專利名稱：二甲基精氨酸二甲胺水解酶測定方法及其診斷試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二甲基精氨酸二甲胺水解酶(Dimethylarginine dimethylaminohydrolase EC3. 5. 3. 18，DDAH)活力的酶學(xué)循環(huán)測定方法及其診斷試劑，屬 于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
非對稱二甲基精氨酸是一種甲基化精氨酸，是內(nèi)源性一氧化氮合酶(Nitric oxide sythase，N0S)抑制劑，可競爭性抑制一氧化氮(Nitric oxide,NO)的合成。它是細 胞內(nèi)蛋白質(zhì)在精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶作用下發(fā)生甲基化，再經(jīng)水解反應(yīng)生成的非對稱二甲基精 氨酸。二甲基精氨酸二甲胺水解酶通過調(diào)節(jié)體內(nèi)非對稱二甲基精氨酸的水平而影響NOS的 活性，進而調(diào)節(jié)體內(nèi)NO的生成。DDAH活性與多種心血管疾病之間存在密切關(guān)系，被認為是 新的心血管疾病相關(guān)蛋白和藥物防治靶點。DDAH是胞內(nèi)酶，有DDAHl和DDAH2兩個亞型，與胚胎組織比較，出生后組織中 DDAH2表達顯著增加，而DDAHl表達基本無變化。這兩種亞型在體內(nèi)分布存在差異，其中 DDAHl多存在于主要表達神經(jīng)型NOS的組織，如大腦和腎臟等；而DDAH2則多存在于以內(nèi)皮 型NOS表達為主的組織，如心臟、血管和腎臟等。臨床應(yīng)用中對二甲基精氨酸二甲胺水解酶的測定方法主要包括高壓液相色譜 法、酶聯(lián)免疫法等。上述方法的共同特點是需要特別的測定儀器、操作復(fù)雜，試驗耗時較長， 不能應(yīng)用于臨床大流量的自動化分析，并且價格昂貴。Y-L Tain 和 C Baylis 在 Kidney Int. 2007 October ；72 (7) :886-889 中報道了一 種測定大鼠腎臟組織樣本中DDAH的改良方法，該方法采用手工法測定生成的L-瓜氨酸，靈 敏度低，不能自動化。由于DDAH在組織樣本中的含量很低，常規(guī)臨床酶學(xué)的測定方法無法達到所需的 測定靈敏度，限制了常規(guī)方法的采用。在酶學(xué)方法測定DDAH技術(shù)方面，雖然近年來酶學(xué)檢 測的信號增量技術(shù)不斷發(fā)展，但至今未見有關(guān)酶循環(huán)法測定DDAH活力的方法學(xué)報道；也未 見DDAH全自動診斷試劑的報道和應(yīng)用。本發(fā)明公開了一種新的測定組織樣本中DDAH的酶循環(huán)方法，該方法不受樣本中 干擾物質(zhì)的干擾，具有優(yōu)良的反應(yīng)靈敏度。首次提出并建立了采用酶學(xué)循環(huán)方法測定組織 樣本中DDAH方法學(xué)新原理及其應(yīng)用試劑。該試劑可應(yīng)用于目前各類廣泛使用的臨床自動 分析儀，從而達到快速、大規(guī)模測定樣本的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種采用循環(huán)增量技術(shù)的酶學(xué)測定方法及其試劑，測定組織樣本 中DDAH的活力。其設(shè)計原理是樣本中的DDAH催化非對稱二甲基精氨酸水解為二甲胺和 L-瓜氨酸(L-Citrulline)，產(chǎn)物L(fēng)-瓜氨酸在瓜氨酸水解酶(Citrullinase EC 3.5. 1.20) 的作用下，水解為L-鳥氨酸(L-Ornithine)、二氧化碳和氨；生成的L-鳥氨酸與試劑中的氨基甲酰磷酸鹽在鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(Ornithine carbamoyltransferase EC 2.1.3.3) 的作用下，再生成L-瓜氨酸和磷酸鹽。在該酶循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)中，L-瓜氨酸的生成量與樣本 中DDAH的活力成正比，通過測定酶循環(huán)反應(yīng)體系中氨的生成速率，就可以達到測定樣本中 DDAH活力的目的。臨床應(yīng)用中酶法測定氨濃度的方法很多，最常見的是谷氨酸脫氫酶反應(yīng)方法。氨 與a-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶的作用下，產(chǎn)生L-谷氨酸，同時輔酶NADH或NADPH被氧化 為NAD+或NADP+，反應(yīng)系統(tǒng)在340nm處的吸光度值下降?？