)建體的調(diào)節(jié)核苷酸序列分別地包括如SEQ ID N0:35 中所述的轉(zhuǎn)錄起始序列和如SEQ ID NO :36中所述的轉(zhuǎn)錄終止序列，包括它們的片段，該片 段分別地作為轉(zhuǎn)錄起始序列和終止序列仍然展示全部的功能性。在一個實(shí)施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中該感 興趣的編碼多肽或蛋白的多核苷酸編碼展示一種殺蟲活性的多肽產(chǎn)物，特別地一種蘇云金 芽孢桿菌的內(nèi)毒素。在一個實(shí)施方案中，由這些植物繁殖結(jié)構(gòu)的組織中、特別地花粉和/或雄花穗的 組織中感 興趣的編碼蛋白的多核苷酸表達(dá)的該多肽產(chǎn)物的濃度是這樣的即在標(biāo)準(zhǔn)的昆蟲 攝食測定法中不能檢測到殺蟲的活性。特別地，在雄花穗中該表達(dá)產(chǎn)物的濃度低于不超過 10ng/mg可溶性蛋白的基本水平，特別地不超過5ng/mg可溶性蛋白、更特別地不超過3ng/ mg可溶性蛋白，但特別地不超過2ng/mg可溶性蛋白或以下。在一個實(shí)施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中感興 趣的編碼該多肽或蛋白的多核苷酸編碼蘇云金芽孢桿菌的內(nèi)毒素，具有與SEQ ID N0:15中 所述的一種核苷酸序列至少80%至85%之間的序列同一性(其中落在這個范圍內(nèi)的所有 整數(shù)也被包括其中)，特別地至少85%至90%之間的序列同一性(其中落在這個范圍內(nèi)的 所有整數(shù)也被包括其中)，特別地至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%序列同一性。在一個實(shí)施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中感興 趣的編碼該多肽或蛋白的多核苷酸編碼了一種蘇云金芽孢桿菌的內(nèi)毒素，具有如SEQ ID NO: 15中所述的核苷酸序列。在一個實(shí)施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中該感 興趣的編碼多肽或蛋白的多核苷酸編碼了多肽產(chǎn)物，該多肽產(chǎn)物對增強(qiáng)干旱耐受性有影 響，特別地H+-焦磷酸酶的去調(diào)節(jié)形式，其中所述多肽或蛋白處于根據(jù)本發(fā)明的調(diào)節(jié)序列的 控制之下，該調(diào)節(jié)序列的至少一部分具有一種轉(zhuǎn)錄起始功能，該轉(zhuǎn)錄起始功能介導(dǎo)了一種 感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸表達(dá)于大多數(shù)植物組織中但基本上排除表 達(dá)于花粉組織中和/或雄花穗的組織中從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物是一種玉蜀黍植 物。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)核苷酸序列或包含所述調(diào)節(jié)核苷酸序列的表 達(dá)盒或多核苷酸構(gòu)建體，特別地嵌合的多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合的多核苷酸構(gòu)建體包括所 述調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列的至少一部分具有一種轉(zhuǎn)錄起始功能，該轉(zhuǎn)錄起始功能介導(dǎo)了一 種感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸表達(dá)于大多數(shù)植物組織中但基本上排除 表達(dá)于這些雄性繁殖結(jié)構(gòu)的組織(特別地花粉和/或雄花穗的組織)中從而沒有表達(dá)產(chǎn)物 以任何顯著的程度存在于所述組織中。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該調(diào)節(jié)核苷酸序列可以從由DNA探針?biāo)硎镜幕?(特別地如SEQ ID NO 47至56中所述的DNA序列的DNA探針)得到，該DNA探針顯示在 這些組織樣品中的一種信號模式，該信號模式表示所述基因表達(dá)于所有組織中但不或基本 上不表達(dá)于花粉中。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該調(diào)節(jié)核苷酸序列可以從對一種肌動蛋白解聚因子 3進(jìn)行編碼的基因(特別地一種來自玉米的肌動蛋白解聚因子3基因)得到，該肌動蛋白解 聚因子3被表達(dá)于該植物的大多數(shù)組織中但基本上排除該花粉的組織之外從而沒有表達(dá) 產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該調(diào)節(jié)核苷酸序列可以從由DNA探針?biāo)硎镜幕?(特別地如SEQ ID NO 57至79中所述的DNA序列的DNA探針)得到，該DNA探針顯示在 這些組織樣品中的一種信號模式，該信號模式表示所述基因表達(dá)于所有組織中但不或基本 上不表達(dá)于雄花穗的組織中。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)核苷酸序列或包含所述調(diào)節(jié)核苷酸序列的 表達(dá)盒或多核苷酸構(gòu)建體，特別地嵌合的多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合的多核苷酸構(gòu)建體包括 如在此所述的調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列可以使用以下各項(xiàng)從玉蜀黍基因組DNA模板得到i)第一引物，該引物與如SEQ ID NO=I中所述的一種核苷酸序列(特別地SEQ ID NO 1的第一引物)具有至少90%，特別地至少91%，特別地至少92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%或99%序列同一性；或ii)第二引物，該引物與如SEQ ID NO :2中所述的一種核苷酸序列(特別地SEQ ID NO 2的第二引物)具有至少90%，特別地至少91%，特別地至少92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%或99%序列同一性；或iii)第一引物作為正向引物，該正向引物與如SEQ ID N0:1中所述的一種核苷 酸序列具有至少90%，特別地至少91%，特別地至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%序列同一性；并且第二引物作為反向引物，該反向引物與如SEQ ID NO :2中所 述的一種核苷酸序列具有至少90 %，特別地至少91 %，特別地至少92 %、93 %、94%、95 %、 96%、97%、98%或99%序列同一性；特別地SEQ ID NO :1的正向引物以及SEQ ID NO :2的 反向引物。在一個實(shí)施方案中，使用選自下組寡核苷酸的一個或多個寡核苷酸對根據(jù)本發(fā)明 并且如在此所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列進(jìn)行修飾，該組寡核苷酸描述如下SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6、SEQ IDNO :7 禾口 SEQ ID NO :8。
在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)核苷酸序列或一種包含所述調(diào)節(jié)核苷酸 序列的表達(dá)盒或一種多核苷酸構(gòu)建體，特別地一種嵌合多核苷酸構(gòu)建體，所述該嵌合多核 苷酸構(gòu)建體包括如在此所述的調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)核苷酸序列提供了一種轉(zhuǎn)錄起始功能，其 中提供所述功能的核苷酸序列與SEQID NO 13中所述的一種核苷酸序列具有至少80%至 85%之間的序列同一性，其中落在這個范圍內(nèi)的所有整數(shù)被包括在其中，特別地至少85% 至90%之間的序列同一性，其中落在這個范圍內(nèi)的所有整數(shù)也被包括在其中，特別地至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性并且其中所述調(diào)節(jié) 核苷酸序列介導(dǎo)了一種感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)錄于該植物的大 多數(shù)組織中但基本上排除該花粉的組織中從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所 述組織中。

在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)核苷酸序列或一種包含所述調(diào)節(jié)核苷酸 序列的表達(dá)盒或一種多核苷酸構(gòu)建體，特別地一種嵌合多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合多核苷酸 構(gòu)建體包括如在此所述的調(diào)節(jié)序列，該嵌合多核苷酸構(gòu)建體的調(diào)節(jié)核苷酸序列提供了一種 轉(zhuǎn)錄起始功能，其中提供所述功能的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈與SEQ ID NO :13中描述的核苷酸 序列雜交，特別地在中等程度的雜交條件下，更特別地在中等程度嚴(yán)格的雜交條件下并且 其中所述調(diào)節(jié)核苷酸序列介導(dǎo)了將一種感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn) 錄于該植物的大多數(shù)組織中但基本上排除該花粉的組織中從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著 的程度存在于所述組織中。特別地，所述雜交在嚴(yán)格雜交條件下發(fā)生。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，提供該轉(zhuǎn)錄起始功能的核苷酸序列是SEQID NO 13 中所述的序列，或其片段，該片段作為轉(zhuǎn)錄起始序列仍然展示全部的功能性，及其互補(bǔ)序 列。在一個實(shí)施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列或包括 所述調(diào)節(jié)核苷酸序列的表達(dá)盒或多核苷酸構(gòu)建體，特別地嵌合的多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合 的多核苷酸構(gòu)建體包括所述調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列包括約Ikb的位于ZmABP3基因的ZmABP3 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游處的核苷酸序列，特別地如SEQ ID N0:17中所述位于ZmABP3基因的 ZmABP3轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)核苷酸序列另外包括該ZmABP35'-非翻 譯性序列、該ZmABP3第一外顯子、該ZmABP3第一內(nèi)含子和該ZmABP3第二外顯子的一部分， 特別地在該翻譯起始密碼子處終止的ZmABP3第二外顯子的一部分，特別地該ZmABP3第二 外顯子的一部分，該部分包括該第二外顯子的約10至約20個之間的核苷酸、特別地約12 至約16個之間的核苷酸、特別地約14個核苷酸。在一個實(shí)施方案中，提供了調(diào)節(jié)核苷酸序列或包含所述調(diào)節(jié)核苷酸序列的表達(dá)盒 或多核苷酸構(gòu)建體，特別地嵌合多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合多核苷酸構(gòu)建體包括所述調(diào)節(jié)序 列，該調(diào)節(jié)序列的至少一部分具有一種轉(zhuǎn)錄終止功能，該調(diào)節(jié)序列可以在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中 從gDNA模板(特別地玉米gDNA模板)使用正向引物(P3 (5' -tatatagagctcgcatcatgatc atgcatcatggact-3')(該正向引物與如SEQ ID NO :9中所述的核苷酸序列具有至少90%， 特別地至少91%，特別地至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性) 和反向弓丨物(P4 (5‘ -atatatactagtggcgcgccacactttctgtcgcatgtgatttgca-3‘)(該反向 引物具有與如SEQ ID NO 10中所述的核苷酸序列具有至少90%，特別地至少91%，特別地至少92 %、93 %、94 %、95 %、96 %、97 %、98 %或99 %序列同一性)而得到。特別地，所述調(diào) 節(jié)核苷酸序列包括轉(zhuǎn)錄終止子和多腺苷酸化信號。特別地，使用正向引物(P3(5' -tatatag agctcgcatcatgatcatgcatcatggact-3'))(該正向引物具有如 SEQ ID NO :9 中所述的核苷 酸序列)和反向弓丨物(P4 (5 ‘ -a tatatactagtggcgcgccacactttctgtcgcatgtgatttgca-3') (該反向引物具有如SEQID NO 10中所述的核苷酸序列)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，提供了調(diào)節(jié)核苷酸序列或包括所述調(diào)節(jié)核苷酸序列 的表達(dá)盒或多核苷酸構(gòu)建體，特別地嵌合多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合多核苷酸構(gòu)建體包括所 述調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列包括可以從對一種肌動蛋白解聚因子3(ABP3)(特別地從玉米肌 動蛋白解聚因子3(ABP3)基因)進(jìn)行編碼的基因得到的轉(zhuǎn)錄終止序列，該嵌合多核苷酸構(gòu) 建體的調(diào)節(jié)序列介導(dǎo)了一種可操作地連接的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄，特別地一種感興趣的可 操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄，從而所述感興趣的多核苷酸被轉(zhuǎn)錄于該植 物的大多數(shù)組織中但不或基本上不轉(zhuǎn)錄于花粉的組織中從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的 程度存在于所述組織中，其中i)所述調(diào)節(jié)核苷酸序列包括轉(zhuǎn)錄終止序列，該調(diào)節(jié)序列與SEQ IDNO 14中所述 的一種核苷酸序列具有至少80%至85%之間的序列同一性，其中落在這個范圍內(nèi)的所有 整數(shù)也被包括其中，特別地至少85%至90%之間的序列同一性，其中落在這個范圍內(nèi)的所 有整數(shù)也被包括在其中，特別地至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%序列同一性；或ii)所述調(diào)節(jié)核苷酸序列的互補(bǔ)鏈與SEQ ID NO :14中所述的一種核苷酸序列進(jìn) 行雜交，特別地在中等程度的雜交條件下，更特別地在中等嚴(yán)格的雜交條件下，特別地在嚴(yán) 格的雜交條件下，并且介導(dǎo)了終止一種感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸的轉(zhuǎn) 錄；或iii)所述調(diào)節(jié)核苷酸序列具有如SEQ ID NO 14中所述的序列，或其片段，其中該 片段作為終止序列仍然展示全部的功能性，包括其互補(bǔ)序列。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，提供了調(diào)節(jié)核苷酸序列或包含所述調(diào)節(jié)核苷酸序 列的表達(dá)盒或多核苷酸構(gòu)建體，特別地嵌合的多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合的多核苷酸構(gòu)建體 包括所述調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列的至少一部分分別地具有一種轉(zhuǎn)錄起始功能和一種終止功 能，該嵌合的多核苷酸構(gòu)建體的調(diào)節(jié)核苷酸序列可以從對一種肌動蛋白解聚因子3(ABP3) 進(jìn)行編碼的基因(特別地從玉米肌動蛋白解聚因子3(ABP3)基因)得到，該嵌合的多核苷 酸構(gòu)建體被表達(dá)于該植物的大多數(shù)組織中但不或基本上不被表達(dá)于該花粉的組織中從而 沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中，并且該嵌合的多核苷酸構(gòu)建體的調(diào)節(jié) 核苷酸序列包括如SEQ ID NO :13中所述的轉(zhuǎn)錄起始序列和如SEQ ID N0:14中所述的轉(zhuǎn)錄 終止序列。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，該調(diào)節(jié)核苷酸序列可以從玉米基因組DNA、特別地從 在該玉米基因組上推測的基因得到，該調(diào)節(jié)核苷酸序列被高度表達(dá)于該植物的大多數(shù)組織 中但不或基本上不表示于雄花穗的組織中從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所 述組織中。在一個實(shí)施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的一種調(diào)節(jié)核苷酸序列或 一種包含所述調(diào)節(jié)核苷酸序列的表達(dá)盒或一種多核苷酸構(gòu)建體，特別地一種嵌合多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合多核苷酸構(gòu)建體包括所述調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列包括約2. 6kb的5'-序列， 該5'-序列包括約2kb的5'-非轉(zhuǎn)錄性序列、5' -UTR、和外顯子1和外顯子2的一部分 以及內(nèi)含子1，特別地約0. 6kb表示外顯子1、內(nèi)含子1和外顯子2的約16bp。