專利名稱：通過抑制針對膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(gdnf)的天然反義轉錄物來治療gdnf相關的疾病的制作方法
技術領域：
本申請要求保護提交于2009年2月12日的美國臨時申請第61/152，239號的權益，所述申請案通過引用以其整體結合于本文中。本發(fā)明的實施方案包括調節(jié)⑶NF和相關分子的表達和/或功能的寡核苷酸。
背景技術：
DNA-RNA和RNA-RNA雜交對于核酸功能的許多方面(包括DNA復制、轉錄和翻譯) 而言為重要的。雜交對于探測特定核酸或者改變其表達的各種技術而言亦為主要的。反義核苷酸例如通過與靶RNA雜交來擾亂基因表達，從而干擾RNA剪接、轉錄、翻譯和復制。 反義DNA具有附加的特征，該特征為DNA-RNA雜合體充當核糖核酸酶H消化的底物，該活性存在于大多數(shù)細胞類型中?？蓪⒎戳x分子遞送到細胞中，這與寡脫氧核苷酸(ODN)的情況一樣，或者它們如RNA分子一樣可由內源基因表達。FDA最近批準了一種反義藥物， VITRAVENE (用于治療巨細胞病毒視網(wǎng)膜炎)，這反映了反義物具有治療應用。發(fā)明概述提供本概述以呈現(xiàn)本發(fā)明的概述，從而簡要地指出本發(fā)明的性質和實質。在理解以下的情況下提出本概述其不會用于解釋或限制權利要求的范圍或含義。在一個實施方案中，本發(fā)明提供通過使用靶定天然反義轉錄物的任何區(qū)域的反義寡核苷酸來抑制天然反義轉錄物的作用，引起相應有義基因的增量調節(jié)的方法。本文也考慮天然反義轉錄物的抑制可通過siRNA、核酶和小分子來達到，認為所述siRNA、核酶和小分子在本發(fā)明的范圍之內。一個實施方案提供在體內或體外調節(jié)患者細胞或組織中的GDNF多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括用長度為5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸所述細胞或組織，其中所述寡核苷酸與以下多核苷酸的反向互補序列具有至少50%的序列同一性，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO :2的核苷酸1-237或SEQ ID NO :3的核苷酸1-1246或SEQ ID NO 4的核苷酸1-684(圖3)或者SEQ ID NO 42的核苷酸1-400或SEQ ID NO 43的核苷酸1-619或SEQ ID NO 44的核苷酸1-813之內的5_30個連續(xù)核苷酸；從而在體內或體外調節(jié)患者細胞或組織中的GDNF多核苷酸的功能和/或表達。在另一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸靶定GDNF多核苷酸的天然反義序列，例如 SEQ ID NO 2-4和42-44所述的核苷酸，以及其任何變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、片段和互補序列。反義寡核苷酸的實例如SEQ ID NO 5-34所述(圖4)。另一個實施方案提供在體內或體外調節(jié)患者細胞或組織中GDNF多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括用長度為5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸所述細胞或組織，其中所述寡核苷酸與GDNF多核苷酸的反義物的反向互補序列具有至少50%的序列同一性；從而在體內或體外調節(jié)患者細胞或組織中⑶NF多核苷酸的功能和/或表達。另一個實施方案提供在體內或體外調節(jié)患者細胞或組織中GDNF多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括用長度為5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸所述細胞或組織，其中所述寡核苷酸與GDNF反義多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%的序列同一性；從而在體內或體外調節(jié)患者細胞或組織中⑶NF多核苷酸的功能和/或表達。在優(yōu)選的實施方案中，組合物包含一種或多種與有義和/或反義GDNF多核苷酸結合的反義寡核苷酸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述寡核苷酸包含一個或多個經(jīng)修飾或取代的核苷酸。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述寡核苷酸包含一個或多個經(jīng)修飾的鍵。在又一個實施方案中，所述修飾核苷酸包含經(jīng)修飾的堿基，其包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2’ -0-甲基、氟或碳、亞甲基或其他鎖定核酸(LNA)分子。優(yōu)選地，所述修飾核苷酸為鎖定核酸分子，包括a-L-LNA。在另一個優(yōu)選的實施方案中，將所述寡核苷酸經(jīng)皮下、肌內、靜脈內或腹膜內給予
^^ ο在另一個優(yōu)選的實施方案中，將所述寡核苷酸在藥物組合物中給予。治療方案包括至少一次向患者給予反義化合物；然而，可將此治療修改成在一段時間內包含多次給藥。 所述治療可與一種或多種其它類型的療法組合。在另一個優(yōu)選的實施方案中，將所述寡核苷酸封裝到脂質體中或附著于載體分子 (例如膽固醇、TAT肽)。其它方面描述于下文。附圖
簡述圖 1圖IA 為實時PCR結果的圖表，顯示相比于對照，用硫代磷酸寡核苷酸處理HUVEC 細胞后⑶NF mRNA的倍數(shù)變化+標準偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine 2000 引入。表示為 CUR-Ol 17、CUR-Ol 18、CUR-Ol 19、CUR-0120、CUR-0121 和 CUR-0122 的條分別對應用SEQ ID NO 5-10處理的樣品。圖IB 為實時PCR結果的圖表，顯示相比于對照，用硫代磷酸寡核苷酸處理HUVEC 細胞后⑶NF mRNA的倍數(shù)變化+標準偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine 2000引入。實時PCR結果顯示⑶NF反義物的水平在用⑶R-Ol 17處理后顯著減少。表示為 CUR-Ol 17和CUR-Ol 18的條分別對應用SEQ ID NO 5和6處理的樣品。圖IC 為實時PCR結果的圖表，顯示相比于對照，用硫代磷酸寡核苷酸處理IfepG2 細胞后⑶NF mRNA的倍數(shù)變化+標準偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine 2000引入。表示為CUR-0741至CUR-0764的條分別對應用SEQ ID NO 11-34處理的樣品。圖ID 為實時PCR結果的圖表，顯示相比于對照，用硫代磷酸寡核苷酸處理Vero 細胞后⑶NF mRNA的倍數(shù)變化+標準偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine 2000引入。表示為CUR-0741至CUR-0764的條分別對應用SEQ ID NO 11-34處理的樣品。圖IE 為實時PCR結果的圖表，顯示相比于對照，用硫代磷酸寡核苷酸處理CHP212 細胞后⑶NF mRNA的倍數(shù)變化+標準偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine 2000 引入。表示為 CUR-0751、CUR-0752、CUR-0753、CUR-0120、CUR-0121 和 CUR-0117 的條分別對應用SEQ ID NO :21、22、23、8、9和5處理的樣品。圖2顯示SEQ ID NO 1 人類(Homo sapiens)膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、轉錄物變體3、mRNA(NCBI檢索號NM_199234. 