赏ㄟ^測定該吸光度的下降值計 算出氨的濃度，從而得出被測酶的活力。由于本發(fā)明設(shè)計的酶循環(huán)方法中的L-瓜氨酸反復(fù)循環(huán)參與反應(yīng)，不斷產(chǎn)生氨，故 大大提高了測定的靈敏度。本發(fā)明關(guān)于DDAH活力測定的酶循環(huán)法測定方法學(xué)原理如下非對稱二甲基精氨酸+水二甲基精氨酸二甲胺水解酶L-瓜氨酸+ 二甲胺L-瓜氨酸+水瓜氨酸水解酶L-鳥氨酸+ 二氧化碳+氨L-鳥氨酸+氨基甲酰磷酸鹽鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶L-瓜氨酸+磷酸鹽本發(fā)明首次創(chuàng)建了由瓜氨酸水解酶O^itrullinase EC 3. 5. 1. 20)和鳥氨酸氨甲 酰轉(zhuǎn)移酶(Ornithine carbamoyltransferase EC 2. 1. 3. 3)組成的酶循環(huán)反應(yīng)測定方法， 并應(yīng)用于樣本中DDAH酶活力的測定?；诿阜ㄑh(huán)增量測定的特點，循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)的酶使 用量不要求很高，最終反應(yīng)濃度一般在0. 1 500ku/L之間，最好在0. 2 50ku/L之間，酶 的用量與酶的催化活力有關(guān)。當然，增加酶的用量并不影響本發(fā)明方法的應(yīng)用，但會增加試 劑的制造成本。優(yōu)化酶和底物應(yīng)用量可以促進循環(huán)反應(yīng)向理想的方向進行，在循環(huán)機制中 非對稱二甲基精氨酸、氨基甲酰磷酸鹽的用量應(yīng)過量。本發(fā)明同時公開了基于上述方法的體外診斷測定試劑，采用本方法可以大大提高 測定靈敏度，使其第一次能夠像自動化酶學(xué)診斷試劑一樣應(yīng)用于各類半自動或全自動生化 分析儀，進行快速、大流量的樣本檢測。利用本發(fā)明的酶循環(huán)方法，可以按照普通酶學(xué)診斷技術(shù)制備出各種單一劑型、雙 液體試劑劑型或多液體試劑劑型的DDAH診斷測定試劑。在本發(fā)明的一個實施例中，根據(jù)上述反應(yīng)原理，采用谷氨酸脫氫酶方法測定氨生 成的速率氨+a-酮戊二酸+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶L-谷氨酸+氧化型輔酶通過監(jiān)測還原型輔酶特定波長處吸光度變化的變化，檢測酶循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)中氨的 生成速率，可以計算出樣本中DDAH的活力。在臨床診斷酶學(xué)測定試劑中，常用的輔酶或其 類似物包括還原型輔酶I (NADH)、還原型輔酶II (NADPH)、硫代還原型輔酶I (thio_NADH)、 硫代還原型輔酶II (thio-NADPH)等。其中NADH或NADPH其特定檢測吸光度在340nm， thio-NADH或thio-NADPH其特定檢測吸光度在398nm處，在各種分析儀器上在405nm附近 進行檢測。也可進一步采用酶循環(huán)法測氨的方法，在此不再列舉，本專業(yè)的技術(shù)人員可以根 據(jù)上述原理，設(shè)計出多種酶循環(huán)測氨的方法和試劑，但并不脫離本發(fā)明的應(yīng)用范圍。采用本發(fā)明酶循環(huán)機制配制的DDAH測定試劑中包含緩沖液，如磷酸鹽緩沖液、 Tris緩沖液、N-(2-羥乙基)哌嗪-N，- -乙基磺酸)(HEPEQ緩沖液等；非對稱二甲基精氨酸采用的是非對稱二甲基精氨酸二鹽酸鹽，也可以是其它鹽結(jié)晶形式；穩(wěn)定劑，包括但并 不局限于以下一種或多種化合物甘露糖醇、甘油、聚乙二醇、EDTA、金屬離子(如鉀離子、 鈉離子、鋅離子)、氯離子、牛血清白蛋、表面活性劑及至少一種防腐劑等。上述兩種方法學(xué)試劑在應(yīng)用中的測定方法，與本專業(yè)中常規(guī)的應(yīng)用方法相同，如 可以采用速率法或兩點法，通過參照校準品或繪制標準濃度曲線等，計算出被測物的含量， 在此不再贅述。本專業(yè)技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的原理和方法配制出各種類似的測定試劑，但 并不脫離出本發(fā)明的原理和應(yīng)用范圍。
具體實施例方式實施例1 采用本發(fā)明建立的酶循環(huán)反應(yīng)機制，直接測定試劑系統(tǒng)產(chǎn)生的還原型 輔酶I。
