專利名稱：氧化脅迫抗性的雙歧桿菌的制作方法
氧化脅迫抗性的雙歧桿菌本發(fā)明一般地涉及雙歧桿菌領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及雙歧桿菌領(lǐng)域，所述雙歧桿菌具有對H2O2改進的抗性。益生菌因為它們促進健康的性質(zhì)而被選擇。由于益生菌作為活的生物發(fā)揮它們的益處(Guarner, F.和 G. J. Schaafsma. 1998. " Probiotics " . Int. J. Food Microbiol. 39 237-238)，所述細菌應(yīng)該在胃腸道條件下存活。在工業(yè)應(yīng)用中，大規(guī)模的生產(chǎn)需要益生菌耐受食品加工和貯存的額外的能力。這些生產(chǎn)步驟以不同的脅迫為特征，所述脅迫危害所述細菌的良好存活。在它們中間，高或者低溫、高的滲透壓、氧化和濕度可能是關(guān)鍵的因素。特別地，已知益生菌的一些種類具有對不利的溫度、氧或者噴霧干燥的耐受性。具有差的脅迫耐受性的此類益生菌的突出的實例是例如雙歧桿菌，特別是長雙歧桿菌(Simpson, P. J. , C. Stanton, G. F. Fitzgerald,和 R. P. Ross. 2005. " Intrinsic tolerance of Bifidobacterium species to heat and oxygen and survival following spraydrying and storage" . J. AppI. Microbiol. 99 :493-501)。特別地，雙歧桿菌的厭氧性質(zhì)需要定制的發(fā)酵條件來促進大規(guī)模生產(chǎn)，并且通常需要額外的努力來保持在加工和貯存中細胞的活性。在細菌界中存在對氧的耐受性的非常大的區(qū)別。厭氧細菌已經(jīng)進化了精巧的防御系統(tǒng)來保護它們自身免于活性氧類別(ROS)引起的損害。然而，即使對于這些細菌，當這些防御系統(tǒng)受到損傷時，氧可以是有毒性的。主要可以形成三種不同的活性氧類別(ROS)，其取決于氧接受一個、兩個或者三個電子從而分別形成⑴超氧化物自由基(02_)，(ii)過氧化氫(H2O2)或者(iii)輕基自由基(.OH.) (Imlay, J. A. , 2002, Advances in MicrobialPhysiology, Vol 4646:111-153·)。H2O2引起DNA損傷和蛋白質(zhì)的氧化。細菌可以使用一些酶來消除這種R0S，所述酶包括過氧化氫酶、NADH過氧化物酶和還原酶。為處理該問題和增加食品生產(chǎn)中益生菌的存活率，目前使用了一些方法，其包括微囊化、保護劑的添加、不透氧的包裝以及生長或者加工條件的改進。然而，這些方法是復(fù)雜的并且施行起來是費勁的，同時通常需要添加其他的化合物，所述化合物可能具有副作用并且其在最終產(chǎn)品中可能是不想要的。因此，本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的這些問題和為本領(lǐng)域提供益生性雙歧桿菌，并且提供增加組合物中存活的益生菌的數(shù)目的方法，所述益生性雙歧桿菌顯示出對氧化脅迫改進的抗性和/或改進的氧耐受性。通過根據(jù)權(quán)利要求I的雙歧桿菌,根據(jù)權(quán)利要求2的組合物和根據(jù)權(quán)利要求8的用途解決了本發(fā)明的目的。本發(fā)明人應(yīng)用自然篩選方法并且已經(jīng)尋找到了雙歧桿菌菌株，其具有對活性氧類別例如H2O2增加的抗性。一種典型的益生菌是長雙歧桿菌。本發(fā)明人能鑒定和分離長雙歧桿菌NCC2916，其允許實現(xiàn)本發(fā)明的目的。長雙歧桿菌NCC2916-通過自然篩選得到的長雙歧桿菌NCC2705的衍生物-與現(xiàn)有技術(shù)的雙歧桿菌相比令人驚奇地顯示改進的氧耐受性。通過自然篩選得到的菌株具有解決本發(fā)明的目的而沒有通過基因技術(shù)被修飾的優(yōu)點。特別 地，長雙歧桿菌菌株NCC2916顯示對H2O2改進的抗性。因此，本發(fā)明的一個實施方案是長雙歧桿菌NCC2916。