1)，以及SEQ ID NO 45顯示⑶NF的基因組序列(外顯子用大寫字母顯示，內含子用小寫字母顯示)。圖3顯示SEQ ID NO 2 天然反義序列(AW883557. 1 (A))SEQ ID NO :3:天然反義序列(BM547433 (PR))SEQ ID NO 4 天然反義序列(BX505687)圖4顯示反義寡核苷酸，SEQ ID NO :5_34。*指硫代磷酸酯鍵。圖 5 顯示 SEQ ID NO :35_41。圖6顯示SEQ ID NO 42 天然反義序列(AW883557. 1 (A))可變剪接 aSEQ ID NO :43 天然反義序列(AW883557. 1 (A))可變剪接 bSEQ ID NO 44 天然反義序列(AW883557. 1 (A))可變剪接 c發(fā)明詳述參考用于說明的示例應用在下文中描述本發(fā)明的數(shù)個方面。應當理解的是，陳述許多具體細節(jié)、關系和方法來提供對本發(fā)明的充分理解。然而，在相關領域的普通技術人員將容易地認識到，可在不含一個或多個具體細節(jié)的情況下實施本發(fā)明或者可用其他方法來實施本發(fā)明。本發(fā)明不受行為或事件的排序限制，因為一些行為可以不同的順序進行和/ 或與其他行為或事件同時進行。此外，并非所有說明性的行為或事件對實施本發(fā)明的方法都為必需的。本文公開的所有基因、基因名稱和基因產(chǎn)物意圖對應來自任何物種的同源物，對該物種而言本文公開的組合物和方法為適用的。因此，該術語包括但不限于來自人和小鼠的基因和基因產(chǎn)物。理解的是，當公開來自具體物種的基因或基因產(chǎn)物時，意圖此公開僅為示范性的，并且除非其出現(xiàn)的文段中明確指示，否則不應理解為限制。因此，例如，對于本文公開的在一些實施方案中有關哺乳動物核酸和氨基酸序列的基因而言，意圖包括來自其他動物(包括但不限于其他哺乳動物、魚類、兩棲動物、爬行動物和鳥類)的同源和/或直向同源基因和基因產(chǎn)物。在優(yōu)選的實施方案中，所述基因或核酸序列為人的。定義本文所用的術語僅以描述具體的實施方案為目的而不意圖限制本發(fā)明。除非文段另有明確指示，否則本文所用的單數(shù)形式“一”、“一個”和“所述”也意圖包括復數(shù)形式。此外，就術語“包括的”、“包括”、“具有的”、“具有”、“含有”或其變型在詳述和/或權利要求中所用的程度而言，這類術語意圖以類似于術語“包含”的方式是包括在內的。術語“約”或“大約”意為在由本領域普通技術人員所確定的具體值的可接受誤差范圍之內，這部分取決于該值是如何測定或確定的，即，測量系統(tǒng)的限制。例如，按照本領域的實踐，“約”可意為在1之內或大于1的標準偏差。或者，“約”可意為高達給定值的20%， 優(yōu)選10%，更優(yōu)選5%，和還更優(yōu)選1 %的范圍?；蛘?，具體地關于生物系統(tǒng)或過程，該術語可意為在值的一個數(shù)量級之內，優(yōu)選在值的5倍之內，更優(yōu)選在2倍之內。當本申請和權利要求描述具體值時，除非另作說明，否則應假設術語“約”意為在具體值的可接受誤差范圍之內。本文所用的術語“mRNA”意為目前已知的靶定基因的mRNA轉錄物，以及任何可闡明的其它轉錄物?！胺戳x寡核苷酸”或“反義化合物”意為與另一個RNA或DNA (靶RNA、DNA)結合的 RNA或DNA分子。例如，如果其為RNA寡核苷酸，則其通過RNA-RNA相互作用結合另一個RNA 靶標并改變靶RNA的活性(Eguchi等，(1991) Ann. Rev. Biochem. 60，631-652)。反義寡核苷酸可增量調節(jié)或減量調節(jié)特定多核苷酸的表達和/或功能。該定義意在包括從治療、診斷或其他觀點來看有用的任何外源RNA或DNA分子。這類分子包括例如反義RNA或DNA分子、 干擾RNA(RNAi)、微小RNA、誘餌RNA分子、siRNA、酶促RNA、治療用編輯RNA(therapeutic editing RNA)以及激動劑和拮抗劑RNA、反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導序列 (EGS)寡核苷酸、可變剪接物(alternate splicer)、引物、探針以及其他與靶核酸的至少一部分雜交的寡聚化合物。因此，可將這些化合物以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明的文段中，術語“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA) 或其模擬物的寡聚物或聚合物。術語“寡核苷酸”，也包括天然和/或經(jīng)修飾單體或鍵 (linkage)的線性或環(huán)狀寡聚體，包括脫氧核糖核苷、核糖核苷、其取代和α-異頭物形式、 肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能夠通過單體與單體相互作用的規(guī)律模式(例如沃森-克里克(Watson-Crick)型堿基配對、Ho0gsteen或反 Hodgsteen型堿基配對等)特異地結合靶多核苷酸。寡核苷酸可為“嵌合的”，即，由不同的區(qū)組成。在本發(fā)明的文段中，“嵌合的”化合物為寡核苷酸，其包含兩個或更多個化學區(qū)，例如，DNA區(qū)、RNA區(qū)、PNA區(qū)等。每個化學區(qū)由至少一個單體單元(即，在寡核苷酸化合物的情況下為核苷酸)組成。這些寡核苷酸典型地包含至少一個區(qū)，其中所述寡核苷酸為經(jīng)修飾的以表現(xiàn)出一種或多種所需特性。寡核苷酸的所需特性包括但不限于，例如增強的對核酸酶降解的抗性、增強的細胞攝取和/或增強的對靶核酸的結合親和力。因此寡核苷酸的不同區(qū)可具有不同的特性。本發(fā)明的嵌合寡核苷酸可形成為兩種或更多種如上所述的寡核苷酸、修飾寡核苷酸、寡聚核苷和/或寡核苷酸類似物的混合結構。寡核苷酸可由可“全符合狀態(tài)(in “register”)”地連接或通過間隔物連接的區(qū)組成，所述“全符合狀態(tài)”地連接即此時單體像在天然DNA —樣連續(xù)地連接。所述間隔物意在構成區(qū)之間的共價“橋”，并在優(yōu)選的情況下具有不超過約100個碳原子的長度。所述間隔物可攜帶不同的功能性，例如具有正或負電荷的、具有特殊的核酸結合特性(嵌入劑、溝黏合劑、毒素、熒光團等)、為親脂的、誘導特殊的二級結構如例如誘導α -螺旋的含丙氨酸的肽。本文所用的“⑶NF”和“膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子”包括所有家族成員、突變體、 等位基因、片段、種類(species)、編碼和非編碼序列、有義和反義多核苷酸鏈等。本文所用的措詞“膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子”、“膠質細胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子”、“膠質細胞-衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子”、“星形膠質細胞衍生營養(yǎng)因子”、“ATF”、“ATF1”、 “ATF2”、“HFBl-GDNF”、“hOTNF，m⑶NF，在文獻中都被認為相同且在本申請中可交換地使用。本文所用的術語“對......特異的寡核苷酸”或“靶定......的寡核苷酸”是指具