試劑組份每升用量常用每升用量范圍緩沖液IOOmmol10 300mmol非對稱二甲基精氨酸二鹽酸鹽0. 5g0. 01 50g瓜氨酸水解酶25ku0. 1 500ku鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶15ku0. 1 500ku氨基甲酰磷酸鹽5mmol0. 01 120mmol谷氨酸脫氫酶Iku0. 1 50ku還原型輔酶I0.28mmol0. 1 5mmola-酮戊二酸7mmol1 IOOmmol穩(wěn)定劑5%體積比0. 1 100%體積比實施例2 也可將上述實施例1中的試劑配制成雙試劑，各試劑組分在試劑1或試 劑2中的位置不限，可以是干粉試劑，使用前加水溶解使用，也可以是液體試劑，直接或混 合使用
試劑1緩沖液100mmol/L還原型輔酶I0. 35mmol/L瓜氨酸水解酶25ku/L鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶15ku/L穩(wěn)定劑5%體積比
試劑2緩沖液100mmol/L非對稱二甲基精氨酸二鹽酸鹽0. 5g谷氨酸脫氫酶5ku/La-酮戊二酸28mmol/L氨基甲酰磷酸鹽7mmol/L穩(wěn)定劑5%體積比實施例3 也可將上述實施例1中的試劑配制成三試劑，各試劑組分在試劑1、試劑 2或試劑3中的位置不限，各組分可以是干粉試劑，使用前加水溶解使用，也可以是液體試 劑，直接或混合使用
試劑1緩沖液100mmol/L還原型輔酶I0. 32mmol/L谷氨酸脫氫酶3ku/La-酮戊二酸28mmol/L穩(wěn)定劑5%體積比試劑2緩沖液lOOmmol/L氨基甲酰磷酸鹽15mmol/L穩(wěn)定劑5%體積比
權(quán)利要求
1.一種對組織樣本中二甲基精氨酸二甲胺水解酶(Dimethylarginine dimethylaminohydrolaseEC 3. 5. 3. 18，DDAH)活力的測定方法，其方法學(xué)設(shè)計特征在于 樣本中的二甲基精氨酸二甲胺水解酶催化底物非對稱二甲基精氨酸水解為二甲胺和L-瓜 氨酸(L-Citrulline)，產(chǎn)物L(fēng)-瓜氨酸在瓜氨酸水解酶(Citrullinase EC 3.5. 1. 20)的作 用下，水解為L-鳥氨酸、二氧化碳和氨；在這一新的產(chǎn)品檢測方法中，使生成的L-鳥氨酸與 試劑中的氨基甲酰磷酸鹽在鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(Ornithine carbamoyltransferase EC 2.1.3. 3)的催化作用下，再生成L-瓜氨酸和磷酸鹽。在其中的酶循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)中，L-瓜氨 酸的生成量與樣本中DDAH的活力成正比，氨的生成速率與L-瓜氨酸的生成速率成正比，通 過測定氨的生成速率可以計算出樣本中被測物的濃度。其酶學(xué)方法學(xué)原理如下非對稱二甲基精氨酸+水二甲基精氨酸二甲胺水解酶L-瓜氨酸+ 二甲胺L-瓜氨酸+水瓜氨酸水解酶L-鳥氨酸+ 二氧化碳+氨L-鳥氨酸+氨基甲酰磷酸鹽鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶L-瓜氨酸+磷酸鹽
2.一種二甲基精氨酸二甲胺水解酶活力的測定試劑，根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法學(xué)原 理，氨在谷氨酸脫氫酶的催化作用下，與a-酮戊二酸反應(yīng)，生成L-谷氨酸，同時還原型輔酶 被氧化為氧化型輔酶，反應(yīng)系統(tǒng)在輔酶特定波長處的吸光度值下降。通過測定該吸光度的 下降值可計算出氨的濃度，從而達到測定樣本中二甲基精氨酸二甲胺水解酶活力的目的。氨+a-酮戊二酸+還原型輔酶谷氨酸脫氫酶L-谷氨酸+氧化型輔酶 其主要成分包括試劑組分每升用量緩沖液10 3 OOmmol非對稱二甲基精氨酸0.01 50g瓜氨酸水解酶0.1~500ku鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶0.1~500ku氨基甲酰磷酸鹽0.01~120mmol谷氨酸脫氫酶0.1~50ku還原型輔酶0.1~5mmolα-酮戊二酸1 IOOmmol穩(wěn)定劑0.1 100%體積比其特征在于試劑可以是干粉或凍干試劑，使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的二甲基精氨酸二甲胺水解酶活力測定試劑，其中酶包 括瓜氨酸水解酶(Citrullinase EC 3. 5. 1. 20)、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(Ornithine carbamoyltransferase EC 2.1.3. 