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)核苷酸序列或包含所述調(diào)節(jié)核苷酸序列的 表達(dá)盒或多核苷酸構(gòu)建體，特別地嵌合的多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合的多核苷酸構(gòu)建體包括 所述調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列的至少一部分具有一種如在此所述的轉(zhuǎn)錄起始功能，該調(diào)節(jié)序 列可以使用以下各項(xiàng)從玉蜀黍基因組DNA模板得到i)第一引物，該引物與如SEQ ID NO :19中所述的一種核苷酸序列(特別地SEQ ID NO 19的引物)具有至少90%，特別地至少91%,特別地至少92%,93%,94%,95%,96% 97%、98%或99%序列同一性；或ii)第二引物，該引物與如SEQ ID NO 20中所述的一種核苷酸序列(特別地SEQ ID N0:20的反向引物)具有至少90%，特別地至少91%，特別地至少92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%或 99%序列同一性；或iii)第一引物作為正向引物，該正向引物與如SEQ ID NO :19中所述的一種核苷 酸序列具有至少90%，特別地至少91%，特別地至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%序列同一性；并且第二引物作為反向引物，該反向引物與如SEQ ID NO :20中所 述的一種核苷酸序列具有至少90 %，特別地至少91 %，特別地至少92 %、93 %、94%、95 %、 96%、97%、98%或99%序列同一性；特別地SEQ ID NO :19的正向引物以及SEQ ID NO 20 的反向引物。在一個實(shí)施方案中，使用選自下組寡聚核苷酸的一個或多個寡核苷酸對根據(jù)本發(fā) 明并且如在此所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列進(jìn)行修飾，該組描述如下SEQ ID N0:21、SEQ ID NO 22、SEQ ID NO 23, SEQ ID NO :24、SEQ IDNO :25 禾口 SEQ ID NO :26。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)核苷酸序列或一種包含所述調(diào)節(jié)核苷 酸序列的表達(dá)盒或一種多核苷酸構(gòu)建體，特別地一種嵌合多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合多核苷 酸構(gòu)建體包括如在此所述的調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)核苷酸序列提供了一種轉(zhuǎn)錄起始功能，其中 提供所述功能的核苷酸序列與SEQ ID NO :35中所述的一種核苷酸序列具有至少80%至 85%之間的序列同一性，其中落在這個范圍內(nèi)的所有整數(shù)被包括在其中，特別地至少85% 至90%之間的序列同一性，其中落在這個范圍內(nèi)的所有整數(shù)也被包括在其中，特別地至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性并且其中所述調(diào)節(jié) 核苷酸序列介導(dǎo)了一種感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)錄于該植物的大 多數(shù)組織中但基本上排除該雄花穗的組織中從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于 所述組織中。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)核苷酸序列或一種包含所述調(diào)節(jié)核苷酸 序列的表達(dá)盒或一種多核苷酸構(gòu)建體，特別地一種嵌合多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合多核苷酸 構(gòu)建體包括如在此所述的調(diào)節(jié)序列，該嵌合多核苷酸構(gòu)建體的調(diào)節(jié)核苷酸序列提供了一種 轉(zhuǎn)錄起始功能，其中提供所述功能的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈與SEQ ID NO :35中描述的核苷酸 序列雜交，特別地在中等程度的雜交條件下，更特別地在中等程度嚴(yán)格的雜交條件下并且 其中所述調(diào)節(jié)核苷酸序列介導(dǎo)了將一種感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn) 錄于該植物的大多數(shù)組織中但基本上排除該花粉的組織中從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中。特別地，所述雜交在嚴(yán)格雜交條件下發(fā)生。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，提供該轉(zhuǎn)錄起始功能的核苷酸序列是SEQID NO 35 中所述的序列，或其片段，該片段作為轉(zhuǎn)錄起始序列仍然展示全部的功能性，及其互補(bǔ)序 列。在一個實(shí)施方案中，提供了調(diào)節(jié)核苷酸序列或包含所述調(diào)節(jié)核苷酸序列的表達(dá)盒 或多核苷酸構(gòu)建體，特別地嵌合多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合多核苷酸構(gòu)建體包括所述調(diào)節(jié)序 列，該調(diào)節(jié)序列的至少一部分具有一種轉(zhuǎn)錄終止功能，該調(diào)節(jié)序列可以在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中 從gDNA模板(特別地玉米gDNA模板)使用正向引物(該正向引物與如SEQ ID NO 29中 所述的核苷酸序列具有至少90 %，特別地至少91 %，特別地至少92 %、93 %、94 %、95 %、 96%、97%、98%或99%序列同一性)和反向引物(該反向引物具有與如SEQ ID NO :30中 所述的核苷酸序列具有至少90 %，特別地至少91 %，特別地至少92 %、93 %、94 %、95 %、 96%、97%、98%或99%序列同一性)而得到。特別地，所述調(diào)節(jié)核苷酸序列包括轉(zhuǎn)錄終止 子和多腺苷酸化信號。特別地，使用正向引物(該正向引物具有如SEQ ID N0:29中所述的 核苷酸序列)和反向引物(該反向引物具有如SEQ ID NO 30中所述的核苷酸序列)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，提供了調(diào)節(jié)核苷酸序列或包含所述調(diào)節(jié)核苷酸序列 的表達(dá)盒或多核苷酸構(gòu)建體，特別地嵌合的多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合的多核苷酸構(gòu)建體包 括所述調(diào)節(jié)序列，其中i)所述調(diào)節(jié)核苷酸序列包括轉(zhuǎn)錄終止序列，該轉(zhuǎn)錄終止序列與SEQID NO 36中所 述的一種核苷酸序列具有至少80%至85%之間的序列同一性，其中落在這個范圍內(nèi)的所 有整數(shù)也被包括其中，特別地至少85%至90%之間的序列同一性，其中落在這個范圍內(nèi)的 所有整數(shù)也被包括在其中，特別 地至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%序列同一性；或ii)所述調(diào)節(jié)核苷酸序列的互補(bǔ)鏈與SEQ ID NO 36中所述的一種核苷酸序列進(jìn) 行雜交，特別地在中等程度的雜交條件下，特別地在中等嚴(yán)格的雜交條件下，特別地在嚴(yán)格 的雜交條件下，并且介導(dǎo)了終止一種感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸的轉(zhuǎn) 錄；或iii)所述調(diào)節(jié)序列具有如SEQ ID NO 36中所述的序列，或其片段，其中該片段作 為終止序列仍然展示全部的功能性，包括其互補(bǔ)序列。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，提供了調(diào)節(jié)核苷酸序列或包含所述調(diào)節(jié)核苷酸序列 的表達(dá)盒或多核苷酸構(gòu)建體，特別地嵌合多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合多核苷酸構(gòu)建體包括所 述調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列的至少一部分分別地具有一種轉(zhuǎn)錄起始功能和一種終止功能，該 嵌合多核苷酸構(gòu)建體的調(diào)節(jié)核苷酸序列可以從玉米基因組DNA得到，該嵌合多核苷酸構(gòu)建 體被表達(dá)于該植物的大多數(shù)組織中但不或基本上不表達(dá)于該雄花穗的組織中，并且該嵌合 多核苷酸構(gòu)建體的調(diào)節(jié)核苷酸序列包括分別地轉(zhuǎn)錄起始序列和轉(zhuǎn)錄終止序列，該轉(zhuǎn)錄起始 序列和轉(zhuǎn)錄終止序列分別地與SEQ ID N0:35和SEQ ID NO :36中所述的一種核苷酸序列具 有至少80%至85%之間的序列同一性其中落在這個范圍內(nèi)的所有整數(shù)也被包括其中，特 別地至少85%至90%之間的序列同一性，其中落在這個范圍內(nèi)的所有整數(shù)也被包括其中， 特別地至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%序列同一性。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，提供了調(diào)節(jié)核苷酸序列或包含所述調(diào)節(jié)核苷酸序列的表達(dá)盒或多核苷酸構(gòu)建體，特別地嵌合的多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合的多核苷酸構(gòu)建體 包括所述調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列的至少一部分分別地具有一種轉(zhuǎn)錄起始功能和一種終止功 能，該嵌合的多核苷酸構(gòu)建體的調(diào)節(jié)核苷酸序列可以從玉米基因組DNA中得到，該嵌合的 多核苷酸構(gòu)建體被表達(dá)于該植物的大多數(shù)組織中但不或基本上不被表達(dá)于該雄花穗的組 織中從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中，并且該嵌合的多核苷酸構(gòu)建 體的調(diào)節(jié)核苷酸序列包括如SEQ ID NO :35中所述的轉(zhuǎn)錄起始序列和如SEQ ID N0:36中所 述的轉(zhuǎn)錄終止序列。對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚的是基于在SEQ ID NO 13、SEQID NO 14、 SEQ ID N0:35和SEQ ID NO :36中所示的核苷酸序列，可以從所述序列中得到不同長度的 片段，例如通過使用感興趣的任何引物組合來生成仍然展示根據(jù)本發(fā)明的特定調(diào)節(jié)功能的 多個片段，該調(diào)節(jié)功能驅(qū)動一種感興趣的可操作地連接的多核苷酸分別地表達(dá)于大多數(shù)植 物組織中而不表達(dá)于花粉和雄花穗的組織中。因此，根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述本發(fā)明包 括從全長轉(zhuǎn)錄本啟動子和全長終止子中得到的片段，它們根據(jù)本發(fā)明分別地發(fā)揮作用，即 能夠提供將可操作地連接的核苷酸序列表達(dá)和終止于大多數(shù)植物組織中但基本上排除該 花粉和/或雄花穗的組織中從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中。 一旦得到將該啟動子和終止子片段，通過將它們?nèi)诤系竭x擇性或篩選性標(biāo)記基因 上并且測定融合構(gòu)建體保留的特定的啟動子活性可以容易地測試該啟動子和終止子片段 的功能。這類測定是在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的普通技能之內(nèi)的。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及多個核苷酸片段，特別地涉及能夠從肌動蛋白解 聚因子3(ABP3)基因的調(diào)節(jié)序列中得到的核苷酸片段，該肌動蛋白解聚因子3基因的核苷 酸片段具有長度至少約50個堿基，優(yōu)選地約400個堿基至約650個堿基之間，更優(yōu)選地約 200個堿基至約400個堿基之間，并且最優(yōu)選地約350個堿基，并且仍然展示根據(jù)本發(fā)明的 特定的調(diào)節(jié)功能，該調(diào)節(jié)功能驅(qū)動將一種感興趣的可操作地連接的多核苷酸表達(dá)于大多數(shù) 植物組織中但基本上排除該花粉和/或雄花穗的組織中從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的 程度存在于所述組織中。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及核苷酸片段，該核苷酸片段包括分別地描述于SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 35中的一種核苷酸序列，該核苷酸序列包括至少50nt的連續(xù)的 一段序列，特別地約400nt至約650nt之間，特別地約200nt至約400nt之間，特別地約 350nt長度的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列仍然展示根據(jù)本發(fā)明的特定的調(diào)節(jié)功能，該 調(diào)節(jié)功能驅(qū)動將一種感興趣的可操作地連接的多核苷酸表達(dá)于大多數(shù)植物組織中但基本 上排除該花粉和/或雄花穗的組織中，從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組 織中。對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)清楚的是通過引入突變(即使用本領(lǐng)域中已 知的方法將一個或多個核苷酸分別地插入、缺失和/或取代入SEQ IDNO 13,SEQ ID NO 14、 SEQ ID N0:35和SEQ ID NO :36的DNA序列中)在不影響根據(jù)本發(fā)明的調(diào)節(jié)序列的特定性 質(zhì)下可以得到變體序列。此外，通過將本發(fā)明的序列改組可以進(jìn)一步改變本發(fā)明的未修飾 的或已修飾的核苷酸序列。為了測試根據(jù)本發(fā)明的變體DNA序列的功能，將感興趣的序列 可操作地連接到選擇性或篩選性標(biāo)記基因上并且在具有原生質(zhì)體的瞬時表達(dá)測定中或在 整個植物組織中或在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物中對該標(biāo)記基因的表達(dá)進(jìn)行測試。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是能夠驅(qū)動表達(dá)一種可操作地連接的核苷酸序列的DNA序列是以一種模 塊的方式建造的。因此，來自較短DNA片段的表達(dá)水平與來自最長的片段的表達(dá)水平相比 可以是不同的，并且彼此之間可以是不同的。例如，缺失下調(diào)上游元件將導(dǎo)致該連接的核苷 酸序列的表達(dá)水平的增加，而缺失上調(diào)元件將減少該相關(guān)核苷酸序列的表達(dá)水平。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種包括調(diào)節(jié)核苷酸序列的表達(dá)盒或包含所述調(diào) 節(jié)核苷酸序列的表達(dá)盒或多核苷酸構(gòu)建體，特別地嵌合多核苷酸構(gòu)建體，該嵌合的多核苷 酸構(gòu)建體包括根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的調(diào)節(jié)序列。在一個實(shí)施方案中， 根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒包括約2. 3kb的ZmABP3的5'序列，該 ZmABP3的5'序列的組成為約1. Ikb的5'-非轉(zhuǎn)錄性序列、約0. 25kb的5' -UTR、以及約 0. 98kb表示ZmABP3-內(nèi)含子1，在剛好越過該ABP3翻譯終止密碼子處開始的約1. 013kb的 3'-序列，該3‘-序列包括約0. 3kb的3‘ -UTR和約0. 7kb的非轉(zhuǎn)錄性序列，該0. 7kb 的非轉(zhuǎn)錄性序列作為轉(zhuǎn)錄終止子和多腺苷酸化信號起作用。在一個實(shí)施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒，其中將該天然翻譯起始密碼子 沉默并且移動到該第二外顯子中，特別地移動到ZmABP3外顯子2的5'-端的15個核苷酸 中。在一個實(shí)施方案中，提供根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒，其中將該Kozak序列 5' -. . . CCACC. . . -3'置于該起始密碼子之前。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒包含調(diào)節(jié)核苷酸序列，該核苷酸序列包 括約2. 6kb的5 ‘-序列，該5 ‘-序列的組成為約2kb的5 ‘-非轉(zhuǎn)錄性序列、和約12bp 的5' -UTR、約0.6kb表示外顯子1、內(nèi)含子1和約16bp的外顯子2;以及約Ikb的3'-序 列，該3'-序列在剛好越過該翻譯終止密碼子處開始并且包括約0.6kb的3' -UTR和約 0. 4kb的非轉(zhuǎn)錄性序列，并且作為轉(zhuǎn)錄終止子和多腺苷酸化信號起作用。在一個實(shí)施方案中，提供根據(jù)本發(fā)明的一種表達(dá)盒，其中該天然翻譯起始密碼子 被沉默并被移到該第二外顯子處。在一個實(shí)施方案中，提供了 一種編碼多肽或蛋白的核苷酸序列，該核苷酸序列編 碼蘇云金芽孢桿菌的內(nèi)毒素，具有與SEQ ID NO :15中所述的一種核苷酸序列至少80%序 列同一性，特別地至少85%序列同一性、特別地至少90%,91%,92%,93%,94%,95%, 96%、97%、98%或 99%序列同一性。在一個實(shí)施方案中，提供了編碼多肽或蛋白的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼蘇 云金芽孢桿菌的內(nèi)毒素，具有如SEQ ID NO: 15中所述的核苷酸序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物包括根據(jù)本發(fā)明并且 如在此所述的表達(dá)盒。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因植物，特別地一種轉(zhuǎn)基因玉米植物，該轉(zhuǎn) 基因玉米植物包括根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的調(diào)節(jié)序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因植物，特別地一種轉(zhuǎn)基因玉米植物，該轉(zhuǎn) 基因玉米植物包括根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的一種調(diào)節(jié)序列，該調(diào)節(jié)序列與一種感興趣 的多核苷酸、特別地一種感興趣的編碼多肽或蛋白的多核苷酸相連接。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因植物，特別地一種轉(zhuǎn)基因玉米植物，該轉(zhuǎn) 基因玉米植物包括根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的表達(dá)盒。