有以下序列的寡核苷酸，該序列(i)能夠與靶定基因的一部分形成穩(wěn)定的復合體，或(ii)能夠與靶定基因的mRNA轉錄物的一部分形成穩(wěn)定的雙鏈體。復合體和雙鏈體的穩(wěn)定性可通過理論計算和/或體外測定來確定。用于確定雜交復合體和雙鏈體的穩(wěn)定性的示例性測定法描述于下文實施例中。本文所用的術語“靶核酸”包括DNA、從這類DNA轉錄的RNA (包括前mRNA和mRNA)， 以及從這類RNA衍生的cDNA、編碼序列、非編碼序列、有義或反義多核苷酸。寡聚化合物與其靶核酸的特異性雜交干擾核酸的正常功能。這種通過特異地與靶核酸雜交的化合物對該靶核酸功能的調節(jié)，一般稱為“反義”。待干擾的DNA功能包括例如復制和轉錄。待干擾的 RNA功能，包括所有的生活機能，例如，RNA向蛋白質翻譯位點的易位、蛋白質自RNA的翻譯、 產(chǎn)生一種或多種mRNA種類的RNA剪接，以及可由RNA參與或促進的催化活性。對靶核酸功能的這類干擾的整體效果為對編碼產(chǎn)物或寡核苷酸表達的調節(jié)。RNA干擾“RNAi ”由雙鏈RNA (dsRNA)分子介導，該分子具有與其“靶”核酸序列的序列特異性同源性(Caplen，N. J.等，(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 :9742-9747)。在本發(fā)明的某些實施方案中，介體為5-25個核苷酸的“小干擾”RNA雙鏈體(siRNA)。siRNA通過稱為切酶的 RNA 酶對 dsRNA 的加工得到(Bernstein, E.等，(2001) Nature 409:363-366)。 siRNA雙鏈體產(chǎn)物被募集到叫做RISC(RNA誘導的沉默復合體)的多蛋白siRNA復合體中。 不希望受任何具體理論所約束，認為隨后RISC被引向靶核酸(適當?shù)貫閙RNA)，其中siRNA 雙鏈體以序列特異性的方式相互作用來介導催化方式的切割(Bernstein，Ε.等，Q001) Nature 409 :363-366 ；Boutla，A.等，(2001)Curr. Biol. 11 :1776-1780)?？梢勒毡景l(fā)明使用的小干擾RNA，可根據(jù)本領域眾所周知和普通技術人員熟悉的程序來合成和使用。用于本發(fā)明的方法中的小干擾RNA適當?shù)匕s1-約50個核苷酸(nt)。在非限制性實施方案的實例中，siRNA可包含約5-約40nt、約5-約30nt、約10-約30nt、約15-約25nt、或約 20-25個核苷酸。適當寡核苷酸的挑選通過使用電腦程序來促進，該程序自動比對核酸序列并指出具有同一性或同源性的區(qū)。將這類程序用于比較通過例如搜索諸如GenBank等的數(shù)據(jù)庫或通過測序PCR產(chǎn)物而獲得的核酸序列。對來自一系列物種的核酸序列的比較，允許選擇在物種之間顯示適度同一性的核酸序列。在未測序基因的情況下，進行DNA印跡來確定在靶物種和其他物種的基因之間的同一性程度。如本領域眾所周知的，通過在不同的嚴格程度下進行DNA印跡，可能獲得同一性的近似衡量。這些程序允許選擇以下寡核苷酸，其對待控制的受試者中的靶核酸序列表現(xiàn)出高度的互補性，并且對其他物種中的相應核酸序列表現(xiàn)出較低程度的互補性。本領域的技術人員將認識到，在挑選用于本發(fā)明的適當?shù)幕騾^(qū)方面具有相當大的自由?！懊复?RNA"意為具有酶活性的 RNA 分子(Cech，(1988) J. American. Med. Assoc.沈0，3030-3035)。酶促核酸(核酶)通過首先結合靶RNA來起作用。這類結合通過酶促核酸的靶結合部分進行，所述靶結合部分保持緊密靠近進行切割靶RNA的分子的酶部分。因此，酶促核酸首先識別而后通過堿基配對結合靶RNA，且一旦結合到正確的位點，即進行酶促切割靶RNA?！罢T餌RNA”意為模擬配體的天然結合域的RNA分子。因此誘餌RNA與天然結合靶標競爭與特異性配體的結合。例如，已顯示HIV反式激活應答(TAR)RNA的過表達可充當“誘餌”并有效地結合HIV tat蛋白，從而阻止其結合到在HIV RNA中編碼的TAR序列
1(Sullenger等，(1990) Cell，63，601-608)。這意指特定實例。本領域的技術人員將認識到， 這只是一個實例，而其他的實施方案可使用本領域一般已知的技術容易地產(chǎn)生。本文所用的術語“單體”通常指以下單體，其通過磷酸二酯鍵或其類似物連接以形成大小范圍從少量單體單元(例如從約3-4)到約數(shù)百個單體單元的寡核苷酸。磷酸二酯鍵的類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯等，如下文更充分地描述。術語“核苷酸”涵蓋天然存在的核苷酸和非天然存在的核苷酸。本領域的技術人員應清楚的是，先前認為“非天然存在”的多種核苷酸后來已在自然中發(fā)現(xiàn)。因此，“核苷酸”不僅包括已知的含嘌呤和嘧啶雜環(huán)的分子，而且還包括其雜環(huán)類似物和互變異構體。其他類型的核苷酸的說明性實例為以下分子，其含有腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脫氮雜黃嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、N4, N4-橋亞乙基胞嘧啶(ethanocytosin)、N6, N6-橋亞乙基_2，6_ 二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、肌苷和在Bermer等美國專利第5，432，272號中描述的“非天然存在的”核苷酸。術語“核苷酸”意在涵蓋這些實例以及其類似物和互變異構體中的每一個和全部。尤其令人關注的核苷酸為含腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的核苷酸，其被認為是有關人中的治療和診斷應用的天然存在核苷酸。核苷酸包括天然 2，-脫氧和 2，-羥基糖，例如，如 Kornberg 和 Baker，DNA 復制(DNA Replication)，第 2 版(Freeman，San Francisco, 1992)中所述的以及其類似物。提及核苷酸的“類似物”包括具有經(jīng)修飾的堿基部分和/或經(jīng)修飾的糖部分的合成核苷酸(參見例如，由Scheit，核苷酸類似物(Nucleotide Analogs), John Wiley, New York，1980 ;Freier 禾口 Altmann， (1997)Nucl. Acid. Res. ,25(22), 4429-4443, Toulme, J. J. , (2001)Nature Biotechnology 19 :17-18 ；Manoharan Μ. , (1999)Biochemica et Biophysica Acta 1489 :117-139 ；Freier S. Μ. , (1997)Nucleic Acid Research,25 4429-4443,Uhlman,E. ， (2000)Drug Discovery & Development，3 :203-213,Herdewin P.， (2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev. , 10 :297-310 —般描述的)；2，-0，3，-C-連接的[3.2.0] 二環(huán)阿糖核苷(參加例如 N. K Christiensen.等，(1998) J.Am. Chem. Soc., 120 :5458-5463 ；Prakash TP,Bhat B. (2007)Curr Top Med Chem. 7(7) :641-9 ；Cho EJ 等， (2009) Annual Review of Analytical Chemistry，2，24H64)。這類類似物包括設計以增強結合特性的合成核苷酸，所述結合特性為例如雙鏈體或三鏈體穩(wěn)定性、特異性等。本文所用的“雜交”意為寡聚化合物的基本上互補鏈的配對。一種配對的機理涉及寡聚化合物的鏈的互補核苷或核苷酸堿基(核苷酸)之間的氫鍵合，其可為沃森-克里克、Ho0gsteen或反Hoegsteen氫鍵合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶為互補的核苷酸，其通過形成氫鍵配對。雜交可在各種環(huán)境下發(fā)生。反義化合物為“可特異地雜交的”，如果所述化合物與靶核酸的結合干擾靶核酸的正常功能而導致功能和/或活性的調節(jié)，并且在需要特異性結合的條件下存在足夠程度的互補性來避免所述反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結合，所述條件即在體內測定或治療性處理情況中的生理條件下，以及其中在體外測定情況下進行測定的條件下。本文所用的短語“嚴格雜交條件”或“嚴格條件”是指以下條件，在該條件下本發(fā)明的化合物與其靶序列雜交，但與最少數(shù)量的其他序列雜交。嚴格條件為序列依賴的且在不同環(huán)境下將不同，在本發(fā)明的文段中，在其下寡聚化合物與靶序列雜交的“嚴格條件”由寡聚化合物的性質和組成以及正在其中研究它們的試驗來確定。