和谷氨酸脫氫酶；還原型輔酶是指還原型輔酶 I (NADH)、還原型輔酶II (NADPH)或還原型硫代輔酶I (thio_NADH)中的一種，底物是指非對 稱二甲基精氨酸、氨基甲酰磷酸鹽和a-酮戊二酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的二甲基精氨酸二甲胺水解酶活力測定試劑，其特征在于由 緩沖液、瓜氨酸水解酶、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸脫氫酶、還原型輔酶、非對稱二甲基精 氨酸、氨基甲酰磷酸鹽、a-酮戊二酸和穩(wěn)定劑組成的單試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的二甲基精氨酸二甲胺水解酶活力測定試劑，其特征在于由 緩沖液、瓜氨酸水解酶、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸脫氫酶、還原型輔酶、非對稱二甲基精 氨酸、氨基甲酰磷酸鹽、a-酮戊二酸和穩(wěn)定劑組成的雙試劑試劑。試劑1，由緩沖液、還原型 輔酶、瓜氨酸水解酶、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶和穩(wěn)定劑組成，試劑2，由緩沖液、非對稱二甲基 精氨酸、谷氨酸脫氫酶、氨基甲酰磷酸鹽、a-酮戊二酸和穩(wěn)定劑組成。瓜氨酸水解酶、鳥氨 酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸脫氫酶、還原型輔酶、非對稱二甲基精氨酸、氨基甲酰磷酸鹽、a-酮 戊二酸在試劑1或在試劑2的位置可以不限。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的二甲基精氨酸二甲胺水解酶活力測定試劑，其特征在于由 緩沖液、瓜氨酸水解酶、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸脫氫酶、還原型輔酶、非對稱二甲基精 氨酸、氨基甲酰磷酸鹽、a-酮戊二酸和穩(wěn)定劑組成的多試劑試劑。試劑1，由緩沖液、谷氨酸 脫氫酶、還原型輔酶、a-酮戊二酸和穩(wěn)定劑組成，試劑2，由緩沖液、氨基甲酰磷酸鹽和穩(wěn)定 劑組成；試劑3，由緩沖液、瓜氨酸水解酶、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶、非對稱二甲基精氨酸和穩(wěn) 定劑組成。瓜氨酸水解酶、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶、谷氨酸脫氫酶、還原型輔酶、非對稱二甲基 精氨酸、氨基甲酰磷酸鹽、a-酮戊二酸在試劑1或在試劑2或在試劑3的位置可以不限。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的二甲基精氨酸二甲胺水解酶活力測定試劑，其特征在于 還包括穩(wěn)定劑0. 1 3000mmol/L或0. 1 100%體積比。所述穩(wěn)定劑為甘露糖醇 (Mannitol)，甘油(Glycerol)，聚乙二醇(PEG)，牛血清白蛋白、EDTA，鈉離子，鉀離子，氯離 子、鋅離子，表面活性劑及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于一種二甲基精氨酸二甲胺水解酶活力的酶學(xué)循環(huán)測定方法，及其診斷試劑。在設(shè)計的產(chǎn)品檢測方法中組織樣本中的二甲基精氨酸二甲胺水解酶催化非對稱二甲基精氨酸水解，生成瓜氨酸；在這一新的設(shè)計方法中，使瓜氨酸在瓜氨酸水解酶(EC 3.5.1.20)和鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(EC 2.1.3.3)及其底物組成的酶循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)不斷循環(huán)反應(yīng)，從而大大地提高了反應(yīng)靈敏度，瓜氨酸生成量與樣本中二甲基精氨酸二甲胺水解酶的活力成正比，通過測定循環(huán)酶反應(yīng)體系中氨的生成速率，就可以達到測定樣本中二甲基精氨酸二甲胺水解酶活力的目的。本發(fā)明試劑可以是干粉試劑，也可以是液體試劑；可以是單劑試劑，雙劑試劑或多劑試劑。
文檔編號C12Q1/48GK102140495SQ20101059568
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日
發(fā)明者王學(xué)忠 申請人:浙江亞太藥業(yè)股份有限公司