專(zhuān)利名稱(chēng)：一株能直接利用木糖產(chǎn)生酒精的異常畢赤酵母菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株能直接利用木糖產(chǎn)生酒精的異常畢赤酵母菌菌株，屬工業(yè)微生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
環(huán)境、能源和持續(xù)發(fā)展已經(jīng)成為目前世界性的問(wèn)題，其中能源是人類(lèi)社會(huì)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。隨著現(xiàn)代工業(yè)，農(nóng)業(yè)和國(guó)防科技事業(yè)的迅猛發(fā)展，能源的消耗量顯著增加。一場(chǎng)全面的能源危機(jī)使得人類(lèi)開(kāi)始尋找替代能源。必須逐步擴(kuò)大可再生的生物質(zhì)資源的比例。 乙醇作為可替代燃料具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)生產(chǎn)成本相對(duì)較低；(2)對(duì)環(huán)境的污染比汽油、柴油均小得多；(3) 20%的乙醇和汽油混合使用，汽車(chē)發(fā)動(dòng)機(jī)不必改裝；(4)其來(lái)源取之不盡， 用之不竭。生產(chǎn)乙醇的原料主要有植物纖維原料，糖蜜和含淀粉質(zhì)原料等。地球上每年大約形成1700億噸植物有機(jī)物，是自然界分布最廣、含量最多、價(jià)格低廉，而又未得到充分利用的可再生資源川，除少量用于造紙、建筑、紡織等行業(yè)或用作粗飼料、薪柴外，大部分未被有效利用，而白白爛掉或燒掉，有些還造成環(huán)境污染(例如焚燒)。通過(guò)生物技術(shù)將這些纖維廢棄物轉(zhuǎn)化為能源、化工產(chǎn)品等，可一舉數(shù)得，同時(shí)緩解上述幾個(gè)問(wèn)題。以酒精作為石油的代用能源，其關(guān)鍵是降低酒精的生產(chǎn)成本。目前雖然淀粉質(zhì)原料很容易從農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到， 并且淀粉生產(chǎn)酒精的技術(shù)也十分成熟，但是利用豐富，廉價(jià)且可再生的植物纖維原料生產(chǎn)乙醇的研究己經(jīng)漸漸成為全球范圍的熱點(diǎn)之一。這些原料可來(lái)自軟、硬木材，雜草，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢棄物，舊報(bào)紙，城市固體廢物等。所有植物來(lái)源的木質(zhì)纖維素均含有豐富的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，在植物纖維原料中，戊聚糖約占20% — 30%，在植物纖維原料水解液中戊糖占30%左右，因此，以木糖為主的戊糖發(fā)酵是決定植物纖維資源生產(chǎn)酒精經(jīng)濟(jì)可行的關(guān)鍵之一。Karczweskav于1959年第一次提出了用木糖發(fā)酵乙醇，但這個(gè)發(fā)現(xiàn)未引起人們的足夠重視。直到1980年，wnag等人提出，木糖可被一些微生物發(fā)酵成酒精。此后， 國(guó)際上掀起一股木糖酒精發(fā)酵菌種的研究熱潮，迄今為止已發(fā)現(xiàn)100多種微生物能代謝木糖成酒精，包括細(xì)菌、真菌、和酵母。在戊糖發(fā)酵的微生物中，酵母的戊糖發(fā)酵能力最強(qiáng)，目前人們研究最多且最有工業(yè)應(yīng)用前景的木糖發(fā)酵微生物有3種酵母菌種，即管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、樹(shù)干畢赤酵母(Pihcia stipitis)和休哈塔假絲酵母 (Candidashechatate)它們的木糖發(fā)酵酒精轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)能力分別達(dá)0. 28-0. 48g/g (酒精 / 消耗的糖)和 0. 02-0. 66g/ (L · h)。但是能同化戊糖的酵母大多不能發(fā)酵戊糖生產(chǎn)酒精，而能發(fā)酵戊糖的酵母發(fā)酵木糖的酒精產(chǎn)率較低， 選育高效的木糖發(fā)酵菌仍然是開(kāi)發(fā)纖維素類(lèi)可再生資源的重要技術(shù)關(guān)鍵之一。迄今為止，能工業(yè)化運(yùn)用的酒精生產(chǎn)菌株只有釀酒酵母，除工程菌外，現(xiàn)行釀酒酵母又不能利用木糖等戊糖，而工程菌利用木糖的能力還不能滿足工業(yè)化的需要。本發(fā)明經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見(jiàn)與本發(fā)明相同的公開(kāi)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)行酒精生產(chǎn)菌株——釀酒酵母 Saccharomycescerevisiae (非工程菌)不能直接利用木糖發(fā)酵產(chǎn)生酒精，木糖工程菌株利用木糖的能力還不能滿足工業(yè)化需要的不足，而提供一株能直接利用木糖產(chǎn)生酒精的異常畢赤酵母菌菌株，從而擴(kuò)寬現(xiàn)行酒精生產(chǎn)菌株生產(chǎn)酒精的原料來(lái)源的，降低纖維素生產(chǎn)酒精的成本。