在一個實(shí)施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中編碼 該多肽或蛋白的核苷酸序列編碼了一種蘇云金芽孢桿菌的內(nèi)毒素，具有與SEQ ID N0:15 中所述的一種核苷酸序列至少80%序列同一性，特別地至少85%序列同一性、特別地至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%序列同一性，并且處于在所述植 物中可操作的一種調(diào)節(jié)序列的控制之下。在一個實(shí)施方案 中，提供了根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中該編 碼多肽或蛋白的核苷酸序列編碼了一種蘇云金芽孢桿菌的內(nèi)毒素，具有如SEQ ID N0:15中 所述的核苷酸序列，并且處于在所述植物中可操作的一種調(diào)節(jié)序列的控制之下。本發(fā)明還提供了用于制備包括根據(jù)本發(fā)明的調(diào)節(jié)序列的表達(dá)盒的方法，該方法包 括用根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的調(diào)節(jié)序列與感興趣的對一種多肽或一種蛋白進(jìn)行編碼 的可表達(dá)的多核苷酸進(jìn)行連接以得到一種表達(dá)構(gòu)建體，其中該感興趣的多核苷酸被可操作 地與該調(diào)節(jié)序列進(jìn)行連接或連接從而該多肽或一種感興趣的蛋白的表達(dá)被根據(jù)本發(fā)明的 調(diào)節(jié)序列所介導(dǎo)并且導(dǎo)致所述多肽或一種感興趣的蛋白表達(dá)于基本上所有植物組織中，但 基本上排除表達(dá)于該植物的繁殖結(jié)構(gòu)的組織中、特別地該花粉和/或雄花穗的組織中，從 而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，該轉(zhuǎn)基因植物將一 種感興趣的DNA序列表達(dá)于非花粉組織中但不或基本上不表達(dá)于在該花粉和/或雄花穗的 組織中，該方法包括a.將一種根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化入一種植物細(xì)胞中，該表達(dá)盒 包括一種調(diào)節(jié)核苷酸序列，該調(diào)節(jié)核苷酸序列的至少一部分具有一種轉(zhuǎn)錄起始功能，該轉(zhuǎn) 錄起始功能介導(dǎo)將一種感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸表達(dá)于大多數(shù)植物 組織中但基本上排除了花粉和/或雄花穗的組織中從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度 存在于所述組織中；并且b.將步驟a)中轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生成為植物。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種防治目標(biāo)昆蟲-以營養(yǎng)植物組織例如葉、莖 和根為食和/或以繁殖組織例如穗為食的害蟲、但是保護(hù)以花粉為食的非目標(biāo)害蟲的方 法，該方法包括a.在區(qū)域內(nèi)生長一種根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的植物，用目標(biāo)害蟲侵染該區(qū) 域；b.在根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的一種調(diào)節(jié)序列的控制下表達(dá)一種多肽或蛋白， 該多肽或蛋白能夠防治所述目標(biāo)害蟲。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種通過在所述組織中表達(dá)感興趣的一種多肽或 蛋白，從而保護(hù)一種植物的繁殖組織、特別地該花粉和/或雄花穗的組織免受損害的方法， 該方法包括a.生長一種根據(jù)本發(fā)明或如在此所述的植物；b.在根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的一種調(diào)節(jié)序列的控制下在所述植物中表達(dá)一 種感興趣的多肽或蛋白。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過在所述組織中表達(dá)一種感興趣的多肽或蛋白 (包括在根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的一種調(diào)節(jié)序列的控制下在所述植物中表達(dá)所述感興趣的多肽或蛋白)從而使用根據(jù)本發(fā)明并且如在此所披露的一種調(diào)節(jié)序列來保護(hù)植物的繁殖組織、特別地花粉和/或雄花穗組織免受損傷。序列的簡要說明SEQ ID NO 1描述了正向引物Pl的核苷酸序列SEQ ID NO :2描述了反向引物P2的核苷酸序列SEQ ID NO 3描述了寡核苷酸Patg的核苷酸序列SEQ ID NO 4描述了寡核苷酸Pnco的核苷酸序列SEQ ID NO 5描述了寡核苷酸ADPc-I的核苷酸序列SEQ ID NO 6描述了寡核苷酸ADPc_2的核苷酸序列SEQ ID NO 7描述了寡核苷酸ADPc_4的核苷酸序列SEQ ID NO 8描述了寡核苷酸adp3_a的核苷酸序列SEQ ID NO 9描述了正向引物P3的核苷酸序列SEQ ID NO 10描述了反向引物P4的核苷酸序列SEQ ID NO 11描述了正向引物Tnco的核苷酸序列SEQ ID NO 12描述了正向引物T2的核苷酸序列SEQ ID NO 13描述了包括轉(zhuǎn)錄起始序列的修飾的ZmABP3調(diào)節(jié)序列的核苷酸序列SEQ ID NO 14描述了 ZmABP3末端序列的核苷酸序列SEQ ID NO 15 描述了 CrylAbG6 的核苷酸序列SEQ ID NO 16描述了玉米優(yōu)化的AtAVPlD編碼序列的核苷酸序列SEQ ID NO 17描述了 ZmABP3基因的核苷酸序列SEQ ID NO 18描述了 pN0V1321質(zhì)粒的核苷酸序列SEQ ID NO 19描述了正向引物ABT Pl forw的核苷酸序列SEQ ID NO 20描述了反向引物ABT P2 rev的核苷酸序列SEQ ID NO 21描述了寡核苷酸pABT mutl的核苷酸序列SEQ ID NO 22描述了寡核苷酸pABT mut2的核苷酸序列SEQ ID NO 23描述了寡核苷酸pABT mut3的核苷酸序列SEQ ID NO 24描述了寡核苷酸pABT mut4的核苷酸序列SEQ ID NO 25描述了寡核苷酸pABT mut5的核苷酸序列SEQ ID NO 26描述了寡核苷酸pABT mut6的核苷酸序列SEQ ID NO :27描述了正向引物pABT ampl的核苷酸序列SEQ ID NO 28描述了反向引物pABT amp2的核苷酸序列SEQ ID NO 29描述了正向引物ABT P4的核苷酸序列SEQ ID NO 30描述了反向引物ABT P5的核苷酸序列SEQ ID NO 31描述了寡核苷酸ABTt ml的核苷酸序列SEQ ID NO 32描述了寡核苷酸ABTt m2的核苷酸序列SEQ ID NO 33 描述了 ZmABTl cDNA 的核苷酸序列SEQ ID NO 34 描述了 ZmABT2 cDNA 的核苷酸序列SEQ ID NO 35描述了 ZmABT啟動子的核苷酸序列SEQ ID NO 36描述了 ZmABT末端序列的核苷酸序列。
SEQIDNO 37描述了 ZmABP3_CrylAbG6組裝構(gòu)建體的核苷酸序列。SEQIDNO 38描述了 ZmABP3_CrylAbG6 二元構(gòu)建體的核苷酸序列。SEQIDNO :39描述了增強(qiáng)的ZmABP3_CrylAbG6 二元構(gòu)建體的核苷酸序列。SEQIDNO 40描述了 ZmABP3_AmCyan組裝構(gòu)建體的核苷酸序列。SEQIDNO 41描述了 ZmABP3_AmCyan 二元構(gòu)建體的核苷酸序列。SEQIDNO 42描述了 ZmABP3_AtAVPlD組裝構(gòu)建體的核苷酸序列。SEQIDNO 43描述了 ZmABP3_AtAVPl 二元構(gòu)建體的核苷酸序列。SEQIDNO 44描述了質(zhì)粒15772 (ZmABT組裝體)的核苷酸序列SEQIDNO 45描述了質(zhì)粒15773的核苷酸序列SEQIDNO 46 描述了 ZmABT gDNA 的核苷酸序列SEQIDNO 47 描述了 Ctrl_ZMU45855_3_at 的核苷酸序列SEQIDNO 48 描述了 AF032370_at 的核苷酸序列SEQIDNO 49 描述了 Zm001747_s_at 的核苷酸序列SEQIDNO 50 描述了 Zm005803_s_at 的核苷酸序列SEQIDNO 51 描述了 Zm007728_s_at 的核苷酸序列SEQIDNO 52 描述了 Zm009722_s_at 的核苷酸序列SEQIDNO 53 描述了 Zm015335_s_at 的核苷酸序列SEQIDNO 54 描述了 Zm021004_s_at 的核苷酸序列SEQIDNO 55 描述了 Zm058948_s_at 的核苷酸序列SEQIDNO 56 描述了 Zm061393_s_at 的核苷酸序列SEQIDNO 57 描述了 Zm016864_s_at 的核苷酸序列SEQIDNO 58 描述了 ZmO 1879l_at 的核苷酸序列SEQIDNO 59 描述了 ZMMETALL_x_at 的核苷酸序列SEQIDNO 60 描述了 Zm000019_at 的核苷酸序列SEQIDNO 61 描述了 Zm002987_at 的核苷酸序列SEQIDNO 62 描述了 Zm002990_s_at 的核苷酸序列SEQIDNO 63 描述了 Zm002990_x_at 的核苷酸序列SEQIDNO 64 描述了 Zm004433_at 的核苷酸序列SEQIDNO 65 描述了 Zm005761_at 的核苷酸序列SEQIDNO 66 描述了 Zm006285_at 的核苷酸序列SEQIDNO 67 描述了 Zm006481_s_at 的核苷酸序列SEQIDNO 68 描述了 Zm010323_s_at 的核苷酸序列SEQIDNO 69 描述了 Zm011554_at 的核苷酸序列SEQIDNO 70 描述了 Zm011554_x_at 的核苷酸序列SEQIDNO 71 描述了 Zm021403_at 的核苷酸序列SEQIDNO 72 描述了 Zm028405_s_at 的核苷酸序列SEQIDNO 73 描述了 Zm032921_s_at 的核苷酸序列SEQIDNO 74 描述了 Zm033444_s_at 的核苷酸序列SEQIDNO 75 描述了 Zm035082_s_at 的核苷酸序列
SEQ ID NO 76 描述了 Zm040564_x_at 的核苷酸序列SEQ ID NO 77 描述了 Zm054116_s_at 的核苷酸序列SEQ ID NO 78 描述了 Zm066342_at 的核苷酸序列SEQ ID NO 79 描述了 Zm051284_at 的核苷酸序列SEQ ID NO 80描述了載體15289的核苷酸序列

SEQ ID NO 81 描述了 ZmABP-948-binary 的核苷酸序列SEQ ID NO 82 描述了 ZmABT-990_binary 的核苷酸序列SEQ ID NO 83描述了 5，Bfrl引物的核苷酸序列SEQ ID NO 84描述了 3，Xbal引物的核苷酸序列SEQ ID NO 85描述了 5，Gfix引物的核苷酸序列SEQ ID NO 86描述了 3，Gfix引物的核苷酸序列SEQ ID NO 87描述了 5，lAb5XbaI引物的核苷酸序列SEQ ID NO 88描述了 3，lAb3d6引物的核苷酸序列SEQ ID NO 89描述了 cy2，的核苷酸序列SEQ ID NO 90描述了 cyl的核苷酸序列SEQ ID NO 91描述了 cy2的核苷酸序列。發(fā)明詳細(xì)說明在本申請的范圍內(nèi)所使用的技術(shù)術(shù)語和表述，如果在此以下沒有另外說明，總體 上將被給定通常地在植物分子生物學(xué)的相關(guān)領(lǐng)域中應(yīng)用于它們之上的意義。如在本說明書和所附的權(quán)利要求中所使用的，單數(shù)形式“一個”(a，an)、“一種”和 “該”(所述，及類似翻譯)包括復(fù)數(shù)指示物，除非上下文中清楚地另外表明。因此，例如，涉 及“一種植物”包括一種或多種植物，并且涉及“一種細(xì)胞”包括多種細(xì)胞、組織等的混合物。如在本說明書和所附的權(quán)利要求所使用的，復(fù)數(shù)形式“多個組織”也包括單數(shù)形 式，除非上下文中清楚地另外表明。因此，例如，涉及“該雄花穗的多個組織”包括該雄花穗 中存在的一個或多個組織。如在本說明書和所附的權(quán)利要求中所使用的，短語“該植物的大多數(shù)組織”或“該 植物的基本上所有組織”是可交換地使用的并且指除了這些繁殖結(jié)構(gòu)的組織、特別地花粉 和雄花穗的組織之外相對于該植物中存在組織的多數(shù)。特別地，“大多數(shù)組織”指植物的那 些組織，其中目標(biāo)昆蟲除了這些雄性繁殖結(jié)構(gòu)組織以外主要以之為食的組織，例如莖、根、 葉、穗、穗鞘、穗絲以及發(fā)育的核的組織。術(shù)語“多核苷酸”在此應(yīng)當(dāng)理解為指高分子量的聚合物分子，該聚合物分子可以 是由含有一種糖、磷酸鹽和一種堿基的單體(核苷酸)組成的單鏈的或雙鏈的，該堿基是 或者一種嘌呤或者一種嘧啶?！岸嗪塑账崞巍笔且环N給定的多核苷酸分子的一部分。在 高等植物中，脫氧核糖核酸(DNA)是遺傳物質(zhì)，而核糖核酸(RNA)涉及將DNA中包含的信 息傳遞到蛋白中。“基因組”是在一種生物的每個細(xì)胞中所包含的遺傳物質(zhì)的整體，包括線 粒體和質(zhì)粒的基因組。因此術(shù)語“多核苷酸”指DNA或RNA的聚合物，該DNA或RNA可以是 單鏈的或雙鏈的，該聚合物任選地包含能夠結(jié)合入DNA或RNA聚合物中的合成的、非天然 的或改變的核苷酸堿基。除非另外表明，本發(fā)明的一種特定的核酸序列還暗示性地涵蓋它的保守地修飾的變體(例如，簡并密碼子取代)以及互補(bǔ)序列、以及連同明確地指明的序 列。確切地，簡并密碼子取代可通過產(chǎn)生以下序列來實(shí)現(xiàn)，在這些序列中一個或多個所選 (或全部)密碼子的第三位置被經(jīng)混合的堿基和/或脫氧肌苷殘基取代(Batzer，et al.， NucleicAcid Res. 19:5081(1991) ；Ohtsuka，et al. , J. Biol. Chem. 260 2605-2608 (1985)； 以及 Rossolini，et al. , Mol. Cell. Probes 8:91-98(1994))。術(shù)語多核苷酸與核酸、核苷 酸序列可交換地使用并且可以包括基因、cDNA、以及被基因編碼的mRNA、等?！捌渲辽僖徊糠志哂幸环N轉(zhuǎn)錄起始功能的調(diào)節(jié)核苷酸序列”在此應(yīng)當(dāng)理解為是指 一種核苷酸序列，該核苷酸序列通過提供對于RNA聚合酶以及用于適當(dāng)轉(zhuǎn)錄所要求的其他 因子的識別來控制一種可操 作地連接的編碼序列的表達(dá)，并且通常地位于它的編碼序列的 上游(5’ )處。“調(diào)節(jié)核苷酸序列”包括位于近端的5’調(diào)節(jié)序列以及該連接的編碼區(qū)的上 游的更遠(yuǎn)端的元件，這些調(diào)節(jié)序列和元件影響轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性、或該連接的編碼序 列的翻譯?！罢{(diào)節(jié)核苷酸序列”可以進(jìn)一步包括3’序列，該3’序列包括3’非翻譯的序列和 /或3’非轉(zhuǎn)錄的序列，這些3’非翻譯的序列和/或3’非轉(zhuǎn)錄的序列位于該連接的編碼區(qū) 域的下游處，并且該調(diào)節(jié)核苷酸序列可以包括一種轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)?！罢{(diào)節(jié)核苷酸序列”可以 包括增強(qiáng)子、啟動子、非翻譯的前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、以及聚腺苷酸化信號序列。它們包括自然 序列以及合成序列、連同可能是合成序列與自然序列的組合的多個序列?！霸鰪?qiáng)子”是DNA 序列，它可以促進(jìn)啟動子的活性并且可以是該啟動子或一種插入的異源元件的固有元件以 增強(qiáng)一種啟動子的水平或組織特異性。它能夠在兩個方向(正?；蚍D(zhuǎn))上進(jìn)行操作，并 且甚至當(dāng)移動到該啟動子的上游或下游時還能夠發(fā)揮作用。術(shù)語“調(diào)節(jié)核苷酸序列”的含 義包括“轉(zhuǎn)錄起始”或”啟動子”序列以及“啟動子調(diào)節(jié)序列”。這些術(shù)語在以下被可交換地 使用。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“3’ _非轉(zhuǎn)錄的序列”的定義包括對從目標(biāo)基因得到的 3’ _非轉(zhuǎn)錄序列的核苷酸序列進(jìn)行修飾，只要該修飾過的3’ -非轉(zhuǎn)錄序列沒有顯著地降低 它的連接的3’調(diào)節(jié)序列的活性。該3’-非轉(zhuǎn)錄序列向該轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)的下游延伸約0. 5kb 到 1. 5kb。本發(fā)明的多核苷酸應(yīng)當(dāng)理解為是以一種分離的形式提供的。術(shù)語“分離的”指在 此披露和要求的多核苷酸，如果它確實(shí)具有天然發(fā)生的對應(yīng)物，該多核苷酸不是以其天然 背景的方式出現(xiàn)的多核苷酸。因此，以下進(jìn)一步描述的本發(fā)明的其他化合物應(yīng)當(dāng)理解為是 分離的。如果要求本發(fā)明的多核苷酸在植物基因組的背景中，通過亦即將修飾引入該天然 發(fā)生的對應(yīng)物序列和/或該基因組的插入側(cè)以及位于該插入側(cè)處的側(cè)翼序列，將本發(fā)明的 多核苷酸與天然發(fā)生的對應(yīng)物區(qū)別開?！翱刹僮鞯仃P(guān)聯(lián)”和“可操作地連接”被可交換地使用，并且指將核酸序列結(jié)合到單 個的核酸片段上從而的功能被另影響。例如，當(dāng)啟動子能夠影響編碼序列或者功能RNA的 表達(dá)時(即，該編碼序列或功能RNA處于該啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下)，該啟動子與編碼序列 或者功能RNA是可操作地連接的或可操作地連接的。正義方向或者反義方向的編碼序列能 夠與調(diào)節(jié)序列進(jìn)行可操作地連接。術(shù)語“以任何顯著的程度存在”，如在本發(fā)明的上下文中所使用的，指以下事實(shí)， 即僅有可以忽略的表達(dá)發(fā)生在花粉中，導(dǎo)致在花粉組織中僅有少量的表達(dá)產(chǎn)物處于可以通 過高分辨率檢測方法例如HPLC、基于ELISA的測定法、蛋白質(zhì)印跡分析、昆蟲攝食測定法、酶活性測定法、等可檢出的濃度下，但停留在影響該表達(dá)產(chǎn)物的預(yù)想的生物功能所將需要 的某一閾值水平以下。例如，在蘇云金芽孢桿菌的CrylAbG6內(nèi)毒素的情況下，該閾值水平 是在5ng/mg可溶蛋白與60ng/mg可溶蛋白之間的范圍內(nèi)，特別地在20ng/mg可溶蛋白與 50ng/mg可溶蛋白之間的范圍內(nèi)。術(shù)語“嵌合基因”指包含以下各項(xiàng)的任何基因1)包括調(diào)節(jié)序列和編碼序列的DNA 序列，在自然界中這些調(diào)節(jié)序列和編碼序列沒有以這種特定的組合的形式被一起發(fā)現(xiàn)，或 2)對沒有天然鄰接的蛋白的部分進(jìn)行編碼的序列，或3)沒有天然鄰接的啟動子的部分。因 此，嵌合基因可以包括從不同來源得到的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或包括從相同來源得到的、 但以與在自然界中所發(fā)現(xiàn)的不同的方式進(jìn)行安排的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。