一般而言，嚴格雜交條件包括低濃度(< 0. 15M)的含有諸如Na++或K++等無機陽離子的鹽(即，低離子強度)、溫度高于20°C _25°C、低于寡聚化合物靶序列復合體的Tm，以及存在變性劑，例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜，或去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)。例如，雜交率對于每甲酰胺減少1. 1%。高嚴格雜交條件的實例為0. IX氯化鈉-檸檬酸鈉緩沖液(SSC)/0. 1% (w/v) SDS、60°C下達30分鐘。本文所用的“互補的”是指在一條或兩條寡聚鏈上兩個核苷酸之間精確配對的能力。例如，如果在反義化合物的某個位置上的核堿基能夠與在靶核酸的某個位置上的核堿基氫鍵合，所述靶核酸為DNA、RNA或寡核苷酸分子，則認為所述寡核苷酸和所述靶核酸之間氫鍵合的位置為互補位置。當可彼此氫鍵合的核苷酸占據(jù)了每個分子中足夠數(shù)量的互補位置時，寡聚化合物和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子為彼此互補的。因此，“可特異性雜交的”和“互補的”為以下術語，其用于表示在足夠數(shù)量的核苷酸上有足夠程度的精確配對或互補性，使得穩(wěn)定和特異的結合發(fā)生在寡聚化合物和靶核酸之間。據(jù)本領域了解，寡聚化合物的序列不需要與其可特異地雜交的靶核酸的序列 100%互補。此外，寡核苷酸可在一個或多個區(qū)段上雜交，使得間插或鄰近的區(qū)段不涉及雜交事件(例如，環(huán)結構、錯配或發(fā)夾結構)。本發(fā)明的寡聚化合物包含與其靶定的靶核酸序列內的靶區(qū)至少約70 %、或至少約75 %、或至少約80 %、或至少約85 %、或至少約90 %、或至少約95%、或至少約99%的序列互補性。例如，其中反義化合物的20個核苷酸中有18個與靶區(qū)互補且因而會特異地雜交的反義化合物，表示90%互補性。在此實例中，余下的非互補核苷酸可與互補核苷酸是聚簇或散布的且不需要彼此鄰接或鄰接互補核苷酸。因此，長度為18個核苷酸的反義化合物具有4(四)個非互補核苷酸，該非互補核苷酸位于與靶核酸完全互補的兩個區(qū)的側翼，所述反義化合物會具有與靶核酸77. 8%的總互補性，因此落入本發(fā)明的范圍內。反義化合物與靶核酸區(qū)的互補性百分比可使用本領域已知的BLAST程序(基本局部比對搜索工具)和PowerBLAST程序常規(guī)地確定(Altschul等，(1990) J. Mol. Biol.，215，403-410 ;Zhang 和 Madden，(1997)Genome Res.，7，649-656)。同源性、序列同一性或互補性百分比可通過例如Gap程序(Wisconsin序列分析包，Unix操作系統(tǒng)版本8， Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)使用默認設置來確定，該程序使用 Smith 和 Waterman 的算法(Adv. Appl. Math.，(1981) 2，482-489)。本文所用的術語“解鏈溫度(Tm) ”是指以下溫度，在限定的離子強度、pH和核酸濃度下，在該溫度下平衡時50%與靶序列互補的寡核苷酸與靶序列雜交。典型地，對于短寡核苷酸(例如，10-50個核苷酸)而言嚴格條件為以下條件，其中鹽濃度至少為約0.01-1. OM Na離子濃度(或其他鹽)，pH 7. 0-8. 3且溫度至少為約30。。嚴格條件也可通過外加諸如甲酰胺等去穩(wěn)定劑來達到。本文所用的“調節(jié)”意為在基因表達方面的增加(刺激)或減少(抑制)。術語“變體”，當用于多核苷酸序列的情況下時，可包括有關野生型基因的多核苷酸序列。此定義也可包括，例如，“等位基因的”、“剪接”、“物種”或“多態(tài)的”變體。剪接變體可具有與參比分子顯著的同一性，但因為在mRNA加工期間外顯子的可變剪接而通常具有更多或更少數(shù)量的多核苷酸。對應的多肽可具有附加的功能域或不存在域。物種變體為在不同物種之間不同的多核苷酸序列。本發(fā)明中尤其實用的是野生型基因產(chǎn)物的變體。變體可由核酸序列中的至少一個突變產(chǎn)生并可導致產(chǎn)生改變的mRNA或者其結構或功能可能改變或不變的多肽。任何給定的天然或重組基因可不具有、具有一個或許多等位基因形式。 產(chǎn)生變體的常見突變變化一般歸因于核苷酸的自然缺失、添加或取代。這些變化類型中的每一個可單獨或與其他類型聯(lián)合發(fā)生，在給定序列中發(fā)生一次或多次。產(chǎn)生的多肽一般將具有相對于彼此的顯著的氨基酸同一性。多態(tài)變體為在給定物種的個體之間特定基因的多核苷酸序列的變化。多態(tài)變體也可包括“單核苷酸多態(tài)性”(SNP)或單堿基突變，其中多核苷酸序列因一個堿基而不同。SNP的存在可指示例如具有疾病狀態(tài)傾向(即與抗性相對的易感性)的某個種群。衍生多核苷酸包括經(jīng)過化學修飾的核酸，例如用烷基、酰基或氨基置換氫。衍生物 (例如，衍生寡核苷酸)可包含非天然存在的部分，例如改變的糖部分或糖間鍵。這些中示例性的是硫代磷酸酯及本領域已知的其他含硫的種類。衍生核酸也可含有標記，包括放射性核苷酸、酶、熒光劑、化學發(fā)光劑、顯色劑、底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒，等等。“衍生的”多肽或肽為經(jīng)修飾的多肽或肽，例如，通過糖基化、聚乙二醇化、磷酸化作用、硫酸鹽化作用、還原/烷基化、?；?、化學偶聯(lián)或溫性福爾馬林處理。也可將衍生物修飾以含有可檢測標記(直接地或間接地)，包括但不限于放射性同位素、熒光和酶標記。本文所用的術語“動物”或“患者”意在包括例如人、棉羊、麋鹿、鹿、長耳鹿、貂、哺乳動物、猴、馬、牛、豬、山羊、狗、貓、大鼠、小鼠、鳥、雞、爬行動物、魚、昆蟲和蜘蛛類?！安溉閯游铩焙w通常在醫(yī)療護理下的溫血哺乳動物(例如，人和馴養(yǎng)動物)。實例包括貓科動物、犬、馬、?？苿游锖腿?，以及僅僅人。“處理”或“治療”涵蓋對哺乳動物中疾病狀態(tài)的治療，并包括(a)防止疾病狀態(tài)出現(xiàn)于哺乳動物中，特別是當這類哺乳動物傾向于疾病狀態(tài)但尚未診斷為患有該疾病狀態(tài)時；(b)抑制疾病狀態(tài)，例如，阻止其發(fā)展；和/或(C)減輕疾病狀態(tài)，例如，引起疾病狀態(tài)的退行直到達到所需的終末點。治療也包括改善疾病的癥狀(例如，減少疼痛或不適)，其中這類改善可直接或可非直接地影響疾病(例如，原因、傳遞、表達等)。本文所用的術語“癌癥”是指任何惡性腫瘤，具體地在肺、腎臟或甲狀腺中產(chǎn)生的惡性腫瘤。癌癥自身表現(xiàn)為包含癌癥惡性細胞的“腫瘤”或組織。腫瘤的實例包括肉瘤或癌，例如但不限于纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤(Ewing' s tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、 腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏腫瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質瘤、腦膜瘤、黑素瘤、 成神經(jīng)細胞瘤和視網(wǎng)膜母細胞瘤。如上所述，本發(fā)明特別地允許肺、腎臟和甲狀腺腫瘤的鑒別診斷。多核苷酸和寡核苷酸組合物和分子靶標在一個實施方案中，靶標包括膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)的核酸序列，包括但不限于與GDNF有關的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。神經(jīng)營養(yǎng)因子的膠質衍生⑶NF家族包括四個成員膠質細胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、神經(jīng)秩蛋白(neurturin)、artemin和pers印hin(PSPN)。