按照布達佩斯條約將長雙歧桿菌NCC2916保藏在CNCM中；巴斯德研究所，25 ；Ruedu Docteur Roux ;F_75724 Paris Cedex 15，保藏號 CNCM 1-4053。本發(fā)明也涉及包含長雙歧桿菌NCC2916的組合物。為了本發(fā)明的目的，如果組合物包含存活的或者非復(fù)制的長雙歧桿菌NCC2916細胞、長雙歧桿菌NCC2916的任何細菌碎片、包含長雙歧桿菌NCC2916培養(yǎng)物的任何級分、和/或用于培養(yǎng)長雙歧桿菌NCC2916的培養(yǎng)基或者它的一部分,則該組合物被認為包含長雙歧桿菌 NCC2916。益生性雙歧桿菌，當施用時賦予宿主健康益處。雙歧桿菌的健康益處是多方面的并且包括幫助消化、伴隨著變態(tài)反應(yīng)較低的發(fā)生率、腫瘤生長的一些形式的預(yù)防和體重管理。因此，本發(fā)明的組合物和/或長雙歧桿菌NCC2916可賦予受試者這些健康益處。本發(fā)明的組合物可以是任何組合物，但優(yōu)選地是食品、動物食品或者藥物組合物。例如，組合物可以是營養(yǎng)組合物、營養(yǎng)藥品、飲料、食品添加劑或者藥物。優(yōu)選的，預(yù)期將組合物用于人、寵物或者家畜，而寵物或者家畜可以選自狗、貓、豚鼠、兔子、豬、牛、綿羊、山羊、馬和/或家禽。組合物可以包含至少一種糖類來源、至少一種脂類來源和/或至少一種蛋白質(zhì)來源。任何適合的膳食蛋白質(zhì)可以用作蛋白質(zhì)來源，例如動物蛋白(如乳蛋白、肉蛋白和卵蛋白)、植物蛋白(如大豆蛋白、小麥蛋白、稻蛋白和豌豆蛋白)、游離氨基酸的混合物、或者所述物質(zhì)的組合。特別優(yōu)選地是乳蛋白如酪蛋白和乳清以及大豆蛋白。蛋白質(zhì)可以是完整的或者水解的或者是完整的和水解的蛋白質(zhì)的混合物。期望供應(yīng)部分水解的蛋白質(zhì)(水解程度在2至20%之間)，例如用于被認為處于發(fā)生牛奶變態(tài)反應(yīng)的風險中的動物。如果需要水解的蛋白質(zhì)，水解方法可以按照所希望的進行并且其在本領(lǐng)域是已知的。例如，可以通過一個或者多個步驟中酶促水解乳清級分制備乳清蛋白水解產(chǎn)物。如果用作原料的乳清級分是基本上無乳糖的，發(fā)現(xiàn)在水解過程中此蛋白質(zhì)遭受更少的賴氨酸障礙。這使賴氨酸障礙的程度從按總賴氨酸重量計約15%減少到少于按賴氨酸重量計的約10%，例如按賴氨酸重量計的約7%，其大大改進了蛋白質(zhì)來源的營養(yǎng)質(zhì)量。如果組合物包括脂肪來源，優(yōu)選地脂肪來源提供5%至40%的組合物的能量，例如提供20%至30%的能量。使用油菜籽油、玉米油和高油酸向日葵油的混合物可以得到適合的脂肪譜。糖類來源優(yōu)選地提供40%至80%的組合物能量?？梢允褂萌魏芜m合的糖類，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖漿固體、麥芽糖糊精和所述物質(zhì)的混合物。如果期望也可以加入膳食纖維。膳食纖維通過小腸時不被酶消化并且行使天然填充劑和緩瀉藥的功能。膳食纖維可以是可溶的或者不可溶的并且優(yōu)選地一般是兩種類型的混合物。膳食纖維的適合來源包括大豆、豌豆、燕麥、果膠、瓜爾膠、阿拉伯樹膠、低聚果糖、低聚半乳糖、唾液酰乳糖和源于動物乳的寡糖。優(yōu)選的纖維混合物是菊粉和更短鏈的低聚果糖的混合物。優(yōu)選地，如果纖維存在，纖維含量在2至40g/l消費的組合物之間，更優(yōu)選地在4至10g/l消費的組合物之間。組合物也可以包含礦物質(zhì)和微量營養(yǎng)物，如根據(jù)政府機構(gòu)如USRDA推薦的微量兀素和維生素。例如，組合物可以包含每日劑量以下微量營養(yǎng)物的ー種或者多種|丐、鎂、磷、鉄、鋅、銅、碘、硒、維生素C、維生素BI、維生素B6、維生素B2、煙酸、維生素B12、葉酸、生物素、維生素D、維生素E。如果期望，可以將ー種或者多種食品級乳化劑摻入到組合物中；例如ニこ酰酒石酸脂類或甘油一酯和ニ酷、卵磷脂和甘油一酯和ニ酷。也可以包括相似的合適的鹽類和穩(wěn)定劑。可預(yù)期組合物用于ロ服、腸胃外或者局部施用。