如在此使用的，術(shù)語“異源性DNA序列”、“外源性DNA區(qū)段”、或“異源性核酸”，各 自是指序列，該序列起始于對該特定的宿主細(xì)胞而言外來的來源、或若來自相同的來源則 是從其原始形式進(jìn)行修飾。因此，宿主細(xì)胞中的異源基因包括對于該特定宿主細(xì)胞是內(nèi)源 性的但是已經(jīng)通過例如使用DNA改組或突變而修飾的一種基因。這些術(shù)語還包括一種天然 發(fā)生的DNA序列的非天然發(fā)生的多種拷貝。因此，這些術(shù)語是指一種DNA區(qū)段，它是外來的 或與該細(xì)胞異源的或與該細(xì)胞同源的但是處于其中通常找不到該元件的該宿主細(xì)胞基因 組內(nèi)的位置中。表達(dá)了外源DNA區(qū)段以產(chǎn)生外源性多肽?！巴础盌NA序列是DNA序列，該 DNA序列是與將該DNA序列引入其中的宿主細(xì)胞天然地連接的?！稗D(zhuǎn)基因”是指基因，該基因已經(jīng)通過轉(zhuǎn)化被引入該基因組中并且被穩(wěn)定地保持。 轉(zhuǎn)基因可以包括例如對于有待轉(zhuǎn)化的特定植物的基因而言或者是異源的或者是同源的基 因。此外，轉(zhuǎn)基因可以包括被插入非天然生物中的天然基因或嵌合基因。術(shù)語“內(nèi)源基因” 是指在生物體的基因組中在它的天然位置中的天然基因?！巴鈦怼被蚴侵覆皇钦５匕l(fā)現(xiàn) 于宿主生物中但通過基因轉(zhuǎn)移被引入的基因。如在此所使用的，“表達(dá)盒”意思指DNA序列，該DNA序列能夠指導(dǎo)一種特定的核苷 酸序列在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中的表達(dá)，該DNA序列包括可操作地連接至感興趣的編碼蛋白的 多核苷酸上的啟動子，該感興趣的編碼該蛋白的多核苷酸被可操作地連接至終止子上。它 還典型地包括用于核苷酸序列的適當(dāng)翻譯所要求的序列。該編碼區(qū)通常對一種感興趣的蛋 白進(jìn)行編碼，但是還可能對一種感興趣的功能性RNA進(jìn)行編碼，例如在正義或反義方向上 的反義RNA或一種非翻譯性RNA。包括感興趣的編碼蛋白的多核苷酸的表達(dá)盒可以是嵌合 的?！皟?nèi)含子”指幾乎唯一地在真核基因中發(fā)生的DNA的內(nèi)插區(qū)段，但這個內(nèi)插區(qū)段在 該基因產(chǎn)物中沒有被翻譯成氨基酸序列。通過稱為剪接的過程從未成熟的mRNA中去除這 些內(nèi)含子，該剪接使外顯子未被觸及，從而形成mRNA。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“內(nèi)含子”的 定義包括對從目標(biāo)基因得到的內(nèi)含子的核苷酸序列進(jìn)行修飾，只要該修飾過的內(nèi)含子沒有 顯著地降低它的連接的5’調(diào)節(jié)序列的活性?！巴怙@子”是指攜帶對蛋白或其一部分進(jìn)行編碼的序列的DNA的區(qū)段。外顯子被內(nèi) 插的、非編碼序列(內(nèi)含子)分離。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語“外顯子”的定義包括對從目 標(biāo)基因得到的外顯子的核苷酸序列進(jìn)行修飾，只要該修飾過的外顯子沒有顯著地降低它的 連接的5’調(diào)節(jié)序列的活性。術(shù)語“蛋白”、“肽”和“多肽”在此被可交換地使用。
如在此所使用的“探針”是指可變長度的定義的核酸(DNA或RNA)片段，該片段可 以用于在含有DNA或RNA的樣品中檢測與由探針分子所表示的序列互補(bǔ)的核苷酸序列。這些探針分子可以被用于微陣列裝置中，其中這些探針分子被共價地附連到惰性 表面(例如包被的載玻片或基于硅的基因芯片)上的化學(xué)基質(zhì)上。探針分子與樣品中目 標(biāo)核酸的雜交通常發(fā)生在高嚴(yán)格條件下。通常通過基于熒光檢測熒光團(tuán)標(biāo)記的目標(biāo)對探 針-目標(biāo)雜交進(jìn)行檢測和定量以確定在該目標(biāo)中核酸序列的相對轉(zhuǎn)錄本豐度?？梢詫NA 微陣列用于表達(dá)譜試驗(yàn)以對組織樣品中(例如花粉和/或雄花穗的組織)目標(biāo)分子的轉(zhuǎn)錄 本豐度進(jìn)行定量，基于對應(yīng)樣品中所檢測到的信號的強(qiáng)度進(jìn)行計算。 如在此所使用的術(shù)語“雜交”是在常規(guī)的雜交條件，優(yōu)選地是指以下雜交條件，即 使用5xSSPE、l% SDSUxDenhardts溶液作為溶液和/或雜交溫度在35°C至70°C之間，優(yōu) 選地65°C。雜交后，優(yōu)選地首先用2xSSC、l% SDS并且隨后用0. 2xSSC在35°C至75°C之 間的溫度下、特別地在45°C至65°C之間、但特別地在59°C下進(jìn)行洗滌(關(guān)于上述引文中的 SSPE, SSC和Denhardts溶液的定義參見Sambrook等人)。高嚴(yán)格雜交條件，如例如以上 Sambrook等人中所述，是特別優(yōu)選的。特別地，優(yōu)選的嚴(yán)格雜交條件是例如如果如上表明在 65°C下進(jìn)行雜交并且洗滌時所存在的條件。非嚴(yán)格雜交條件，例如在45°C下進(jìn)行的雜交并 且洗滌，是較少優(yōu)選的并且在35°C下是更少優(yōu)選的?！靶蛄型葱曰蛐蛄型恍浴痹诖吮豢苫Q地使用。在兩個或更多個核酸或蛋 白序列的背景下，術(shù)語“一致性”(同一性)或百分比“一致性”是指當(dāng)使用以下序列比 較算法之一或通過目測測量時，當(dāng)比較和比對最大一致性時，兩個或更多個序列或子序 列是相同的或具有指定百分比的相同的氨基酸殘基或核苷酸。如果有待彼此比較的兩 個序列長度不同，序列同一性優(yōu)選地涉及較短序列的核苷酸殘基的百分比，該較短序列 的核苷酸殘基與該較長的核苷酸殘基是完全相同的。常規(guī)地通過使用計算機(jī)程序例如 Bestfit 禾呈序(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics ComputerGroup, University Research Park,575 Science Drive Madison, WI 53711)可 以確定序列同一'性。Bestfit 使用 Smith 禾口 Waterman (Advances in AppliedMathematics 2(1981)，482-489)的局部同源性算法以便找到兩個序列之間具有最大序列同一性的區(qū)段。 當(dāng)使用Bestfit或其他序列比對程序來確定是否特定的序列與本發(fā)明的參照序列具有例 如95%—致性時，優(yōu)選地對這些參數(shù)進(jìn)行這樣的調(diào)整從而在參照序列的整個長度上對一 致性的百分比進(jìn)行計算并且允許該參照序列中核苷酸的總數(shù)高達(dá)5%的同源性缺口。當(dāng) 使用Bestfit時，優(yōu)選將所謂的任選參數(shù)保留在它們預(yù)設(shè)(“默認(rèn)”)值。在給定的序列和 上述本發(fā)明的序列之間的比較中出現(xiàn)的偏差可能是由例如加成、缺失、取代、插入或重組引 起的。優(yōu)選地還可以使用程序“fasta20u66” (version 2. 0u66，1998年九月，由William R. Pearson 和佛吉尼亞大學(xué)編寫，也參見 W. R. Pearson(1990)，Methods in Enzymology 183，63-98，所附的實(shí)施例以及http://workbench, sdsc. edu/)進(jìn)行這樣一種序列比較。對 于這個目的，可以使用“缺省”參數(shù)。兩核酸序列實(shí)質(zhì)上是相同的另一種指標(biāo)是這兩種分子在嚴(yán)格條件下彼此雜交。短 語“特異性雜交”是指當(dāng)該序列存在于一種復(fù)合混合物(例如，總細(xì)胞的)DNA或RNA中時， 一種分子在嚴(yán)格條件下僅可與一種特定的核苷酸序列結(jié)合、雙鏈化或雜交。“基本上結(jié)合” 是指在探針核酸與目標(biāo)核酸之間的互補(bǔ)性雜交，并且包含少量的錯配，這些錯配可通過降低該雜交介質(zhì)的嚴(yán)格性而適應(yīng)，以實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)核酸序列的所希望的檢測。在核酸雜交實(shí)驗(yàn)的背景下(例如，DNA及RNA雜交)“嚴(yán)格雜交條件”和“嚴(yán)格雜交洗滌條件”是序列依賴的，并且在不同的環(huán)境參數(shù)下是不同的。較長的序列在較高的溫度下進(jìn) 行特異性地雜交。對核酸雜交的一種廣泛指導(dǎo)見于Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2" Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier,New York?？傮w上,所選擇的高嚴(yán)格雜交和洗滌 條件將是比在限定的離子強(qiáng)度和PH下該特定序列的熱解鏈點(diǎn)(Tm)低大約5°C。典型地，在 “嚴(yán)格條件”下，一種探針將會與它的目標(biāo)子序列進(jìn)行雜交，但不會與其他序列雜交。Tffl是50%的目標(biāo)序列與一種完全匹配的探針進(jìn)行雜交所處的溫度(在限定離子 強(qiáng)度及PH下)。極度嚴(yán)格條件選擇為等于對于一種特定探針的Tm。對于互補(bǔ)核酸(它們在 DNA或RNA印跡中在濾紙上具有超過100個互補(bǔ)的殘基)的雜交的嚴(yán)格雜交條件的實(shí)施例 是在42°C下、具有Img肝素的50%甲酰胺、將該雜交進(jìn)行過夜。高嚴(yán)格洗滌條件的實(shí)施例 是在72°C下，0. 15MNaCl，持續(xù)大約15分鐘。嚴(yán)格洗滌條件的實(shí)施例是在65°C下，0. 2xSSC 洗滌持續(xù)15分鐘(參見Sambrook，以下，對于SSC緩沖劑的說明)。通常，一種高嚴(yán)格洗滌 之前會先進(jìn)行一種低嚴(yán)格洗滌，以便去除背景探針信號。對于一種例如超過100個核苷酸 的雙鏈體的中等嚴(yán)格洗滌的實(shí)施例是在45°C下0. lxSSC，持續(xù)15分鐘。對于一種例如超過 100個核苷酸的雙鏈體的低嚴(yán)格洗滌的實(shí)施例是在40°C下4-6XSSC持續(xù)15分鐘。對于短探 針(例如，大約10-50個核苷酸)，嚴(yán)格條件典型地涉及小于約1. OM的Na+離子的鹽濃度， 典型地在pH 7. O至8. 3下，大約0. 01至1. OM的Na+離子濃度(或其他鹽類)，并且該溫度 典型地是至少約30°C。通過加入去穩(wěn)定試劑例如甲酰胺也可以實(shí)現(xiàn)嚴(yán)格條件。一般而言， 比在特定的雜交測定中觀察到的對于不相關(guān)的探針高2倍(或更高)的信噪比，表明檢測 到特異的雜交。如果它們所編碼的蛋白是基本上完全相同的，這些在嚴(yán)格條件下彼此不雜 交的核酸仍然是基本上完全相同的。這是(例如)在使用由該遺傳密碼所允許的最大密碼 子簡并產(chǎn)生一種核酸的拷貝時發(fā)生的?！爸参铩笔翘幱诎l(fā)育的任何階段的任何一種植物，特別是一種種子植物?！爸参锛?xì)胞”是植物的結(jié)構(gòu)和生理的單位，包括原生質(zhì)體和細(xì)胞壁。該植物細(xì)胞 可以是處于一種分離的單細(xì)胞或一種培養(yǎng)的細(xì)胞的形式、或作為高等組織化的單位(例如 像，一種植物組織、一種植物器官、或整株植物)的一部分?！爸参锛?xì)胞的培養(yǎng)物”是指植物單位的培養(yǎng)物，像例如原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì) 胞、植物組織中的細(xì)胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子以及處于不同的發(fā)育階段的胚。“植物材料”是指葉、莖、根、花或花的部分、果實(shí)、花粉、卵細(xì)胞、合子、種子、切條、 細(xì)胞或組織培養(yǎng)物、或植物的任何其他部分或產(chǎn)物。“植物器官”是植物的獨(dú)特的、并且具有可見結(jié)構(gòu)的、并且已分化的部分，如根、莖、 葉、花芽、或胚。如在此所使用的“植物組織”是指被組織成為一種結(jié)構(gòu)和功能單位的多個植物細(xì) 胞的組。包括了在植物中或在培養(yǎng)物中植物的任何組織。本術(shù)語包括但不局限于整株植 物、植物器官、植物種子、組織培養(yǎng)物以及被組織成結(jié)構(gòu)和/或功能單元的植物細(xì)胞的任何 組?！爸参锝M織”包括已分化的和未分化的組織或植物，包括但不限于根、莖、嫩枝、葉、花粉、種子、腫瘤組織、以及細(xì)胞和培養(yǎng)物的多種形式例如，單一的細(xì)胞、原生質(zhì)體、胚、和愈傷組 織。該植物組織可以在植物中或在器官、組織或細(xì)胞培養(yǎng)物中。本術(shù)語與如以上所列的任何特異類型的植物組織一起(或在其缺失時)的使用、 或通過由這項(xiàng)定義所涵蓋含的其他方式的使用并非旨在排除任何其他類型的植物組織。術(shù)語“玉米”、“苞米”以及“玉蜀黍”在此被可交換地使用并且指屬于玉蜀黍?qū)俚?植物包括例如玉蜀黍種的商用的或非商用的不同品系、種屬或品種。本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物，該植物包括穩(wěn)定地整合于其基因組中的嵌合的多核苷酸 構(gòu)建體，特別地一種嵌合的DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包括一種感興趣的編碼蛋白的多核苷酸， 特別地一種感興趣的編碼多肽或蛋白的多核苷酸，該多核苷酸處于調(diào)節(jié)核苷酸序列的控制 之下，該調(diào)節(jié)核苷酸序列的至少一部分具有一種轉(zhuǎn)錄起始功能指導(dǎo)所述感興趣的編碼蛋白 的多核苷酸表達(dá)于該植物的基本上所有組織中，除了這些雄性繁殖結(jié)構(gòu)的組織、特別地花 粉和/或雄花穗的組織之外，從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中。在用于篩選探針的表達(dá)譜實(shí)驗(yàn)中可以得到其至少一部分具有一種轉(zhuǎn)錄起始功能 的根據(jù)本發(fā)明的調(diào)節(jié)核苷酸序列，該轉(zhuǎn)錄起始功能介導(dǎo)了感興趣的可操作地連接的編碼蛋 白的多核苷酸表達(dá)于大多數(shù)組織中，除了這些雄性繁殖結(jié)構(gòu)的組織、特別地花粉和/或雄 花穗的組織之外，該探針在所有樣品中給出強(qiáng)信號但在花粉和/或雄花穗樣品中僅有微弱 的或沒有信號，這表明在大多數(shù)植物組織中表達(dá)了由所述探針表示的這些對應(yīng)的多核苷酸 但是在花粉和/或雄花穗的組織中不或基本上不表達(dá)。特別地，可以篩選玉米植物組織和 這些繁殖結(jié)構(gòu)的組織、特別地該花粉和/或雄花穗的組織以鑒別和得到根據(jù)本發(fā)明的調(diào)節(jié) 序列。

特別地，可以將所有植物組織的樣品，特別地玉米植物的綠色組織和根的樣品，直 接地與來自該雄性繁殖結(jié)構(gòu)的組織樣品、特別地花粉和/或雄花穗的組織樣品進(jìn)行比較。 將表示不符合該目標(biāo)表達(dá)譜的多核苷酸的探針消除。僅對在所有的非花粉/非雄花穗組織 中具有最強(qiáng)信號并且在花粉和/或雄花穗中具有弱或沒有信號的那些探針進(jìn)行選擇用于 進(jìn)一步分析，表示多核苷酸的探針是在所有組織樣品中高度表達(dá)但在花粉和/或雄花穗中 顯示基本上沒有表達(dá)的那些探針。然后可以將所述探針與植物cDNA裝配數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對 以檢測bona fide植物基因，特別地玉米基因或推測的玉米基因。按照實(shí)施例中所描述的這些步驟，被鑒定為在所有組織樣品中高度表達(dá)但在花粉 中基本上不表達(dá)的表示基因的玉米芯片上的DNA序列表示探針，特別地由如SEQ ID NO 47 至56中所給出的DNA序列所表示的探針以及在所有組織樣品中被高度表達(dá)的并且在雄花 穗樣品中具有基本上沒有或減少表達(dá)的那些表示基因，特別地由如SEQ ID N0:57-79中所 給出的DNA序列所表示的探針，可以容易地被延伸到所設(shè)計的表達(dá)盒中?？梢詫碜员磉_(dá)譜分析各表達(dá)種類所得到的探針候選序列進(jìn)行選擇并且前進(jìn)到 最終的二元載體中，其中所設(shè)計的表達(dá)盒連接到感興趣的基因(像例如報告基因，即GUS報 告基因)上。在第一步驟中，將一個或多個適合的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(像例如SanDI/RsrII位 點(diǎn))置于各表達(dá)盒的側(cè)翼并且克隆到該載體分子中。包括該轉(zhuǎn)錄起始功能的調(diào)節(jié)區(qū)典型地 位于該轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游處約1000-1500bp的片段中并且延伸到該第二外顯子中，或到 該天然翻譯起始密碼子中(如果它不在該第一外顯子上)。典型地，使用玉米優(yōu)化的Kozak序列'gtaaaccatgg'將它終止。然后將該設(shè)計的翻譯起始密碼子植入適合的限制性酶切 位點(diǎn)中，例如NcoI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)'ccatgg'。將位于該設(shè)計的限制性酶切位點(diǎn)的上游 處的理論的轉(zhuǎn)錄本中所有的翻譯起始密碼子進(jìn)行消除。至少一個終止密碼子應(yīng)當(dāng)存在與位 于該設(shè)計的限制性酶切位點(diǎn)的上游處的各閱讀框中。對包括該轉(zhuǎn)錄起始功能的調(diào)節(jié)區(qū)進(jìn)行 設(shè)計以將適合的限制性酶切位點(diǎn)置于側(cè)翼，像，例如，位于5'端的XhoI/SanDI位點(diǎn)和位于 3'端的NcoI位點(diǎn)。在在此給出的作為NcoI/SacI片段的實(shí)施例中，提供了感興趣的基因(GOI)例如 ⑶S報告基因作為適合的限制性酶切片段。該末端從剛好越過該翻譯終止密碼子向下游延 伸約lkb。對該末端進(jìn)行設(shè)計以便將適合的限制性酶切位點(diǎn)置于側(cè)翼，像，例如在5'端的 SacI 以及在 3'端的 RsrII/Xmal。