GDNF家族配體通過受體傳導信號，該受體由GPI連接的GFRa亞基和跨膜受體酪氨酸激酶RET組成。為了激活跨膜受體酪氨酸激酶Ret，每個GDNF家族神經(jīng)營養(yǎng)因子優(yōu)先地與糖基-磷脂酰肌醇(GPI) 連接的⑶NF家族α-受體(GFR α 1-4)之一結合。⑶NF為這樣的蛋白，其可在神經(jīng)膠質細胞中鑒定到或從神經(jīng)膠質細胞中獲得，且表現(xiàn)出神經(jīng)營養(yǎng)活性。更具體地說，GDNF為這樣的多巴胺能(dopiminergic)神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，其特征部分地在于其增加黑質多巴胺能神經(jīng)元胚胎前體的多巴胺攝取的能力，并進一步在于其促進副交感和交感神經(jīng)細胞生存的能力。在優(yōu)選的實施方案中，將反義寡核苷酸用于預防或治療這樣的疾病或病癥，所述疾病或病癥與治療解耦蛋白活性增加或減少相關的疾病有關?？捎糜墒褂梅戳x化合物獲得的干細胞再生的細胞/組織治療的疾病實例包括缺陷性神經(jīng)發(fā)生有關的疾病或病癥； 神經(jīng)變性疾病或病癥(例如，阿爾茨海默氏病、帕金森病、亨廷頓舞蹈病、肌萎縮側索硬化等)；神經(jīng)精神障礙(抑郁癥、精神分裂癥、精神分裂癥樣精神障礙(schizofreniform disorder)、情感分裂性精神障礙和妄想性障礙；焦慮性障礙例如驚恐性障礙、恐怖癥(包括廣場恐怖癥)、強迫性神經(jīng)失調、創(chuàng)傷后應激障礙、雙相性精神障礙、神經(jīng)性厭食、神經(jīng)性貪食、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病(例如，多發(fā)性硬化)、記憶喪失、長期或短期記憶障礙、良性健忘、兒童學習障礙、閉合性顱腦損傷、注意力缺陷障礙、對病毒感染的神經(jīng)元反應、腦損傷、發(fā)作性睡病、睡眠障礙(例如，晝夜節(jié)律障礙、失眠癥和發(fā)作性睡病)；神經(jīng)中斷或神經(jīng)損傷、腦脊髓神經(jīng)索(CNS)中斷和腦或神經(jīng)細胞損傷、與AIDS有關的神經(jīng)功能缺損、以運動和/或發(fā)聲性抽搐(vocal tic)為特征的運動和抽搐障礙(例如，圖雷特精神障礙(Tourette' s disorder)、慢性運動或發(fā)聲性抽搐障礙、短時抽搐性障礙和刻板型活動障礙)、物質濫用病癥(例如，物質依賴、物質濫用以及物質濫用/依賴的后遺癥，例如物質誘發(fā)的心理障礙、物質戒斷和物質誘發(fā)的癡呆或遺忘癥)、外傷性腦損傷、耳鳴、神經(jīng)痛(例如，三叉神經(jīng)痛)、疼痛(例如，慢性疼痛、慢性炎性痛、與關節(jié)炎有關的疼痛、纖維肌痛、背痛、癌癥相關的疼痛、與消化性疾病有關的疼痛、與克羅恩氏病有關的疼痛、與自身免疫性疾病有關的疼痛、與內分泌疾病有關的疼痛、與糖尿病神經(jīng)病變有關的疼痛、幻肢痛、自發(fā)性疼痛、慢性術后疼痛、慢性顳下頌疼痛、灼痛、皰疹后神經(jīng)痛、AIDS相關的疼痛、 I和II型復雜性區(qū)域疼痛綜合征、三叉神經(jīng)痛、慢性背痛、與脊髓損傷有關的疼痛、與藥物攝入有關的疼痛和復發(fā)性急性疼痛、神經(jīng)性疼痛)、在諸如糖尿病、MS和運動神經(jīng)元病等疾病中導致neurodysthesias的不適當?shù)纳窠?jīng)元活性、共濟失調、肌肉強直(痙攣狀態(tài))、 顳下顎關節(jié)功能障礙、獎賞缺陷綜合征(Reward deficiency syndrome, RDQ、由酒精或物質濫用(例如，搖頭丸(ecstacy)、去氧麻黃堿等)引發(fā)的神經(jīng)毒性、精神發(fā)育遲緩或認知缺損(例如，非綜合征性X連鎖精神發(fā)育遲緩、脆性X綜合征、唐氏綜合征、孤獨癥)、失語癥、貝爾氏麻痹(Bell’ s palsy)、傳染性海綿樣腦病、腦炎、年齡相關性黃斑變性、ondine 綜合征、WAGR綜合征、聽力損失、嬰兒型脊髓性肌萎縮、慢性近端型脊肌萎縮、格-巴綜合征、多系統(tǒng)萎縮(希-德(Shy Drager)綜合征)、雷特綜合征、癲癇、脊髓損傷、中風、低氧、 缺血、腦損傷、糖尿病神經(jīng)病變、腎病或腎功能障礙、周圍神經(jīng)病、神經(jīng)移植并發(fā)癥、運動神經(jīng)元病、周圍神經(jīng)損傷、肥胖癥、代謝綜合征、癌癥、濕疹、腸能動性障礙、先天性巨結腸、失弛緩癥、食道痙攣、硬皮病(與食道平滑肌部分的肌肉萎縮、下2/3的食道體部的收縮無力和下食道括約肌機能不全有關，但是也由免疫抑制劑的治療引發(fā))、十二指腸潰瘍、佐-埃 (Zollinger-Ellison)綜合征、胃酸分泌過多、吸收不良病癥(malabsorptive disorder)、 表皮和基質創(chuàng)傷愈合障礙和/或瘢痕形成障礙、進行性肌營養(yǎng)不良(例如，杜興肌營養(yǎng)不良、貝克爾肌營養(yǎng)不良、埃-德(Emery-Dreifuss)肌營養(yǎng)不良、面肩肱型肌營養(yǎng)不良、 肩胛肱骨型肌營養(yǎng)不良、肢帶肌營養(yǎng)不良、Von Graefe-Fuchs肌營養(yǎng)不良、眼咽肌營養(yǎng)不良、強直性肌營養(yǎng)不良和先天性肌營養(yǎng)不良)、先天性或后天性肌病、貧血(包括大紅細胞性貧血和再生障礙性貧血)；血小板減少；發(fā)育不全；彌散性血管內凝血(DIC)；脊髓發(fā)育不良；免疫性(自身免疫性)血小板減少性紫癜(ITP)、HIV誘發(fā)的ITP、血小板增多性 (thrombocytotic)疾病、病毒感染、神經(jīng)腫瘤學疾病或病癥、神經(jīng)免疫學疾病或病癥和神經(jīng)耳科疾病或病癥、耳蝸感覺細胞損傷、缺陷性聽覺、嗜鉻細胞瘤、2型多發(fā)性內分泌瘤病、腦視網(wǎng)膜血管瘤病(VHL)、1型神經(jīng)纖維瘤病；以及與老化和衰老有關的疾病或病癥。在一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸對于GDNF的多核苷酸(其包括但不限于非編碼區(qū))而言為特異的。⑶NF靶標包括⑶NF的變體；⑶NF的突變體，包括SNP ；⑶NF的非編碼序列；等位基因、片段等。優(yōu)選所述寡核苷酸為反義RNA分子。依照本發(fā)明的實施方案，靶核酸分子不單獨限于GDNF多核苷酸，而是擴展到GDNF 的任何同種型、受體、同源物、非編碼區(qū)等。 在另一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸靶定GDNF靶標的天然反義序列(針對編碼和非編碼區(qū)的天然反義物)，所述GDNF靶標包括但不限于其變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、片段和互補序列。優(yōu)選所述寡核苷酸為反義RNA或DNA分子。在另一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物也包括變體，其中在所述化合物的一個或多個核苷酸位置上存在不同的堿基。例如，如果第一個核苷酸為腺嘌呤，則可產(chǎn)生在此位置含有胸苷、鳥苷、胞苷或其他天然或非天然核苷酸的變體。這可在所述反義化合物的任何位置上完成。然后使用本文所述的方法來檢測這些化合物以確定其抑制靶核酸的表達的能力。在一些實施方案中，反義化合物與靶標之間的同源性、序列同一性或互補性為約 50%-約60%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約60% -約70%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約70% -約80%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約80% -約90%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。反義化合物在以下情況時為可特異性雜交的所述化合物與靶核酸的結合干擾靶核酸的正常功能而引起活性損失，并且在需要特異性結合的條件下存在足夠程度的互補性以避免所述反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結合。