ロ服應(yīng)用包括用于本發(fā)明目的的 腸道施用。組合物可以包含至少ー種其他類型的其他食品級細菌。“食品級細菌”指的是使用的細菌并且一般認為該細菌用于食品中是安全的。食品級細菌可以選自乳酸細菌和/或雙歧桿菌。優(yōu)選的是益生菌?！耙嫔敝傅氖俏⑸锛毎苿┗蛘呶⑸锛毎M分，其對宿主的健康和幸福具有有益的效果(Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al “Probiotics how should they be defined” Trends Food Sci. Technol. 1999 :10107-10)。組合物可以進一歩的包含至少ー種益生元。“益生元”指的是食物物質(zhì)，預(yù)期其能促進腸中益生菌的生長。例如Glenn R. Gibson和Marcel B. Roberfroid, DietaryModulation of the Human Colonic Microbiota :Introducing the Concept ofPrebiotics7J. Nutr. 1995125 :1401-1412中定義了益生元。益生元可選自寡糖并且任選地包含果糖、半乳糖、甘露糖、大豆和/或菊粉；和/或膳食纖維。本發(fā)明的組合物可以進ー步地包含保護性的水膠體(如樹膠、蛋白質(zhì)、改性淀粉)、粘合劑、成膜劑、包膠劑/物質(zhì)、壁/殼材料、基質(zhì)化合物、包衣、乳化劑、表面活性劑、增溶劑(油、脂肪、蠟、卵磷脂等)、吸附劑、載體、填充劑、輔助化合物、分散劑、潤濕劑、加工助劑(溶剤)、流動劑、掩味劑、增重劑、成凝膠劑、凝膠形成劑、抗氧化劑和抗微生物劑。組合物也可以包含常規(guī)的藥物添加劑和佐劑、賦形劑和稀釋劑，其包括但不限于水、任何來源的明膠、植物膠、木質(zhì)素磺酸鹽、滑石、糖、淀粉、阿拉伯膠、植物油、聚亞烷基ニ醇、增香劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、緩沖劑、潤滑劑、著色劑、潤濕劑、填充劑等等。在所有的情況下，將考慮它們對預(yù)期的接受者的適合性來選擇這種其他的成分。本發(fā)明的組合物可以包含根據(jù)本發(fā)明的任何數(shù)目的雙歧桿菌。原則上，到達腸并且能形成菌落的単一的雙歧桿菌足夠產(chǎn)生對宿主的有益效果。本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚理想的劑量將取決于待治療的受試者、例如它的健康狀況、性別、年齡或者體重。因此理想的使用劑量將是不同的，但是可以被本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易的確定。然而，一般，優(yōu)選本發(fā)明的組合物包含每日劑量IO3至IO1tlCfu之間和/或IO3至101°之間細胞的長雙歧桿菌NCC2916。它也可以在每克干重組合物中包含IO3至IO12Cfu之間和/或IO3至IO12之間細胞的長雙歧桿菌NCC2916。本發(fā)明也涉及長雙歧桿菌NCC2916在增加產(chǎn)品中活的益生菌，例如長雙歧桿菌的數(shù)目中的用途。相似地，本發(fā)明涉及本發(fā)明的組合物在增加產(chǎn)品中活的益生菌，例如長雙歧桿菌的數(shù)目中的用途。本發(fā)明的用途也用于在暴露與益生菌的脅迫后增加產(chǎn)品中益生菌，特別是雙歧桿菌的數(shù)目。脅迫可以是暴露至氧化類別，例如在200ppm的濃度下，例如持續(xù)30秒至2小時。氧化類別沒有特別的限制。非常常見的活性氧類別包括例如·02_，超氧陰離子、H2O2,過氧化氫、· 0Η,輕基自由基、R00H,有機氫過氧化物、RO ·,燒氧基自由基、ROO ·,過氧自由基、HOCl，次氯酸、00Ν0-,過氧亞硝酸鹽和/或NO ·。優(yōu)選地，活性氧類別選自H2O2, · O2—、· OH和它們的組合。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解他們可以自由組合本文描述的本發(fā)明的所有特征而不用背離公開的本發(fā)明的范圍。特別地，為本發(fā)明用途描述的特征可以應(yīng)用到本發(fā)明的組合物中并且反之亦然。 本發(fā)明其他的優(yōu)點和特征在以下的實施例和附圖