對該完全表達(dá)盒進(jìn)行設(shè)計以便作為適合的限制性酶切片段(例如SanDI/RsrII片 段)進(jìn)行移動，可以將該SanDI/RsrII片段連接入位于農(nóng)桿菌二元載體(例如在SEQ ID NO 80中給出的載體)上的相應(yīng)位點(diǎn)中。通過單堿基取代對在以上所鑒定的克隆步驟中所使用的所有內(nèi)部的限制性酶切 位點(diǎn)進(jìn)行突變以便將它們沉默。通過使用這些基本的步驟，植物表達(dá)盒可以被設(shè)計以應(yīng)答于對應(yīng)的探針分子，特 別地被鑒別為表示基因的玉米芯片上的探針分子(這些基因被高度表達(dá)于所有組織樣品 中但基本上不表達(dá)于花粉中)，特別地由如SEQ ID NO 47至56中所給出的DNA序列所表 示的探針以及被鑒定為在所有組織樣品中被高度表達(dá)并且在雄花穗樣品中基本上不或減 少表達(dá)的表示基因的那些探針，特別地由在SEQ ID NOs :57至79中所給出的DNA序列所表 示的探針。前者是能夠在所有玉米組織中被轉(zhuǎn)錄并且在花粉中不被轉(zhuǎn)錄的一種表達(dá)盒。后 者是能夠在所有玉米組織中被轉(zhuǎn)錄并且在雄花穗中不被或僅被適當(dāng)?shù)剞D(zhuǎn)錄的一種表達(dá)盒。 這個設(shè)計策略可以被用于表達(dá)譜實(shí)驗(yàn)中所鑒定的所有探針。在本發(fā)明的一個具體的實(shí)施方案中，使用上述指標(biāo)導(dǎo)致鑒定了展示所希望的表達(dá) 譜的那些基因。特別地，對編碼肌動蛋白結(jié)合蛋白3 (ABP3)，特別地玉米的肌動蛋白結(jié)合蛋 白3(ZmABP3)的基因進(jìn)行鑒定，該基因是小基因家族中的成員，該小基因家族以前已經(jīng)被 表征(Lopez et al.，1996)。該基因產(chǎn)物還被稱為肌動蛋白解聚因子3。通過DNA印跡分析顯示在玉米基因組中存在兩個ABP3基因(Lopez etal.，1996)， 分別地在此指定為ZmABP3-A和ZmABP3_B。ZmABP3_A和ZmABP3_B cDNA編碼一個除了一個 以外，在所有殘基上完全相同的139個氨基酸的蛋白。表達(dá)譜數(shù)據(jù)表明ZmABP3-B被高度表 達(dá)于該植物的大多數(shù)組織中，但基本上排除表達(dá)于該花粉的組織中，從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以 任何顯著的程度存在于所述組織中，而ZmABP3-A沒有被像這樣被高度表達(dá)。ZmABP3-B基因的結(jié)構(gòu)分析顯示ZmABP3_B蛋白編碼區(qū)被編碼于3個外顯子上，這3 個外顯子被側(cè)翼是所期望的GT. . . AG邊緣核苷酸的兩個內(nèi)插序列(內(nèi)含子)中斷。該調(diào)節(jié)序列被置于該編碼序列的緊鄰上游的ABP3基因的5'-區(qū)中。該調(diào)節(jié)區(qū)的 尺寸是在約2kb至3kb之間的范圍內(nèi)，特別地在約2. 3kb至2. 5kb之間，并且包含5'-非 轉(zhuǎn)錄性序列，特別地約0. 9kb至1. 3kb之間的5'-非轉(zhuǎn)錄性序列，但特別地約1. Ikb,以及 5 ‘ -UTR，特別地約0. Ikb至0. 3kb之間，但特別地0. 25kb的5 ‘ -UTR，以及表示ZmABP3_內(nèi) 含子1的核苷酸序列的全部或部分，特別地，約0. 7kb至1. 2kb之間的核苷酸序列，但特別地約 0. 98kb。根據(jù)本發(fā)明該調(diào)節(jié)序列進(jìn)一步包括剛好越過該ABP3翻譯終止密碼子開始的3' 序列的一部分，包括被轉(zhuǎn)錄但不被翻譯的序列(UTR)和作為轉(zhuǎn)錄終止子和多腺苷酸化信號 起作用的不被轉(zhuǎn)錄的序列。特別地，該3'-序列是在約0.8kb至約1.2kb之間的范圍內(nèi)， 特別地約0. 9kb至約1. Ikb,但特別地約1. 013kb。該3 ‘ -UTR的尺寸是在約0. 2kb至約 0. 4kb之間的范圍內(nèi)，但特別地約0. 3kb，并且該非轉(zhuǎn)錄性序列的尺寸在約0. 5kb至約0. 8kb 之間的范圍內(nèi)，但特別地約0. 7kb。
在本發(fā)明的一個具體的實(shí)施方案中，對該調(diào)節(jié)序列進(jìn)行修飾從而將該天然翻譯終 止密碼子沉默以將它移動到該第二外顯子中。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，可以在DNA芯片或基因陣列上對候選探針進(jìn)行鑒 定，特別地玉米DNA芯片或基因陣列，例如，如使用上述指標(biāo)的玉米Affymetrix 芯片，該芯 片能夠被用于在展示所希望的表達(dá)譜的玉米基因組上鑒定基因或推測的基因。將兩個候選 探針進(jìn)行鑒定，這兩個探針證實(shí)了在雄花穗中幾乎沒有信號但是在其他組織中具有高的信 號。這表明由所述候選探針?biāo)硎镜幕蛟谛刍ㄋ胫袥]有表達(dá)并且在遍及該植物的其余部 分中被高度地表達(dá)。在候選探針Zm033444_S_AT中觀察到最大的表達(dá)差異，在非雄花穗組 織中高60倍。另一個候選探針(Zm040564_X_AT)顯示根據(jù)該被探測植物物質(zhì)的發(fā)育情況 進(jìn)行信號改變，即當(dāng)該植物變老時，在年幼的雄花穗中的低信號逐漸地增加到高或強(qiáng)信號。 雄花穗和非雄花穗樣品之間的信號強(qiáng)度差別達(dá)低于10倍，但與另一個候選探針相比非雄 花穗樣品中的信號強(qiáng)度幾乎比它高10倍。這些序列數(shù)據(jù)表明這兩種探針都不相應(yīng)于一種 特征標(biāo)記的基因。兩種探針都鑒別了用于開發(fā)啟動子的良好的候選基因，該啟動子在非雄 花穗組織中提供了高表達(dá)并且在雄花穗中提供了很少的或沒有表達(dá)。給定雄花穗與非雄花 穗樣品之間的高信號差異，開發(fā)出基于探針Zm033444_S_AT的一種表達(dá)盒。可以使用候選探針Zm033444_S_AT序列通過BLASTN查詢公共的和專有數(shù)據(jù)庫以 得到用于轉(zhuǎn)錄本和相應(yīng)于Zm033444_S_AT的gDNA的DNA序列證據(jù)。與該查詢序列精確匹 配的的cDNA命中落在兩個相似的重疊群中。ZmABTl相應(yīng)于玉米1482. c47和玉米1908. c31，并且 ZmABT2 相應(yīng)于玉米 1482. c32、玉米 1482. c28、玉米 1482. c53、玉米 1908. cl7、玉 米 1908. c20、玉米 1908. c37 和 AI947567。然后使用Zm033444_S_AT、ZmABT 1和ZmABT2序列來查詢玉米基因組DNA序列 數(shù)據(jù)庫來鑒定該一個或多個調(diào)節(jié)序列，該一個或多個調(diào)節(jié)序列在非雄花穗組織中給出 高表達(dá)并且在雄花穗中給出很少的或沒有表達(dá)。這些查詢鑒定了三個條目，AZM4_12、 ZmGSStucl 1-12-04. 4740. 1、以及MAGI_88845，這三個條目組裝成單個的重疊群。該ZmABT gDNA序列示于SEQ ID NO 46中。它編碼ZmABTl和ZmABT2這兩個轉(zhuǎn)錄本，它表明這兩個 轉(zhuǎn)錄本是相同的轉(zhuǎn)錄本的可替代的剪接的變體。ZmABTl被編碼在5個外顯子上，并且ZmABT2被編碼在6個外顯子上。額外的外顯 子位于ZmABTl的外顯子1和外顯子2之間。可以使用ZmABTl和ZmABT2上的最大開放閱 讀框來定義它們的翻譯起始和終止密碼子并且進(jìn)一步來定義各翻譯起始和終止密碼子的 位置。通過這個分析，這兩個cDNA都使用相同的翻譯起始和終止密碼子。在本發(fā)明的一個重要的方面中，根據(jù)本發(fā)明該調(diào)節(jié)序列可以被用于開發(fā)強(qiáng)表達(dá) 盒，這些表達(dá)盒在該植物的大多數(shù)組織中表達(dá)重組基因，但在雄性繁殖結(jié)構(gòu)的組織中特別地在花粉和/或雄花穗的組織中不或基本上不表達(dá)從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度 存在于所述組織中。在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中，可以將可從ABP3基因得到的調(diào)節(jié)序列、更特別 地可從玉蜀黍ABP3基因得到的調(diào)節(jié)序列用于開發(fā)強(qiáng)表達(dá)盒，該表達(dá)盒在該植物的大多數(shù) 組織中但基本上排除花粉的組織表達(dá)重組基因從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在 于所述組織中。根據(jù)本發(fā)明該調(diào)節(jié)序列的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，特別地從ABP3基因中可得到的調(diào)節(jié)序列 的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，更特別地從玉蜀黍ABP3基因中可得到的調(diào)節(jié)序列的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)可以通過 從gDNA模板，特別地玉米gDNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，在PCR反應(yīng)中得到，該P(yáng)CR反應(yīng)包括引物對， 該弓丨物對包括正向弓丨物 Pl (5‘ -atatatgcatgcggcgcgccgaaagtagcaaacaacaggttcatgtgca c-3')(如 SEQ ID NO :1 中所述)禾口反向弓丨物 P2(5' -tatataccatggtgggtttgcctgcgaccac aagttca-3')(如SEQ IDNO :2中所述)。在本發(fā)明的具體的實(shí)施方案中，使用熱循環(huán)程序， 該程序包括在以下條件下進(jìn)行擴(kuò)增在約95°C下持續(xù)約15分鐘，隨后在約94°C下持續(xù)約1 分鐘約45個循環(huán)，在約64°C下持續(xù)約1分鐘并且在約72°C下持續(xù)約5分鐘。在約72°C下 持續(xù)約15分鐘完成最終的延伸步驟。將反應(yīng)產(chǎn)物，特別地約2. 3kb的反應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行純化 并且使用本領(lǐng)域中已知的DNA提取方法提取DNA。將該DNA沉淀、回收、并且最終克隆入適 合的載體中。可以使用選自下組寡核苷酸的寡核苷酸中的至少一項(xiàng)將根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄起始 區(qū)，特別地從ABP3基因中可得到的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，更特別地從ZmABP3中可得到的轉(zhuǎn)錄起始區(qū) 在一系列反應(yīng)中進(jìn)行修飾，該組寡核苷酸描述如下-SEQ ID NO 3 (Patg(5‘ _cagctcgcccgagttggtaaggccccct_3‘))， -SEQ ID NO :4(Pnco(5' -acagattagtccatcgcccacggt-3‘))，-SEQ ID NO :5(ADPc-l(5' -agccctgtccatgacggcccaagcaac-3‘))，-SEQ ID NO :6(ADPc-2(5' -agtagcaattcggtaggcacaggcac-3‘)),-SEQ ID NO :7(ADPc-4(5' -tctatggtctgcgaggtgcggtggc-3')),以及-SEQ ID NO :8(adp3_a(5' -gtccccttcttcgccgcgccagctcgc-3'))?？梢栽谑褂谜蚬璉 物(P3(5 ' -tatatagagctcgcatcatgatcatgcatcatggac t-3'))(如 SEQ ID NO :9 中所述)禾口反向引物(P4(5' -atatatactagtggcgcgccacactttct gtcgcatgtgatttgca-3'))(如SEQ ID N0:10中所述)的DNA聚合酶反應(yīng)中從gDNA模板、 特別地玉米gDNA模板將根據(jù)本發(fā)明的調(diào)節(jié)序列的末端、特別地從ABP3基因中可得到的末 端序列、更特別地從ZmABP3中可得到的末端序列進(jìn)行擴(kuò)增?？梢允褂脽嵫h(huán)程序，該程序 包括約95°C持續(xù)約5分鐘的第一循環(huán)，隨后約94°C持續(xù)約30秒約45個循環(huán)，約50°C持續(xù) 約1分鐘并且約72°C持續(xù)約4分鐘。在約72°C下持續(xù)約15分鐘可以完成最終的延伸步驟。 然后將該約Ikb反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行純化并且使用標(biāo)準(zhǔn)提取方法提取DNA。將該DNA沉淀、回收并 且克隆入適合的載體中。可以在DNA聚合酶反應(yīng)中，使用適合的引物對、特別地引物對Tnco (5' -Pgtaaaaa aaggtcccttggctcccagaaga-3 ‘ ) /T2 (5 ‘ -Pcaatgtgttagactgacgtg-3 ‘)(女口分另Iji也在 SEQ ID N0:11和SEQ ID N0:12中所述)將根據(jù)本發(fā)明的調(diào)節(jié)序列的末端、特別地從ABP3基因 中可得到的末端序列、更特別地從ZmABP3中可得到的末端序列進(jìn)行修飾以去除內(nèi)部限制性酶切位點(diǎn)，特別地NcoI限制性酶切位點(diǎn)。所使用的熱循環(huán)程序可以包括在約95°C下持續(xù) 約5分鐘的第一循環(huán)，隨后約95°C持續(xù)約1分鐘約30個循環(huán)，約50°C持續(xù)約1分鐘并且約 65°C持續(xù)約15分鐘。然后可以將該產(chǎn)物進(jìn)行處理并測序。本發(fā)明還針對結(jié)合感興趣的一種目標(biāo)基因的這些調(diào)節(jié)機(jī)制的表達(dá)盒，該目標(biāo)基因 顯示所希望的表達(dá)譜，該目標(biāo)基因在大多數(shù)植物組織中是高度表達(dá)的但在花粉組織中不表 達(dá)，特別地ABP目標(biāo)基因，更特別地ZmABP3目標(biāo)基因，本發(fā)明針對在植物中以模擬該原始目 標(biāo)基因的表達(dá)譜的方式控制感興趣的核酸分子的產(chǎn)物的表達(dá)。本發(fā)明進(jìn)一步包括多個表達(dá)盒，這些表達(dá)盒結(jié)合從該目標(biāo)基因的5’區(qū)、特別地 ABP目標(biāo)基因的5’區(qū)、更特別地ZmABP3目標(biāo)基因的5’區(qū)中可得到的調(diào)節(jié)序列，以在植物組 織中表達(dá)感興趣的核酸分子的產(chǎn)物但在花粉組織中不或基本上不表達(dá)。本發(fā)明還針對結(jié)合 從該目標(biāo)基因的5’區(qū)和3’區(qū)、特別地ABP3目標(biāo)基因的5’區(qū)和3’區(qū)、更特別地ZmABP3目 標(biāo)基因的的5’區(qū)和3’區(qū)中可得到的兩個調(diào)節(jié)序列的表達(dá)盒。

在本發(fā)明的另一個具體的實(shí)施方案中，可以將從玉米基因組DNA中可得到的調(diào)節(jié) 序列用于開發(fā)強(qiáng)表達(dá)盒，該表達(dá)盒在該植物的大多數(shù)組織中但基本上排除雄花穗的組織中 轉(zhuǎn)錄多核苷酸從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中?？梢允褂靡环N包括在內(nèi)的、基于基因結(jié)構(gòu)的設(shè)計策略來構(gòu)建這樣表達(dá)盒。為了將 在如上述方法中鑒定的該推測的玉米基因的已知的可替代的剪接結(jié)合入該表達(dá)盒中，該設(shè) 計策略可以基于ZmABTl轉(zhuǎn)錄本(示于SEQ ID NO 33中)的結(jié)構(gòu)。可以在DNA聚合酶反應(yīng)中，從玉米gDNA模板將根據(jù)本發(fā)明的調(diào)節(jié)序列的轉(zhuǎn)錄起始 區(qū)、特別地該ZmABT啟動子區(qū)的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，該DNA聚合酶反應(yīng)包含gDNA和引物 對，該引物對包括正向引物ABT Pl forw(5‘ -CGACCAGCGCGACATGCATGGCA-3‘ ) GnSEQ ID NO 19 中所述)和 ABT P2rev (5 ‘ -ACCCCAGGGCGTACGACAAGGCC-3 ‘)(如 SEQ ID NO 20 中 所述)。在本發(fā)明的一個具體的實(shí)施方案中，使用熱循環(huán)程序，該程序包括在以下條件下進(jìn) 行擴(kuò)增在約95°C下持續(xù)約5分鐘，隨后94°C持續(xù)約30分鐘約40個循環(huán)，約67°C持續(xù)約 30秒并且約72°C持續(xù)約2. 5分鐘。在約72°C下持續(xù)約10分鐘完成最終的延伸步驟。這個擴(kuò)增反應(yīng)導(dǎo)致約2. 6kb的擴(kuò)增產(chǎn)物，可以將該擴(kuò)增產(chǎn)物純化并且使用一 種標(biāo)準(zhǔn)的DNA提取方法提取DNA。然后可以將該DNA克隆入適合的載體中，例如，如該 pCR-BluntlI-TOPO 載體?？梢栽谝幌盗械恼T變反應(yīng)中對該ZmABT啟動子進(jìn)行修飾以沉默該內(nèi)源性的翻譯 起始密碼子，沉默SanDI限制性酶切位點(diǎn)并且校正在擴(kuò)增期間產(chǎn)生的點(diǎn)突變。可以使用選 自下組寡核苷酸的寡核苷酸中的至少一項(xiàng)在一系列的反應(yīng)中完成這項(xiàng)工作，該組寡核苷酸 包括-SEQ ID NO 2IpABT mutl(5' -GATGGCCGGATTGGGCTCCCGGGGTGGAG-3')-SEQ ID NO :22pABT mut2(5' -CTGGGAGGCGCGCAAGGGGCAGTTCCTCG-3')-SEQ ID NO :23pABTmut3(5' -CCCACCGCCGGAGCACCGAAAGGCCCCGCG-3')-SEQ ID NO :24pABT mut4
(5' -GTCACCCGGGAGCACTTCCCGGCGCCG-3‘)-SEQ ID NO :25pABT mut5(5' -CATTGGGCCGAGCACGGCTTCTTCCGC-3')