這類條件包括，即，在體內測定或治療性處理情況中的生理條件，以及其中在體外測定情況下進行測定的條件。反義化合物，不論DNA、RNA、嵌合的、取代的等等，在以下情況時為可特異性雜交的所述化合物與靶DNA或RNA分子的結合干擾靶DNA或RNA的正常功能而引起效用損失， 并且在需要特異性結合的條件下存在足夠程度的互補性以避免所述反義化合物與非靶序列的非特異性結合，所述條件即在體內測定或治療性處理情況中的生理條件下，以及在體外測定情況下在其中進行測定的條件下。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，靶定⑶NF調節(jié)⑶NF的表達或功能，⑶NF包括但不限于使用例如PCR、雜交等鑒定和擴增的反義序列、一個或多個如SEQ ID N0:2、3或4所述的序列，等等。在一個實施方案中，表達或功能與對照相比為增量調節(jié)的。在另一個優(yōu)選的實施方案中，表達或功能與對照相比為減量調節(jié)的。在另一個優(yōu)選的實施方案中，寡核苷酸包括如SEQ ID NO :5_34所述的核酸序列， 包括使用例如PCR、雜交等鑒定和擴增的反義序列。這些寡核苷酸可包含一個或多個經(jīng)修飾的核苷酸、較短或較長的片段、經(jīng)修飾的鍵等。經(jīng)修飾的鍵或核苷酸間鍵的實例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述核苷酸包括磷衍生物?？蛇B接到本發(fā)明的修飾寡核苷酸中的糖或糖類似物部分的磷衍生物(或經(jīng)修飾的磷酸基)，可為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、鏈烷磷酸酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯類似物的制備，以及它們摻入到核苷酸、修飾核苷酸和寡核苷酸中本身也為已知的且無需在此描述。反義物的特異性和敏感性也被本領域的技術人員用于治療用途。已將反義寡核苷酸用作在動物和人的疾病狀態(tài)治療中的治療部分。已將反義寡核苷酸安全和有效地施用給人，并且目前正在進行許多臨床試驗。因此已確定寡核苷酸可為有用的治療形式，其可將經(jīng)配置以在用于治療細胞、組織和動物尤其人的治療方案中有用。在本發(fā)明的實施方案中，寡聚反義化合物(具體地寡核苷酸)結合到靶核酸分子并調節(jié)由靶基因編碼的分子的表達和/或功能。待干擾的DNA功能包括例如復制和轉錄。 待干擾的RNA功能包括所有的生活機能，例如RNA向蛋白質翻譯位點的易位、蛋白質自RNA 的翻譯、產(chǎn)生一種或多種mRNA種類的RNA剪接，以及可由RNA參與或促進的催化活性。所述功能可被增量調節(jié)或受抑制，這取決于所需的功能。反義化合物包括反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導序列(EGQ寡核苷酸、 可變剪接物、引物、探針和與靶核酸的至少一部分雜交的其他寡聚化合物。因此，這些化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明的情況下，將反義化合物靶定到特定的核酸分子可為多步過程。所述過程通常以鑒定待調節(jié)其功能的靶核酸開始。此靶核酸可為，例如其表達與特定病癥或疾病狀態(tài)有關的細胞基因(或從基因轉錄的mRNA)，或來自傳染劑的核酸分子。在本發(fā)明中，所述靶核酸編碼膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)。靶定過程通常也包括確定靶核酸內的至少一個靶區(qū)、區(qū)段或位點以用于發(fā)生反義相互作用，使得產(chǎn)生所需的效應，例如，表達的調節(jié)。在本發(fā)明的文段中，術語“區(qū)”定義為具有至少一個可識別結構、功能或特征的靶核酸的一部分。靶核酸區(qū)內為區(qū)段。“區(qū)段”定義為在靶核酸內區(qū)的較小或亞部分。本發(fā)明所用的“位點”定義為靶核酸內的位置。在優(yōu)選的實施方案中，反義寡核苷酸結合到膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF) 的天然反義序列并調節(jié)膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF) (SEQ ID NO 1)的表達和/或功能。反義序列的實例包括SEQ ID N0:2-34。表1顯示可用于本發(fā)明的方法中的示例性反義寡核苷酸。表 權利要求
1.一種在體內或體外調節(jié)患者細胞或組織中膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與至少一種長度為約5-約30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種寡核苷酸與以下多核苷酸的反向互補序列具有至少50%序列同一性，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO :2的核苷酸1-237或SEQ ID NO :3的核苷酸1-1246或SEQ ID NO 4的核苷酸1-684(圖3)或者SEQ ID NO 42的核苷酸1-400或SEQ ID NO 43的核苷酸1-619或SEQ ID NO 44的核苷酸1-813之內的約5-約30個連續(xù)核苷酸；從而在體內或體外調節(jié)患者細胞或組織中膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)多核苷酸的功能和/或表達。
2.一種在體內或體外調節(jié)患者細胞或組織中膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與至少一種長度為約5-約30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種寡核苷酸與膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)多核苷酸的天然反義物的反向互補序列具有至少50%序列同一性；從而在體內或體外調節(jié)患者細胞或組織中膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)多核苷酸的功能和/或表達。
3.一種在體內或體外調節(jié)患者細胞或組織中膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與至少一種長度為約5-約30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少 50%序列同一性；從而在體內或體外調節(jié)患者細胞或組織中膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)多核苷酸的功能和/或表達。
4.一種在體內或體外調節(jié)患者細胞或組織中膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與靶定膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)多核苷酸的天然反義寡核苷酸的區(qū)的至少一種反義寡核苷酸接觸；從而在體內或體外調節(jié)患者細胞或組織中膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)多核苷酸的功能和/或表達。
5.權利要求4的方法，其中膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)的功能和/或表達在體內或體外相對于對照增加。
6.權利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶定膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)多核苷酸的天然反義序列。