中是顯而易見的。圖I顯示16小時過夜培養(yǎng)物在200ppm H2O2中4小時后的存活細胞計數(shù)。NCC2916(白色條形)和野生型NCC2705(黑色條形)。P-值指的是用野生型進行的t_檢驗。實施例I :NCC2916的鑒定和分離將約IO11Cfu的NCC2705在IOml 40ppm H2O2中重懸浮80分鐘。隨后將Iml體積的細胞懸浮液接種到MRS瓊脂上。將48小時內(nèi)可見的菌落在MRS肉湯中過夜(16小時)傳代培養(yǎng)2次并且將其冷凍于_80°C以用于進ー步的分析。為比較野生型細胞和新的變體NCC2916對H2O2的抗性，以相同的細胞密度解凍來自野生型和變體培養(yǎng)物的冷凍的細胞樣品(16小時過夜培養(yǎng)物)并且離心000g，2分鐘，在室溫下)Iml的整分試樣。將沉淀在IOml 200ppm H2O2溶液中重懸浮。4小時后用緩沖液稀釋并接種細胞懸浮液。48小時后測定菌落計數(shù)。該測試以一式三份進行(圖I)。NCC2916的H2O2的耐受性在至少70代內(nèi)是穩(wěn)定的。
權(quán)利要求
1.長雙歧桿菌NCC2916。
2.組合物,其包含根據(jù)權(quán)利要求I的雙歧桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其特征在于所述組合物是食品、動物食品或者藥物組合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2至3的一項的組合物，其特征在于所述組合物還包含至少一種益生J Li ο
5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，其特征在于所述益生元選自寡糖并且任選地包含果糖、半乳糖、甘露糖、大豆和/或菊粉；和/或膳食纖維。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5的一項的組合物，其特征在于所述組合物包含每日劑量在IO3至IOiciCfu之間和/或IO3至101°之間細胞的雙歧桿菌NCC2916。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至5的一項的組合物，其特征在于所述組合物包含每克干重的食物組合物中IO3至IO12Cfu之間和/或IO3至IO12之間細胞的雙歧桿菌NCC2916。
8.根據(jù)權(quán)利要求I的雙歧桿菌或者根據(jù)權(quán)利要求I至7的組合物的用途，用于增加產(chǎn)品中活的益生菌的數(shù)目。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的用途，用于在產(chǎn)品中益生菌暴露于脅迫后增加益生菌的數(shù)目。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用途，其中所述脅迫是暴露于200ppm濃度下的氧化類別30秒至2小時。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的用途，其中所述氧化類別選自H202、·02_、· OH和它們的組合。
全文摘要
本發(fā)明一般地涉及雙歧桿菌領(lǐng)域。特別地，本發(fā)明涉及具有對氧化脅迫改進的抗性的雙歧桿菌領(lǐng)域。本發(fā)明人已經(jīng)鑒定出一種雙歧桿菌，其顯示例如改進的H202抗性。
文檔編號C12R1/01GK102741392SQ201080030061
公開日2012年10月17日 申請日期2010年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月3日
發(fā)明者B·博格, C·拉克魯瓦, E·雷佐尼科, F·C·阿里戈尼, F·格拉特龐什, V·莫澤蒂 申請人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司