-SEQ ID NO :26pABT mut6(5' -GGGGTACGGTGTTCTTGAGTCGTGAAGCGAC-3')可以在另一個PCR 反應(yīng)中使用引物 pABT amp 1(5' -GCGTCTAGAGGGACCCCGACCAGCG CGACATGCATGGCA-3 ‘)(如 SEQID NO 27 中所述)和 pABT amp2 (5 ‘ -ACCCCAGGG-CGTACGAC AAGGCCCCACCATGGGCGC-3‘)(如SEQ ID NO 28中所述)將該修飾過的ZmABT啟動子進(jìn)行 擴(kuò)增。然后可以將該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行純化并且使用一種標(biāo)準(zhǔn)的DNA提取方法提取DNA?？梢?將該DNA克隆入一個適合的載體中(例如，如該pCR-Blimtll-TOPO載體)，轉(zhuǎn)化并且測序。 然后可以將該ZmABT啟動子切除(特別地作為Xbal/Ncol片段)并且連接到適合的表達(dá)載 體上(例如，如PN0V6901)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，提供了表達(dá)盒，該表達(dá)盒包括終止序列，該終止序列 可以從已被鑒定的并且在以上描述的ZmABT基因中得到。可以在DNA聚合酶反應(yīng)中，從玉米 gDNA模板將該ZmABT末端進(jìn)行擴(kuò)增，該DNA聚合酶反應(yīng)包含gDNA和引物對，該引物對包括 正向引物 ABT P4 (5 ‘ -TATATAGAGCTCGAATCGAAGAAGCCACACTGTAAATCTGCCGGG-3 ‘)(如 SEQ ID NO 29 中所述)和反向引物 ABT P5 (5 ‘ -AGCAAGGCATATGCAGCAGCTGCTGGTCGGACCGGGCC CTATATA-3')(如SEQ ID NO 30中所述)，生成約Ikb的擴(kuò)增產(chǎn)物?？梢詫⒃摲磻?yīng)產(chǎn)物進(jìn) 行純化并且使用一種標(biāo)準(zhǔn)的DNA提取方法提取DNA。然后可以將該純化的DNA克隆入適合 的載體中，例如，如該pCR4-T0P0-Blunt載體。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，對該ZmABP3末端進(jìn)行修飾以去除內(nèi)部的NcoI和 XhoI限制性酶切位點(diǎn)。可以使用選自下組寡核苷酸的寡核苷酸中的至少一項(xiàng)在一系列的反 應(yīng)中完成這項(xiàng)工作，該組寡核苷酸包括-SEQ ID NO 3IABTt ml(5' -GTCATGCATGGGCATGTGAAGGAGGAGCC-3‘)-SEQ ID NO :32ABTt m2(5' -GTTGCATGCATGCTGCATGGCGTCGAGAT-3‘)然后可以將該擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行處理并且測序以生產(chǎn)如SEQ ID NO 36中所示的終止 子序列。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，提供了表達(dá)盒，該表達(dá)盒在該植物的大多數(shù)組織中 但基本上排除在雄花穗的組織中表達(dá)重組基因從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在 于所述組織中，該表達(dá)盒包括其至少一部分具有一種轉(zhuǎn)錄起始功能的調(diào)節(jié)序列和其至少一 部分具有一種終止功能的調(diào)節(jié)序列兩者，這些調(diào)節(jié)序列可以從已鑒定的并且以上描述的 ZmABT基因中得到。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，通過切除該被切除的ZmABT末端并且將它連接到適 合的載體上可以得到這樣一種表達(dá)盒，該適合的載體已經(jīng)包括了其至少一部分具有一種轉(zhuǎn) 錄起始功能的調(diào)節(jié)序列，特別地該ZmABT啟動子的序列例如，如上述的pN0V6901-prABT載 體。在一個實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒包含調(diào)節(jié)核苷酸序列，該核苷酸序列包 括約2. 6kb的5 ‘-序列，該5 ‘-序列的組成為約2kb的5 ‘-非轉(zhuǎn)錄性序列、和約12bp 的5' -UTR、約0.6kb表示外顯子1、內(nèi)含子1、和約16bp的外顯子2 ；以及約Ikb的3'-序列，該3'-序列在剛好越過該翻譯終止密碼子處開始并且包括約0.6kb的3' -UTR和約 0. 4kb的非轉(zhuǎn)錄性序列，并且作為轉(zhuǎn)錄終止子和多腺苷酸化信號起作用。在一個實(shí)施方案中，提供一種根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒，其中該天然翻譯終止密碼子 被沉默并被移到該第二外顯子中。然后可以將該完全的表達(dá)盒移入適 合的載體中用于植物轉(zhuǎn)化和表達(dá)，例如，如農(nóng) 桿菌二元載體，特別地農(nóng)桿菌二元載體15289。該感興趣的核酸片段可以例如編碼核糖體RNA、一種反義RNA或不被翻譯成蛋白 的任何其他類型的RNA。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，感興趣的核酸片段被翻譯成 一種蛋白產(chǎn)物。指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列和/或核酸片段相對于有待轉(zhuǎn)化的植物可以是同源 來源的或異源來源的。對于引入植物細(xì)胞中有用的重組DNA分子包括從任何來源得到或分 離的那種分子，隨后可以對這種分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)尺寸和/或功能的表征、進(jìn)行化學(xué)改變、并且 稍后引入植物中。因此，一種有用的核苷酸序列、區(qū)段或感興趣的片段包括完全合成的DNA、 半合成的DNA、從生物來源中分離的DNA、等。一般地，該引入的DNA不是最初駐留在該植物 基因型中的，該植物基因型是該DNA的受體，但從一個給定的植物基因型中分離基因，并且 隨后將該基因的多個拷貝引入該相同的基因型中(例如，提高一種給定的基因產(chǎn)物(例如 一種儲藏蛋白)或涉及碳水化合物代謝的一種蛋白或感興趣的任何其他基因(如序列表的 SEQ ID NO中所提供的)的生產(chǎn))是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。被引入的重組DNA分子包括但不限于來自植物基因、以及非植物基因(例如來自 細(xì)菌、酵母、動物或病毒的那些)的DNA。被引入的DNA可以包括修飾的基因、基因的部分、 或嵌合基因，包括來自相同或不同基因型的基因。術(shù)語“嵌合基因”或“嵌合DNA”被定義為 包括來自多個物種的至少兩個DNA序列或片段的一個基因或DNA序列或片段，在自然條件 下這些物種不結(jié)合DNA，或該DNA序列或片段以未轉(zhuǎn)化的植物的天然基因組中正常不會發(fā) 生的方式被定位或連接。用于在此轉(zhuǎn)化的被引入的重組DNA分子可以是環(huán)形的或線性的、雙鏈的或單鏈 的。一般地，DNA處于嵌合DNA的形式，例如質(zhì)粒DNA。在一個實(shí)施方案中，可以將這些調(diào)節(jié)序列與感興趣的可表達(dá)的多核苷酸進(jìn)行可操 作地連接。該可表達(dá)的多核苷酸可以編碼感興趣的多肽或蛋白。這樣一種感興趣的多肽或蛋白可以是一種展示某一生物活性的多肽或蛋白(例 如，如一種殺蟲、除草或殺真菌活性)或可以以改善產(chǎn)量、品質(zhì)、倒伏、生物的和非生物的脅 迫耐受性、開花控制等形式有助于農(nóng)學(xué)上感興趣的一種作物植物的改善的性能。在一個實(shí)施方案中，從這些繁殖結(jié)構(gòu)的組織中、特別地花粉和/或雄花穗的組織 中感興趣的編碼蛋白的多核苷酸中表達(dá)的該多肽產(chǎn)物的濃度是這樣的即在標(biāo)準(zhǔn)的昆蟲攝 食測定法中不能檢測到殺蟲的活性。特別地，這些雄性繁殖結(jié)構(gòu)的組織中、特別地花粉和/ 或雄花穗的組織中表達(dá)產(chǎn)物的濃度是低于約lOng/mg可溶蛋白的基本水平，特別地約5ng/ mg可溶蛋白，更特別地約3ng/mg可溶蛋白，但特別地約2ng/mg可溶蛋白或以下。在本發(fā)明的一個具體的實(shí)施方案中，該感興趣的多肽或蛋白是一種殺蟲活性蛋白 或多肽，特別地一種能從蘇云金芽孢桿菌中得到的殺蟲活性的蛋白或多肽，更特別地一種 蘇云金芽孢桿菌內(nèi)毒素，例如，如crylA(b)內(nèi)毒素。已知在蘇云金芽孢桿菌中存在的其他 內(nèi)毒素可以同樣被用于與根據(jù)本發(fā)明的調(diào)節(jié)序列結(jié)合以得到毒素表達(dá)于除了花粉和/或雄花穗以外的大多數(shù)植物組織中從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中。在一個實(shí)施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中感興 趣的編碼該多肽或蛋白的多核苷酸編碼蘇云金芽孢桿菌的內(nèi)毒素，具有與SEQ ID N0:15 中所述的一種核苷酸序列至少80%序列同一性，特別地至少85%序列同一性、特別地至少 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%^； 99%序列同一性。

在一個實(shí)施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中該感 興趣的編碼多肽或蛋白的多核苷酸編碼了一種蘇云金芽孢桿菌的內(nèi)毒素，具有如SEQ ID NO 15中所述的核苷酸序列。一旦完成，可以將該表達(dá)盒移入適合的載體中用于植物轉(zhuǎn)化，例如，如然后可以通 過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化將一種二元載體移入玉米中?？梢酝ㄟ^許多種已建立的技術(shù)生成結(jié)合本發(fā)明的多核苷酸和/或表達(dá)感興趣的 多肽(例如，如一種蘇云金芽孢桿菌的的毒素蛋白)的轉(zhuǎn)基因植物(或植物細(xì)胞、或植物外 植體、或植物組織)。根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述構(gòu)建表達(dá)盒以及結(jié)合該調(diào)節(jié)多核苷酸序 列的載體之后，可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來將該多核苷酸引入感興趣的一種植物、一種植物細(xì)胞、 一種植物外植體或一種植物組織中。任選地，可以將該植物細(xì)胞、外植體或組織進(jìn)行再生以 生成轉(zhuǎn)基因植物。該植物可以是任何高等植物，包括裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物。 適合的實(shí)驗(yàn)方案對于豆科(苜蓿、大豆、三葉草、等)、傘形科(胡蘿卜、芹菜、歐洲防風(fēng)草 (parship))、十字花科(甘藍(lán)、蘿卜、油菜籽、青花椰菜、等)、葫蘆科(甜瓜和黃瓜)、禾本科 (小麥、玉米、稻、大麥、粟、等)、茄科(馬鈴薯、番茄、煙草、胡椒、等)以及多種其他作物是 可獲得的。參見 Ammiratoet al. , eds. , (1984)Handbook of Plant Cell Culture—Crop Species, MacmiIlanPubl. Co., New York, N. Y. ；Shimamoto et al. (1989)Nature 338 274276 ；Frommet al. (1990)Bio/Technol. 8 833839 ；以及 Vasil et al. (1990)Bio/ Technol. 8 =429434中所述實(shí)驗(yàn)方案。單子葉植物細(xì)胞和雙子葉植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和再生現(xiàn) 在是常規(guī)性的，并且選擇最適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化技術(shù)將由實(shí)際工作者進(jìn)行確定。方法的選擇將隨著 有待轉(zhuǎn)化的植物的類型而改變；本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解對于給定的植物類型特定 方法的適合性。適合的方法可以包括但不限于植物原生質(zhì)體的電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn) 化、聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、使用病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)化、植物細(xì)胞的微注射、植物細(xì)胞的微彈 轟擊、真空滲透、以及根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。用單一 DNA分子或多種DNA分子(即，共轉(zhuǎn)化)可以進(jìn)行植物的轉(zhuǎn)化，并且這兩種 技術(shù)都適合使用本發(fā)明的表達(dá)盒。可獲得多種轉(zhuǎn)化載體用于植物轉(zhuǎn)化，并且可以將本發(fā)明 的表達(dá)盒用于與任何這類載體進(jìn)行連接。載體的選擇將取決于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)以及用于轉(zhuǎn) 化的目標(biāo)物種。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解并可使用多種技術(shù)來將構(gòu)建物引入植物細(xì)胞宿主中?？傮w 上，這些技術(shù)包括使用一種根癌農(nóng)桿菌(A. tumefaciens)或毛根農(nóng)桿菌(A. rhizogenes)作 為轉(zhuǎn)化試劑用DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)體、PEG沉淀、電穿孔、DNA注射、直接DNA攝入、微彈轟擊、 顆粒加速、等(參見，例如，EP 295959和EP 138341)(參見以下)。然而，可以用本發(fā)明的 表達(dá)盒轉(zhuǎn)化除了植物細(xì)胞以外的細(xì)胞。植物表達(dá)載體和報告基因、以及農(nóng)桿菌和農(nóng)桿菌介 導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的一般性描述可以在Gruber等人(1993)中找到?？梢詫鶕?jù)本發(fā)明的調(diào)節(jié)多核苷酸序列的表達(dá)載體引入原生質(zhì)體中或引入完整的組織或分離的細(xì)胞中。優(yōu)選地，將表達(dá)載體引入完整的組織中。例如，由Maki等人 (1993)并且由Phillips等人(1988)提供了培養(yǎng)植物組織的一般性的方法。優(yōu)選地，使用一 種直接基因轉(zhuǎn)移方法(例如微彈介導(dǎo)的遞送、DNA注射、電穿孔等)將表達(dá)載體引入玉米或 其他植物組織中。更優(yōu)選地，使用基因槍裝置使用微彈介導(dǎo)的遞送將表達(dá)載體引入植物組 織中。參見例如Tomes等人(1995)。本發(fā)明的載體不但能夠被用于表達(dá)結(jié)構(gòu)基因而且可以 被用于外顯子捕獲克隆或啟動子捕獲步驟中以檢測多種組織中差異的基因表達(dá)(Lindsey et al. , 1993 ；Auch & Reth et al.)。使用農(nóng)桿菌屬的Ti和Ri質(zhì)粒的二元類型的載體是特別優(yōu)選的。Ti衍生的載體 轉(zhuǎn)化了多種多樣的高等植物，包括單子葉植物和雙子葉植物，例如大豆、棉花、油菜、煙草、 以及禾S (Pacciotti et al. , 1985 :Byrne et al. , 1987 ；Sukhapinda et al. , 1987 ；Lorz et al.，1985 ；Potrykus, 1985 ；Park et al.，1985 =Hieiet al.，1994)。使用 T-DNA來轉(zhuǎn)化植物 細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)行了廣泛的研究并且被詳細(xì)描述(EP 120516 ；Hoekema, 1985 ；Knauf, et al.， 1983;以及An et al.，1985)。為了引入植物中，可以如在實(shí)施例中所述將本發(fā)明的嵌合基 因插入二元載體中。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，方法的選擇應(yīng)當(dāng)取決于用于轉(zhuǎn)化所靶向的植物 的類型(即單子葉植物或雙子葉植物)。轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的適合的方法包括但不限于，微注射 (Crossway等人，1986)、電穿孔(Riggs等人，1986)、土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Hinchee等人， 1988)、直接基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等人，1984)、以及使用可從Agracetus公司(威斯康辛 州麥迪遜)和BioRad(加利福尼亞州赫格拉斯)可獲得的裝置進(jìn)行彈道顆粒加速(參見，例 如，Sanford等人，美國專利號4，945，050 ；和McCabe等人，1988)。還參見，Weissinger等 人，1988 ；Sanford 等人，1987 (蔥頭)；Christou 等人，1988 (大豆)；McCabe 等人，1988 (大 豆)；Datta 等人，1990(稻)；Klein 等人，1988 (玉米)；Klein 等人，1988 (玉米)；Klein 等人，1988 (玉米)；Fromm等人，1990 (玉米)；以及Gordon-Kamm等人，1990 (玉米)； Svab 等人，1990 (煙草葉綠體)；Koziel 等人，1993 (玉米)；Shimamoto 等人，1989 (稻)； Christou等人，1991 (稻)；歐洲專利申請E P 0332581 (鴨茅和其他早熟禾亞科)；Vasil等 人，1993(小麥)；Weeks等人，1993 (小麥)。在一個實(shí)施方案中，使用用于玉米的原生質(zhì)體 轉(zhuǎn)化方法(歐洲專利申請EP 0292435、美國專利號5，350，689)。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的一種核苷酸序列被直接轉(zhuǎn)化進(jìn)入質(zhì)體基因組中。 質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)在美國專利號5,451,513,5, 545,817、和5，545,818中、在PCT申請?zhí)朩O 95/16783、并且在McBride等人，1994中進(jìn)行了廣泛地說明。轉(zhuǎn)化后，優(yōu)選地使用一種被結(jié) 合入該轉(zhuǎn)化載體中的顯性選擇性標(biāo)記對植物進(jìn)行選擇。典型地，這樣一種標(biāo)記將在這些轉(zhuǎn) 化的植物上提供抗生素或除草劑抗性，并且通過將這些植物暴露于適當(dāng)濃度的抗生素或除 草劑下可以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化體的選擇。將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或植物進(jìn)行選擇并且生長至成熟之后，對顯示感興趣的性狀的 那些植物進(jìn)行鑒定。該性狀可以是上述那些性狀中的任何一項(xiàng)。此外，為了證實(shí)感興趣的 性狀是由于在根據(jù)本發(fā)明的調(diào)節(jié)核苷酸的控制下感興趣的被引入的多核苷酸的表達(dá)，使用 RNA印跡、RT-PCR或微陣列通過分析mRNA表達(dá)或使用免疫印跡或蛋白質(zhì)印跡或酶活性測定 通過分析蛋白表達(dá)可以確定感興趣的多肽或多核苷酸的表達(dá)水平或活性。因此本發(fā)明涉及植物細(xì)胞和組織，涉及分別地從這類細(xì)胞和組織得到的植物，涉及植物材料，涉及子代并且涉及從這類植物中得到種子、并且涉及多種農(nóng)產(chǎn)品，這些農(nóng)產(chǎn)品 包括通過例如以下描述的多種轉(zhuǎn)化方法中的任何一項(xiàng)能夠得到的具有改善的特性的處理 過的植物產(chǎn)品。一旦已經(jīng)將與一種感興趣的多核苷酸連接的包括根據(jù)本發(fā)明的一種調(diào)節(jié)序列的 根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的一種表達(dá)盒轉(zhuǎn)化入特定的植物物種中時，可以使用傳統(tǒng)的 培育技術(shù)將它在該物種中進(jìn)行繁殖或?qū)⑺迫胂嗤锓N的其他品種中，特別地包括商用品 種。本發(fā)明的優(yōu)選的植物包括裸子植物、單子葉植物、和雙子葉植物，特別地農(nóng)藝學(xué)上重要 的作物植物，例如稻、小麥、大麥、黑麥、油菜、玉米、馬鈴薯、胡蘿卜、甘薯、甜菜、豆、豌豆、菊 苣、萵苣、甘藍(lán)、花椰菜、青花椰菜、蕪菁、蘿卜、菠菜、蘆筍、蔥頭、蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿
卜、南瓜(squash)、南瓜(pumpkin)、西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨、榲梓(quince)、甜瓜、李子、櫻 桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、懸鉤子、黑刺莓、菠蘿、鱷梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、煙草、番 茄、高粱以及甘蔗。設(shè)計進(jìn)入上述轉(zhuǎn)基因植物中的遺傳特性通過有性繁殖或營養(yǎng)生長被傳遞，并且可 以因此被維持并在子代植物中繁殖。一般而言，所述維持和繁殖使用了已知的為滿足特定 的目的(如耕種、播種或收割)而開發(fā)的農(nóng)業(yè)方法。也可以使用專門的方法例如水培或溫 室技術(shù)。根據(jù)本發(fā)明在植物育種中可以進(jìn)一步使用這些轉(zhuǎn)基因植物的有利的遺傳性質(zhì)，該 育種是針對開發(fā)具有改善的特性(例如對害蟲、殺蟲劑或脅迫耐受)、改善的營養(yǎng)值、增加 的產(chǎn)量或改善的結(jié)構(gòu)(導(dǎo)致從倒伏或落粒的損失更少)的植物。通過已明確定義的人類介 入(例如選擇有待雜交的品系、直接授粉親本品系或選擇適當(dāng)?shù)淖哟参?對多種育種步 驟進(jìn)行表征。取決于所希望的特性，可以采取不同的育種措施。這些相關(guān)技術(shù)在本領(lǐng)域中 是熟知的并且包括但不限于雜交、近交、回交育種、多品系育種、品種混合、種間雜交、非整 倍體技術(shù)、等。雜交技術(shù)還包括通過機(jī)械的、化學(xué)的或生物化學(xué)的方法將植物絕育以生成雄 性或雌性不育植物。用不同品系的花粉將雄性不育植物雜交授粉確保該雄性不育植物而不 是雌性不育植物的基因組將均一地得到這兩個親本品系兩者的特性。因此，根據(jù)本發(fā)明的 轉(zhuǎn)基因植物可以用于改進(jìn)的植物株系的育種，這些株系(例如)提高了常規(guī)方法如除草劑 或殺蟲劑處理的效率、或這因?yàn)樗鼈兊慕?jīng)過修飾的遺傳特性而允許人們免除所述方法。可 替代地，由于它們優(yōu)化的遺傳“設(shè)備”可以得到具有改進(jìn)的脅迫耐受性的新作物，從而生產(chǎn) 比不能耐受可比較的不利發(fā)育條件的產(chǎn)物更好品質(zhì)的收獲的產(chǎn)物。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，已經(jīng)用一種編碼多肽或蛋白的核苷酸序列轉(zhuǎn)化該植 物并且該植物表達(dá)該編碼多肽或蛋白的核苷酸序列，該核苷酸序列在該植物的大多數(shù)組織 中但基本上排除花粉和/或雄花穗的組織中編碼展示一種殺蟲活性的多肽產(chǎn)物、特別地一 種蘇云金芽孢桿菌的內(nèi)毒素從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中，其中 該核苷酸序列沒有以任何顯著的程度被轉(zhuǎn)錄。因此，基本上沒有表達(dá)發(fā)生在花粉和/或雄 花穗組織中并且僅有殘留量的表達(dá)產(chǎn)物(即便有)可以在所述組織中被檢測到，該量不足 以用于表達(dá)產(chǎn)物以在所述組織中實(shí)現(xiàn)它的想見的生物學(xué)功能或者展示或者對以這些組織 為食的昆蟲或者對植物自身的任何毒性作用。特別地，從這些花粉和/或雄花穗的組織中的感興趣的編碼蛋白的多核苷酸中表 達(dá)的該多肽產(chǎn)物的濃度是這樣的即在標(biāo)準(zhǔn)的昆蟲攝食測定法中不能檢測到殺蟲的活性。在 本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，在花粉中表達(dá)產(chǎn)物的濃度是低于約lOng/mg可溶蛋白的基本水平的，特別地約5ng/mg可溶蛋白、更特別地約3ng/mg可溶蛋白，但特別地約2ng/mg可溶蛋 白或以下。本發(fā)明還提供了用于制備包括根據(jù)本發(fā)明的調(diào)節(jié)序列的表達(dá)盒的方法，該方法包 括用根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的調(diào)節(jié)序列與對一種多肽或一種感興趣的蛋白進(jìn)行編碼 的可表達(dá)的多核苷酸進(jìn)行連接以得到一種表達(dá)構(gòu)建體，其中該感興趣的多核苷酸被可操作 地與該調(diào)節(jié)序列進(jìn)行連接或連接從而該多肽或一種感興趣的蛋白的表達(dá)被根據(jù)本發(fā)明的 調(diào)節(jié)序列所介導(dǎo)并且導(dǎo)致所述多肽或感興趣的一種蛋白在基本上所有植物組織中進(jìn)行表 達(dá)，但基本上排除在該植物的繁殖結(jié)構(gòu)的組織中、特別地在該花粉和/或雄花穗的組織中 進(jìn)行表達(dá)，從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，該轉(zhuǎn)基因植物在非 花粉組織中表達(dá)一種感興趣的DNA序列但在該花粉和/或雄花穗的組織中不或基本上不表 達(dá)該序列，該方法包括a)將根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的一種表達(dá)盒轉(zhuǎn)化入一種植物細(xì)胞中，該表達(dá)盒 包括一種調(diào)節(jié)核苷酸序列，該核苷酸序列的至少一部分具有一種轉(zhuǎn)錄起始功能，該轉(zhuǎn)錄起 始功能介導(dǎo)將一種感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸表達(dá)于大多數(shù)植物組織 中但基本上排除了花粉和/或雄花穗的組織從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于 所述組織中；并且 b)將步驟a)中轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生成為植物。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種防治目標(biāo)昆蟲-以營養(yǎng)植物組織例如葉、莖 和根為食和/或以繁殖組織例如穗為食的害蟲、但是保護(hù)以花粉為食的非目標(biāo)害蟲的方 法，該方法包括a)在區(qū)域內(nèi)生長一種根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的植物，用目標(biāo)害蟲侵染該區(qū) 域；b)在根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的一種調(diào)節(jié)序列的控制下表達(dá)一種多肽或蛋白， 該多肽或蛋白能夠防治所述目標(biāo)害蟲。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種通過在所述組織中表達(dá)感興趣的一種多肽或 蛋白，從而保護(hù)一種植物的繁殖組織、特別地該花粉和/或雄花穗的組織免受損害的方法， 該方法包括a)生長一種根據(jù)本發(fā)明或如在此所述的植物；b)在根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的一種調(diào)節(jié)序列的控制下表達(dá)一種感興趣的多 肽或蛋白。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及使用根據(jù)本發(fā)明并且如在此所披露的一種調(diào)節(jié)序 列來防治目標(biāo)昆蟲_以營養(yǎng)植物組織例如葉、莖和根為食和/或以繁殖組織例如穗為食的 害蟲、但是保護(hù)以花粉為食的非目標(biāo)害蟲的方法，該方法包括a)在區(qū)域內(nèi)生長一種根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的植物，用目標(biāo)害蟲侵染該區(qū) 域；b)在根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的一種調(diào)節(jié)序列的控制下表達(dá)一種多肽或蛋白， 該多肽或蛋白能夠防治所述目標(biāo)害蟲。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過在所述組織中表達(dá)一種感興趣的多肽或蛋白(包括在根據(jù)本發(fā)明并且如在此所述的一種調(diào)節(jié)序列的控制下表達(dá)所述多肽或感興趣的蛋白)從而使用根據(jù)本發(fā)明并且如在此所披露的一種調(diào)節(jié)序列來保護(hù)植物的繁殖組織、特別 地花粉和/或雄花穗組織免受損傷。
實(shí)施例以下實(shí)施例提供多個說明性實(shí)施方案。根據(jù)本披露以及本領(lǐng)域中一般水平的技 能，普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解以下實(shí)施例僅僅旨在是示例性的并且在不離開本要求的主題的 范圍下可以使用許多改變、變換和更改。用于構(gòu)建和繁殖本發(fā)明中所述的菌株所需要的所有操作和技術(shù)對于本領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員是已知的。技術(shù)細(xì)節(jié)被描述于例如Ausubel et al 1995、Sambrook，J，2001和 Miller, J. H. 1992之中，并且描述于本發(fā)明中所引用的相關(guān)出版物中。實(shí)施例1 非花粉表汰實(shí)施例1. 1 ZmABP3的鑒定在表達(dá)譜試驗(yàn)中，在玉蜀黍(Zm80K)Affymetrix芯片上查詢玉米發(fā)育系列，尋找 在所有樣品中給出強(qiáng)信號、但在花粉樣品中不或基本上不給出強(qiáng)信號的探針。將所有這些 綠色組織和根樣品直接地與花粉進(jìn)行比較，并且將表示不符合該目標(biāo)表達(dá)譜的多核苷酸的 探針消除。該分析生成兩組結(jié)果。第一組包含36個探針，這些探針表示在所有組織樣品中 被高度表達(dá)但在花粉中被非常低的表達(dá)的多核苷酸。第二組包含10個探針，這些探針表示 在所有組織樣品中被高度表達(dá)但在花粉中沒有給出信號的多核苷酸。與玉米cDNA集合數(shù) 據(jù)庫進(jìn)行探針序列的比對顯示所有46個探針表示了 bona fide玉米基因。前面10個探 針是那些探針，它們在所有非花粉組織中具有最強(qiáng)的信號并且在花粉中沒有信號(參見表 A)。使用另外的指標(biāo)包括確定基因組DNA(gDNA)和cDNA序列有效性，因?yàn)槊總€序列導(dǎo) 致生成的Zm07728_s_at成為滿足所有啟動子開發(fā)要求的最前面的候選者。文獻(xiàn)分析顯示 這種探針表示對肌動蛋白結(jié)合蛋白3(ZmABP3)進(jìn)行編碼的基因，該肌動蛋白結(jié)合蛋白3是 小基因家族中的成員，該小基因家族以前已經(jīng)被表征(Lopez et al.，1996)。該基因產(chǎn)物也 被稱為肌動蛋白解聚因子3。在圖3中Lopez等人(1996)證實(shí)了除了花粉樣品外，ZmABP3 被高度表達(dá)于被檢測植物的大多數(shù)組織中。Lopez等人(1996)還通過DNA印跡分析顯示在玉米基因組中存在兩個ABP3基因。 他們報告的ZmABP3cDNA是GenBank登錄號X97726，并且它對應(yīng)于TIGR登錄號TC248585。 這個基因被指定為ZmABP3-A。這兩個ZmABP3基因都在該玉米(Zm80K) Affymetrix芯 片上進(jìn)行表示ZmABP3-A對應(yīng)于探針Zm007595_at并且ZmABP3_B對應(yīng)于Zm07728_s_ at。使用'Zm07728_s_at ‘序列來在TIGR數(shù)據(jù)庫中鑒定TC248588，并且在玉米cDNA 集合數(shù)據(jù)庫中鑒定 MAIZE. 974. CB1。還鑒定了 MAGI_93606、MAGI_93607、AZM4_39177、 ZmGSStucl 1-12-04. 2725. 1、ZmGSStucl 1-12-04. 2725. 2 和 CC463190gDNA 序列。ZmABP3_A 和ZmABP3-B cDNA編碼除了一個以外，在所有殘基上完全相同的蛋白。表達(dá)譜數(shù)據(jù)表明 ZmABP3-B被高度表達(dá)于該植物的大多數(shù)組織中，但基本上排除表達(dá)于該花粉的組織中，從 而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中。ZmABP3-A沒有被同樣地高度表達(dá)。SEQ ID NO 16顯示ZmABP3_B mRNA被編碼在3個外顯子上。通過這些預(yù)期的GT. . . AG邊緣核苷酸將兩個間插序列(內(nèi)含子)括起來。更確切地說，SEQ ID NO :16披露了 ZmABP3表達(dá)盒的設(shè)計。有待包括入該構(gòu)建體 中的ZmABP3調(diào)節(jié)元件是2. 3kb的5 ‘-序列(prZmABP3_01)，該5 ‘-序列包括1. Ikb的 5'-非轉(zhuǎn)錄的序列、0. 25kb的5' -UTR和0. 98kb表示ZmABP3_B-內(nèi)含子1 ；以及1. 013kb 的3 ‘-序列(tZmZBP3-01)，該3 ‘-序列正好在越過該ABP3-B翻譯終止密碼子處開始。 這包括約0. 3kb的3 ‘ -UTR以及0. 7kb的非轉(zhuǎn)錄的序列。表A顯示前面10個候詵探針的匯總，這㈣探針表示在所有玉米組織中具有高表汰 水平并H.在花粉中沒有表汰信號的多核苷酸。
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)基因植物，包括穩(wěn)定地整合在其基因組中的嵌合多核苷酸構(gòu)建體，該構(gòu)建體包 括至少一種感興趣的編碼蛋白的多核苷酸，該多核苷酸可操作地與調(diào)節(jié)核苷酸序列連接 (associate)和/或處于其可操作的控制之下，該核苷酸序列的至少一部分具有將所述感 興趣的多核苷酸的表達(dá)導(dǎo)向大多數(shù)植物組織中、但基本上排除導(dǎo)向這些繁殖性植物結(jié)構(gòu)的 組織中的轉(zhuǎn)錄起始功能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述感興趣的多核苷酸的表達(dá)被導(dǎo)向至目 標(biāo)昆蟲正常地以之為食的組織中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述繁殖性植物結(jié)構(gòu)的組織是花粉和/或 雄花穗的組織。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中感興趣的編碼蛋白的多核苷酸不被或基本 上不被轉(zhuǎn)錄于花粉和/或雄花穗的組織中，從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所 述組織中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中該嵌合DNA構(gòu)建體包括感興趣的編碼蛋 白的多核苷酸，該多核苷酸可操作地與調(diào)節(jié)核苷酸序列連接和/或處于其可操作的控制之 下，該核苷酸序列的至少一部分具有可從玉米基因組中存在的基因中得到的轉(zhuǎn)錄起始功 能。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中該嵌合DNA構(gòu)建體包括感興趣的編碼蛋 白的多核苷酸，該多核苷酸可操作地與調(diào)節(jié)核苷酸序列連接和/或處于其可操作的控制之 下，該核苷酸序列的至少一部分具有可從基因得到的轉(zhuǎn)錄起始功能，該基因被表達(dá)于所有 組織樣品中但不或基本上不表達(dá)于花粉和/或雄花穗的組織中，該基因通過探針分子、特 別是顯示如SEQ IDNO 47至79中所述的DNA序列的DNA探針分子來表示。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中該嵌合DNA構(gòu)建體包括感興趣的編碼蛋 白的多核苷酸，該多核苷酸可操作地與調(diào)節(jié)核苷酸序列連接和/或處于其可操作的控制之 下，該核苷酸序列的至少一部分具有可從編碼肌動蛋白解聚因子3 (ABP3)的基因得到的轉(zhuǎn) 錄起始功能，該肌動蛋白解聚因子3被表達(dá)于該植物的大多數(shù)組織中，但不被或基本上不 被表達(dá)于花粉組織中從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述肌動蛋白解聚因子3(ABP;3)基因是來 自玉米的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中提供該轉(zhuǎn)錄起始功能的核苷酸序列與SEQ ID NO 13中所述的核苷酸序列具有至少80%序列同一性，并且其中所述調(diào)節(jié)序列介導(dǎo)了 感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄，從而所述連接的多核苷酸被轉(zhuǎn)錄于 該植物的大多數(shù)組織中但不被或基本上不被轉(zhuǎn)錄于花粉的組織中從而沒有或基本上沒有 表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中提供該轉(zhuǎn)錄起始功能的核苷酸序列的互 補(bǔ)鏈能夠與SEQ ID NO: 13中所述的核苷酸序列雜交并且其中所述調(diào)節(jié)序列控制感興趣的 可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄從而所述連接的多核苷酸被轉(zhuǎn)錄于該植物的 大多數(shù)組織中但不被或基本上不被轉(zhuǎn)錄于花粉的組織中。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中提供該轉(zhuǎn)錄起始功能的核苷酸序列是SEQ ID NO 13中所述的序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述感興趣的多核苷酸進(jìn)一步提供了 轉(zhuǎn)錄終止功能，其中提供所述功能的序列與SEQ ID NO :14中所述的核苷酸序列具有至少 80%序列同一性。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述調(diào)節(jié)核苷酸序列進(jìn)一步提供轉(zhuǎn)錄終 止功能并且其中提供所述功能的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈能夠與SEQ ID N0:14中所述的核苷 酸序列雜交。