7.權利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶定核酸序列，所述核酸序列包括膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)多核苷酸的編碼和/或非編碼核酸序列。
8.權利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶定膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)多核苷酸的重疊和/或非重疊序列。
9.權利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸包含一種或多種選自以下的修飾至少一種經(jīng)修飾的糖部分、至少一種經(jīng)修飾的核苷間鍵、至少一種經(jīng)修飾的核苷酸及其組合。
10.權利要求9的方法，其中所述一種或多種修飾包括至少一種選自以下的經(jīng)修飾糖部分2’ -0-甲氧基乙基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -0-烷基修飾的糖部分、二環(huán)糖部分及其組合。
11.權利要求9的方法，其中所述一種或多種修飾包括至少一種選自以下的經(jīng)修飾核苷間鍵硫代磷酸酯、2’ -0-甲氧基乙基(MOE)、2’ -氟、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
12.權利要求9的方法，其中所述一種或多種修飾包括至少一種選自以下的經(jīng)修飾核苷酸肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、阿糖核酸(FANA)、其類似物、衍生物和組合。
13.權利要求1的方法，其中所述至少一種寡核苷酸包含至少一個如SEQID NO :5-34 所述的寡核苷酸序列。
14.一種在體內或體外調節(jié)哺乳動物細胞或組織中膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子 (GDNF)基因的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與至少一種長度為約5-約30個核苷酸的短干擾RNA(SiRNA)寡核苷酸接觸，所述至少一種siRNA寡核苷酸對膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)多核苷酸的反義多核苷酸有特異性，其中所述至少一種siRNA寡核苷酸與膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子 (⑶NF)多核苷酸的反義和/或有義核酸分子的至少約五個連續(xù)核酸的互補序列具有至少 50%序列同一性；和，在體內或體外調節(jié)哺乳動物細胞或組織中膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)的功能和/或表達。
15.權利要求14的方法，其中所述寡核苷酸與至少約五個連續(xù)核酸的序列具有至少 80%序列同一性，所述序列與膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)多核苷酸的反義和/或有義核酸分子互補。
16.一種在體內或體外調節(jié)哺乳動物細胞或組織中膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子 (GDNF)的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與至少一種長度為約5-約30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，所述反義寡核苷酸對膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)多核苷酸的有義和/或天然反義鏈的非編碼和/或編碼序列特異，其中所述至少一種反義寡核苷酸與至少一個如SEQ ID NO 1-4所述的核酸序列具有至少50%序列同一性；和，在體內或體外調節(jié)哺乳動物細胞或組織中膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)的功能和/或表達。
17.一種合成的、經(jīng)修飾的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含至少一種修飾，其中所述至少一種修飾選自至少一種經(jīng)修飾的糖部分、至少一種經(jīng)修飾的核苷酸間鍵、至少一種經(jīng)修飾的核苷酸及其組合；其中所述寡核苷酸為在體內或體外與膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子 (GDNF)基因雜交并與正常對照相比調節(jié)所述基因的功能和/或表達的反義化合物。
18.權利要求17的寡核苷酸，其中所述至少一種修飾包括選自以下的核苷酸間鍵硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、 磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
19.權利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一種硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
20.權利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵的骨架。
21.權利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一種經(jīng)修飾的核苷酸，所述經(jīng)修飾的核苷酸選自肽核酸、鎖定核酸(LNA)、其類似物、衍生物和組合。
22.權利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的經(jīng)修飾的核苷酸硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
23.權利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的經(jīng)修飾的核苷酸肽核酸、鎖定核酸(LNA)、其類似物、衍生物和組合。
24.權利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一種選自以下的經(jīng)修飾的糖部分2’ -0-甲氧基乙基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -0-烷基修飾的糖部分、二環(huán)糖部分及其組合。
25.權利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的經(jīng)修飾的糖部分2’ -0-甲氧基乙基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、 2’ -0-烷基修飾的糖部分、二環(huán)糖部分及其組合。
26.權利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸具有至少約5-約30個核苷酸的長度且與膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)多核苷酸的反義和/或有義鏈雜交，其中所述寡核苷酸與膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個連續(xù)核酸的互補序列具有至少約20%序列同一性。
27.權利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF) 多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個連續(xù)核酸的互補序列具有至少約80%序列同一性。
28.權利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸在體內或體外與至少一種膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)多核苷酸雜交并與正常對照相比調節(jié)所述多核苷酸的表達和/或功能。