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中提供該轉(zhuǎn)錄終止功能的核苷酸序列是 SEQ ID NO 14中所述的序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中提供該轉(zhuǎn)錄起始功能的核苷酸序列與SEQ ID NO 35中所述的核苷酸序列具有至少80%序列同一性，并且其中所述調(diào)節(jié)序列介導(dǎo)了 感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄，從而所述連接的多核苷酸被轉(zhuǎn)錄于 該植物的大多數(shù)組織中但不被或基本上不被轉(zhuǎn)錄于雄花穗的組織中從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以 任何顯著的程度存在于所述組織中。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中提供該轉(zhuǎn)錄起始功能的核苷酸序列的互 補(bǔ)鏈能夠與SEQ ID NO :35中所述的核苷酸序列雜交，并且其中所述調(diào)節(jié)序列介導(dǎo)了感興趣 的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄，從而所述連接的多核苷酸被轉(zhuǎn)錄于該植物 的大多數(shù)組織中但是基本上排除轉(zhuǎn)錄于雄花穗的組織中從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的 程度存在于所述組織中。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中提供該轉(zhuǎn)錄起始功能的核苷酸序列是 SEQ ID NO 35中所述的序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述感興趣的多核苷酸進(jìn)一步提供了 轉(zhuǎn)錄終止功能，其中提供所述功能的序列與SEQ ID NO :36中所述的核苷酸序列具有至少 80%序列同一性。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述調(diào)節(jié)核苷酸序列進(jìn)一步提供轉(zhuǎn)錄終 止功能并且其中提供所述功能的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈能夠與SEQ ID N0:36中所述的核苷 酸序列雜交。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中提供該轉(zhuǎn)錄終止功能的調(diào)節(jié)核苷酸序列 是SEQ ID NO 36中所述的序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述感興趣的編碼蛋白的多核苷酸是編 碼多肽或蛋白的核苷酸序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中感興趣的多核苷酸編碼顯示殺蟲活性的 多肽產(chǎn)物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中該感興趣的基因編碼蘇云金芽孢桿菌的內(nèi)毒素。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中由該感興趣的編碼蛋白的多核苷酸在植 物繁殖結(jié)構(gòu)、特別是在花粉和/或雄花穗的組織中表達(dá)的多肽產(chǎn)物的濃度使得在標(biāo)準(zhǔn)昆蟲 攝食測定中不能檢測到殺蟲活性并且也不能對該植物繁殖結(jié)構(gòu)、特別是對花粉和/或雄花 穗的組織無毒性作用。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中該植物繁殖結(jié)構(gòu)的組織中、特別是花粉和/或雄花穗的組織中的多肽濃度低于lOng/mg可溶性蛋白的基本水平。
26.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中該感興趣的基因編碼多肽產(chǎn)物，該多肽產(chǎn) 物有助于提高耐旱性。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中該感興趣的基因編碼H+-焦磷酸酶的去 調(diào)節(jié)形式。
28.根據(jù)以上權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中植物是玉蜀黍植物。
29.調(diào)節(jié)核苷酸序列，該核苷酸序列的至少一部分具有轉(zhuǎn)錄起始功能，該轉(zhuǎn)錄起始功能 介導(dǎo)了感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的核苷酸在大多數(shù)植物組織中、但基本上排除在 該雄性繁殖性植物結(jié)構(gòu)的組織中的表達(dá)。
30.根據(jù)權(quán)利要求四所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，其中該雄性繁殖性植物結(jié)構(gòu)的組織是花 粉和/或雄花穗的組織。
31.根據(jù)權(quán)利要求四所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，其中在花粉和/或雄花穗的組織中的表 達(dá)使得沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中。
32.根據(jù)權(quán)利要求四所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，該核苷酸序列能夠從該玉米基因組中存 在的基因中得到。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，該核苷酸序列能夠從基因中得到，該基 因被表達(dá)于所有組織樣品中但不或基本上不被表達(dá)于花粉和/或雄花穗的組織中，該基因 通過探針分子，特別是顯示如SEQ ID NOs 47至79中所述的DNA序列的DNA探針分子來表
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，該核苷酸序列能夠從編碼肌動蛋白解聚 因子3的基因中得到，該肌動蛋白解聚因子3被表達(dá)于該植物的大多數(shù)組織中，但基本上排 除該花粉組織，從而沒有或基本上沒有表達(dá)發(fā)生于該花粉組織中并且沒有或基本上沒有表 達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，該核苷酸序列可以由基因組玉蜀黍DNA 模板使用正向引物SEQ ID NO :1和反向引物SEQ ID NO :2在PCR反應(yīng)中得到。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，使用選自如下所示的寡核苷酸組的一個 或多個寡核苷酸對該核苷酸序列進(jìn)行修飾在SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7和 SEQ IDNO :8。
37.根據(jù)權(quán)利要求34所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，其中提供該轉(zhuǎn)錄起始功能的核苷酸序列 與SEQ ID NO :13中所述的核苷酸序列具有至少80%序列同一性，并且其中所述調(diào)節(jié)序列 介導(dǎo)了感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄，從而所述連接的多核苷酸被 轉(zhuǎn)錄于該植物的大多數(shù)組織中但不被或基本上不被轉(zhuǎn)錄于該花粉的組織中從而沒有或基 本上沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中。
38.根據(jù)權(quán)利要求34所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，其中提供該轉(zhuǎn)錄起始功能的核苷酸序列 的互補(bǔ)鏈與SEQ ID NO :13中所述的核苷酸序列雜交，并且其中所述調(diào)節(jié)序列介導(dǎo)了感興趣 的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄，從而所述連接的多核苷酸被轉(zhuǎn)錄于該植物 的大多數(shù)組織中但不被或基本上不被轉(zhuǎn)錄于該花粉的組織中從而沒有或基本上沒有表達(dá) 產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，其中雜交發(fā)生在嚴(yán)格雜交條件下。
40.根據(jù)權(quán)利要求37所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，其中提供該轉(zhuǎn)錄起始功能的核苷酸序列 是在SEQ ID NO 13中描述的核苷酸序列。
41.根據(jù)權(quán)利要求34所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，其中所述調(diào)節(jié)核苷酸序列進(jìn)一步提供了 轉(zhuǎn)錄終止功能，并且其中提供所述功能的序列與SEQ IDNO 14中所述的核苷酸序列具有至 少80%序列同一性。
42.根據(jù)權(quán)利要求34所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，其中所述調(diào)節(jié)核苷酸序列進(jìn)一步提供了 轉(zhuǎn)錄終止功能，并且其中提供所述功能的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈能夠與SEQ ID N0:14中所述 的核苷酸序列雜交。
43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，其中提供該轉(zhuǎn)錄終止功能的核苷酸序列 是在SEQ ID NO 14中描述的序列。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，該核苷酸序列包括轉(zhuǎn)錄終止子和多聚腺苷酸化信號。
45.根據(jù)權(quán)利要求四所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，該核苷酸序列的至少一部分具有轉(zhuǎn)錄起 始功能，該轉(zhuǎn)錄起始功能介導(dǎo)了感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸在大多數(shù)植 物組織中但基本上排除在雄花穗的組織中表達(dá)從而沒有或基本上沒有表達(dá)發(fā)生在該雄花 穗的組織中并且沒有或基本上沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中。
46.根據(jù)權(quán)利要求32所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，該核苷酸序列可以由基因組玉蜀黍DNA 模板使用正向引物SEQ ID NO :19和反向引物SEQ IDNO :20在PCR反應(yīng)中得到。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，使用選自如下所示的寡核苷酸組的一個 或多個寡核苷酸對該核苷酸序列進(jìn)行修飾在SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO 23、SEQ ID NO 24, SEQ ID NO :25 禾口 SEQID NO :26。
48.根據(jù)權(quán)利要求45所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，其中提供該轉(zhuǎn)錄起始功能的核苷酸序列 與SEQ ID NO :35中所示的核苷酸序列具有至少80%序列同一性，并且其中所述調(diào)節(jié)序列 介導(dǎo)了感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄，從而所述連接的多核苷酸被 轉(zhuǎn)錄于該植物的大多數(shù)組織中但不被或基本上不被轉(zhuǎn)錄于該雄花穗的組織中從而沒有表 達(dá)產(chǎn)物以任何顯著的程度存在于所述組織中。
49.根據(jù)權(quán)利要求45所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，其中提供該轉(zhuǎn)錄起始功能的核苷酸序列 的互補(bǔ)鏈與SEQ ID NO :35中所述的核苷酸序列雜交，并且其中所述調(diào)節(jié)序列介導(dǎo)了感興趣 的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄，從而所述連接的多核苷酸被轉(zhuǎn)錄于該植物 的大多數(shù)組織中但不被或基本上不被轉(zhuǎn)錄于該雄花穗的組織中從而沒有表達(dá)產(chǎn)物以任何 顯著的程度存在于所述組織中。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，其中雜交發(fā)生在嚴(yán)格雜交條件下。
51.根據(jù)權(quán)利要求48所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，其中提供該轉(zhuǎn)錄起始功能的核苷酸序列 是在SEQ ID NO 35中描述的序列。
52.根據(jù)權(quán)利要求45所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，其中所述調(diào)節(jié)核苷酸序列進(jìn)一步提供了 轉(zhuǎn)錄終止功能，并且其中提供所述功能的序列與SEQ IDNO 36中所述的核苷酸序列具有至 少80%序列同一性。
53.根據(jù)權(quán)利要求45所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，其中所述調(diào)節(jié)核苷酸序列進(jìn)一步提供了 轉(zhuǎn)錄終止功能，并且其中提供所述功能的核苷酸序列的互補(bǔ)鏈能夠與SEQ ID N0:36中所述的核苷酸序列雜交。
54.根據(jù)權(quán)利要求52所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，其中提供該轉(zhuǎn)錄終止功能的核苷酸序列 是在SEQ ID NO 36中描述的序列。
55.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述感興趣的多核苷酸與根據(jù)權(quán)利要求 四至40以及45至51中任何一項(xiàng)所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列可操作地連接，該調(diào)節(jié)核苷酸序列 包括提供轉(zhuǎn)錄起始功能的核苷酸序列。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述感興趣的多核苷酸與根據(jù)權(quán)利要求 41至44以及52至M中所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列可操作地連接，該調(diào)節(jié)核苷酸序列進(jìn)一步包 括提供轉(zhuǎn)錄終止功能的核苷酸序列。
57.表達(dá)盒，包括根據(jù)權(quán)利要求四至40以及45至51中任何一項(xiàng)所述的調(diào)節(jié)核苷酸序 列，該調(diào)節(jié)核苷酸序列包括提供轉(zhuǎn)錄起始功能的核苷酸序列。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的表達(dá)盒，包括根據(jù)權(quán)利要求41至44以及52至M中任何 一項(xiàng)所述的調(diào)節(jié)核苷酸序列，該調(diào)節(jié)核苷酸序列進(jìn)一步包括提供轉(zhuǎn)錄終止功能的核苷酸序 列。
59.載體分子，包括根據(jù)權(quán)利要求57所述的表達(dá)盒。
60.轉(zhuǎn)基因植物，包括如權(quán)利要求57所述的表達(dá)盒。
61.轉(zhuǎn)基因植物，包括如權(quán)利要求59所述的載體分子。
62.生成轉(zhuǎn)基因植物的方法，該植物在非花粉組織中但不在或基本上不在花粉中表達(dá) 感興趣的DNA序列，該方法包括a)將根據(jù)權(quán)利要求57的表達(dá)盒或?qū)⒏鶕?jù)權(quán)利要求59的載體分子轉(zhuǎn)化入植物細(xì)胞或植 物組織中；并且b)將步驟a)中轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生成為植物。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中表達(dá)盒被轉(zhuǎn)化入整個植物中。
64.防治目標(biāo)昆蟲-以營養(yǎng)植物組織例如葉、莖和根為食和/或以繁殖性組織例如穗為 食的害蟲，但是保護(hù)以花粉為食的非目標(biāo)害蟲的方法，該方法包括a)在用目標(biāo)害蟲侵染區(qū)域內(nèi)培養(yǎng)根據(jù)以上權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的植物；b)表達(dá)多肽或蛋白，該多肽或蛋白能夠在根據(jù)以上權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的調(diào)節(jié)序 列的控制下防治所述目標(biāo)害蟲。
65.由于在所述組織中表達(dá)感興趣的多肽或蛋白而使得保護(hù)植物的繁殖組織、特別地 該花粉和/或雄花穗的組織免受損害的方法，該方法包括a)培養(yǎng)根據(jù)以上權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的植物；并且b)在根據(jù)以上權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的調(diào)節(jié)序列的控制下，在所述植物中表達(dá)感興 趣的多肽或蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及多種調(diào)節(jié)序列。特別地，本發(fā)明涉及一種調(diào)節(jié)核苷酸序列，該核苷酸序列的至少一部分具有一種將一種感興趣的可操作地連接的編碼蛋白的多核苷酸的表達(dá)導(dǎo)向非花粉組織中、但不導(dǎo)向或基本上不導(dǎo)向花粉中的轉(zhuǎn)錄起始功能。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括所述調(diào)節(jié)序列的嵌合基因和表達(dá)盒并且涉及包括所述嵌合基因和表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號A01H9/00GK102143682SQ200980134326
公開日2011年8月3日 申請日期2009年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月14日
發(fā)明者李美璟, 約瑟夫.克拉克, 邁克爾.努奇奧 申請人:先正達(dá)參股股份有限公司