29.權利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一個如SEQID NO :5_34所述的序列。
30.一種組合物，所述組合物包含對一種或多種膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)多核苷酸特異的一種或多種寡核苷酸，所述多核苷酸包括反義序列、互補序列、等位基因、同源物、同種型、變體、衍生物、突變體、片段或其組合。
31.權利要求30的組合物，其中所述一種或多種寡核苷酸與如SEQID NO :5_34所述核苷酸序列中的任一個相比，具有至少約40 %序列同一性。
32.權利要求30的組合物，其中所述一種或多種寡核苷酸中的至少一種包含如SEQID NO :5-34所述的核苷酸序列。
33.權利要求32的組合物，其中如SEQID NO :5_34所述的寡核苷酸包含一種或多種修飾或取代。
34.權利要求33的組合物，其中所述一種或多種修飾選自硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、 肽核酸、鎖定核酸(LNA)分子及其組合。
35.一種預防或治療與至少一種膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)多核苷酸和/或至少一種其編碼產(chǎn)物有關的疾病的方法，所述方法包括給患者施用治療有效劑量的至少一種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸與所述至少一種膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)多核苷酸的天然反義序列結合，并調節(jié)所述至少一種膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)多核苷酸的表達；從而預防或治療與至少一種膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)多核苷酸和/或至少一種其編碼產(chǎn)物有關的疾病。
36.權利要求35的方法，其中與至少一種膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)多核苷酸有關的疾病選自缺陷性神經(jīng)發(fā)生有關的疾病或病癥；神經(jīng)變性疾病或病癥(例如，阿爾茨海默氏病、帕金森病、亨廷頓舞蹈病、肌萎縮側索硬化等)；神經(jīng)精神障礙(抑郁癥、精神分裂癥、精神分裂癥樣精神障礙、情感分裂性精神障礙和妄想性障礙；焦慮性障礙例如驚恐性障礙、恐怖癥(包括廣場恐怖癥)、強迫性神經(jīng)失調、創(chuàng)傷后應激障礙、雙相性精神障礙、神經(jīng)性厭食、神經(jīng)性貪食、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫性疾病(例如，多發(fā)性硬化)、記憶喪失、 長期或短期記憶障礙、良性健忘、兒童學習障礙、閉合性顱腦損傷、注意力缺陷障礙、對病毒感染的神經(jīng)元反應、腦損傷、發(fā)作性睡病、睡眠障礙(例如，晝夜節(jié)律障礙、失眠癥和發(fā)作性睡病)；神經(jīng)中斷或神經(jīng)損傷、腦脊髓神經(jīng)索(CNS)中斷和腦或神經(jīng)細胞損傷、與AIDS有關的神經(jīng)功能缺損、以運動和/或發(fā)聲性抽搐為特征的運動和抽搐障礙(例如，圖雷特精神障礙、慢性運動或發(fā)聲性抽搐障礙、短時抽搐性障礙和刻板型活動障礙)、物質濫用病癥(例如，物質依賴、物質濫用以及物質濫用/依賴的后遺癥，例如物質誘發(fā)的心理障礙、物質戒斷和物質誘發(fā)的癡呆或遺忘癥)、外傷性腦損傷、耳鳴、神經(jīng)痛(例如，三叉神經(jīng)痛)、疼痛 (例如，慢性疼痛、慢性炎性痛、與關節(jié)炎有關的疼痛、纖維肌痛、背痛、癌癥相關的疼痛、與消化性疾病有關的疼痛、與克羅恩氏病有關的疼痛、與自身免疫性疾病有關的疼痛、與內分泌疾病有關的疼痛、與糖尿病神經(jīng)病變有關的疼痛、幻肢痛、自發(fā)性疼痛、慢性術后疼痛、慢性顳下頌疼痛、灼痛、皰疹后神經(jīng)痛、AIDS相關的疼痛、I和II型復雜性區(qū)域疼痛綜合征、三叉神經(jīng)痛、慢性背痛、與脊髓損傷有關的疼痛、與藥物攝入有關的疼痛和復發(fā)性急性疼痛、 神經(jīng)性疼痛)、在諸如糖尿病、MS和運動神經(jīng)元病等疾病中導致neurodysthesias的不適當?shù)纳窠?jīng)元活性、共濟失調、肌肉強直(痙攣狀態(tài))、顳下顎關節(jié)功能障礙、獎賞缺陷綜合征 (RDS)、由酒精或物質濫用(例如，搖頭丸、去氧麻黃堿等)引發(fā)的神經(jīng)毒性、精神發(fā)育遲緩或認知缺損(例如，非綜合征性X連鎖精神發(fā)育遲緩、脆性X綜合征、唐氏綜合征、孤獨癥)、 失語癥、貝爾氏麻痹、傳染性海綿樣腦病、腦炎、年齡相關性黃斑變性、ondine綜合征、WAGR 綜合征、聽力損失、嬰兒型脊髓性肌萎縮、慢性近端型脊肌萎縮、格-巴綜合征、多系統(tǒng)萎縮 (希-德綜合征)、雷特綜合征、癲癇、脊髓損傷、中風、低氧、缺血、腦損傷、糖尿病神經(jīng)病變、 腎病或腎功能障礙、周圍神經(jīng)病、神經(jīng)移植并發(fā)癥、運動神經(jīng)元病、周圍神經(jīng)損傷、肥胖癥、 代謝綜合征、癌癥、濕疹、腸能動性障礙、先天性巨結腸、失弛緩癥、食道痙攣、硬皮病(與食道平滑肌部分的肌肉萎縮、下2/3的食道體部的收縮無力和下食道括約肌機能不全有關， 但是也由免疫抑制劑的治療引發(fā))、十二指腸潰瘍、佐-埃綜合征、胃酸分泌過多、吸收不良病癥、表皮和基質創(chuàng)傷愈合障礙和/或瘢痕形成障礙、進行性肌營養(yǎng)不良(例如，杜興肌營養(yǎng)不良、貝克爾肌營養(yǎng)不良、埃-德肌營養(yǎng)不良、面肩肱型肌營養(yǎng)不良、肩胛肱骨型肌營養(yǎng)不良、肢帶肌營養(yǎng)不良、Von Graefe-Fuchs肌營養(yǎng)不良、眼咽肌營養(yǎng)不良、強直性肌營養(yǎng)不良和先天性肌營養(yǎng)不良)、先天性或后天性肌病、貧血(包括大紅細胞性貧血和再生障礙性貧血)；血小板減少；發(fā)育不全；彌散性血管內凝血(DIC)；脊髓發(fā)育不良；免疫性(自身免疫性)血小板減少性紫癜(ITP)、HIV誘發(fā)的ITP、血小板增多性疾病、病毒感染、神經(jīng)腫瘤學疾病或病癥、神經(jīng)免疫學疾病或病癥和神經(jīng)耳科疾病或病癥、耳蝸感覺細胞損傷、缺陷性聽覺、嗜鉻細胞瘤、2型多發(fā)性內分泌瘤病、腦視網(wǎng)膜血管瘤病(VHL)、1型神經(jīng)纖維瘤??；以及與老化和衰老有關的疾病或病癥。
37. 一種鑒定和選擇用于體內施用的至少一種寡核苷酸的方法，所述方法包括選擇與疾病狀態(tài)有關的靶多核苷酸；鑒定包含至少五個連續(xù)核苷酸的至少一種反義寡核苷酸， 所述連續(xù)核苷酸與所選的靶多核苷酸或與所選靶多核苷酸的反義多核苷酸互補；在嚴格雜交條件下，測定所述反義寡核苷酸與所述靶多核苷酸或所選靶多核苷酸的反義多核苷酸的雜合體的熱解鏈溫度；以及基于獲得的信息選擇用于體內施用的至少一種寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及反義寡核苷酸，具體而言，其通過靶定膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)的天然反義多核苷酸，調節(jié)膠質細胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)的表達和/或功能。本發(fā)明還涉及這些反義寡核苷酸的鑒定及其在治療與GDNF表達有關的疾病和病癥中的用途。
文檔編號C12N15/113GK102439149SQ201080017106
公開日2012年5月2日 申請日期2010年2月12日 優(yōu)先權日2009年2月12日
發(fā)明者C·科伊托, J·科拉德, 謝爾曼 O·霍爾科瓦 申請人:歐科庫爾納有限責任公司