本發(fā)明通過(guò)從自然界中進(jìn)行菌株分離、培養(yǎng)，獲得一株能直接利用木糖產(chǎn)生酒精的異常畢赤酵母(Pichia anomala)MLBl菌株(保藏號(hào)CGMCCNo. 4252，中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心2010年10月22日保藏)，該菌株能100%直接發(fā)酵木糖產(chǎn)生酒精，酒精產(chǎn)率大干50%。該菌株也能100%利用葡萄糖產(chǎn)生酒精，酒精轉(zhuǎn)化率大于60%。 本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)能降低纖維素酒精乃至燃料乙醇的生產(chǎn)成本。本發(fā)明是通過(guò)如下常規(guī)過(guò)程獲得將采集自云南省元江縣城郊的土壤樣品(2 克)，用麥芽液體培養(yǎng)基富集培養(yǎng)48小時(shí)，然后按稀釋涂布法取一定量的富集液進(jìn)行涂布分離，挑取單菌落純化保存?zhèn)溆?，采用的培養(yǎng)基為只含木糖的氮基礎(chǔ)培養(yǎng)基。本發(fā)明的能直接利用木糖產(chǎn)生酒精的異常畢赤酵母菌菌株按如下常規(guī)酒精發(fā)酵步驟實(shí)現(xiàn)首先，將纖維素原料處理后成為木糖液作為碳源，添加到酵母酒精發(fā)酵的常規(guī)培養(yǎng)基中，調(diào)整pH值4. 0-5. 2，開(kāi)始使用。其次，酒精發(fā)酵將MLBl菌株按微生物發(fā)酵常規(guī)液體種子培養(yǎng)方法、以滅菌木糖液(含糖濃度為2% -5% )培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)搖瓶、種子罐一系列培養(yǎng)后，當(dāng)每毫升培養(yǎng)液含酵母菌數(shù)大于1 X 108個(gè)時(shí)，按發(fā)酵罐培養(yǎng)液(已滅菌，含糖濃度大于5% ) 1/15的量投入到發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度控制在28°C，pH值控制在4. 0-5. 2，保持持續(xù)或間斷通入無(wú)菌空氣，即每間隔1小時(shí)通氣10分鐘。培養(yǎng)48-72小時(shí)。第三，蒸餾按現(xiàn)行常規(guī)酒精生產(chǎn)蒸餾方法進(jìn)行。本發(fā)明的酵母菌菌株MLBl具備以下特征(1)酵母菌菌株MLBl是異常畢赤酵母(Pichia anomala)，基本生理特征細(xì)胞短卵形至圓柱形，單個(gè)、成雙或呈短鏈，菌落白色，表面皺狀；25°C培養(yǎng)3-10天形成子囊，每個(gè)子囊含1-4個(gè)球形孢子；(2)酵母菌菌株MLBl同酒精生產(chǎn)所使用的其它釀酒酵母菌菌株相比，能100%直接發(fā)酵木糖產(chǎn)生酒精，酒精產(chǎn)率大干50%。該菌株也能100%利用葡萄糖產(chǎn)生酒精，酒精轉(zhuǎn)化率大于60%。能降低纖維素酒精乃至燃料乙醇的生產(chǎn)成本。本發(fā)明提供的能直接利用木糖產(chǎn)生酒精的異常畢赤酵母菌菌株，彌補(bǔ)了木糖工程菌株利用木糖能力的不足，從而擴(kuò)寬現(xiàn)行酒精生產(chǎn)菌株生產(chǎn)酒精的原料來(lái)源的，降低纖維素生產(chǎn)酒精的成本。同時(shí)，還為酵母菌利用木糖發(fā)酵酒精提供遺傳依據(jù)。


圖1和圖2為異常畢赤酵母(Pichia anomala)MLBl菌株顯微形態(tài)照片(100X)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一首先，將纖維素原料處理后成為木糖液作為碳源，添加到酵母酒精發(fā)酵的常規(guī)培養(yǎng)基中，調(diào)整pH值4. 0，開(kāi)始使用。其次，酒精發(fā)酵將MLBl菌株按微生物發(fā)酵常規(guī)液體種子培養(yǎng)方法、以滅菌木糖液培養(yǎng)基(含糖濃度為2%)進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)搖瓶、種子罐一系列培養(yǎng)后，當(dāng)每毫升培養(yǎng)液含酵母菌數(shù)大于1 X 108個(gè)時(shí)，按發(fā)酵罐培養(yǎng)液(已滅菌，含糖濃度5% ) 1/15的量投入到發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度控制在28°C，pH值控制在4.0，保持持續(xù)或間斷通入無(wú)菌空氣，即每間隔1 小時(shí)通氣10分鐘。培養(yǎng)48小時(shí)。木糖100%被利用產(chǎn)生酒精，其產(chǎn)率大于50%。第三，蒸餾按現(xiàn)行常規(guī)酒精生產(chǎn)蒸餾方法進(jìn)行。實(shí)施例二 與實(shí)施例一不同之處培養(yǎng)液的pH值為4. 5，種子培養(yǎng)液的糖濃度為3%，發(fā)酵罐培養(yǎng)液的糖濃度為7%，培養(yǎng)時(shí)間60小時(shí)。實(shí)施例三與實(shí)施例一不同之處培養(yǎng)液的pH值為5. 2，種子培養(yǎng)液的糖濃度為5%，發(fā)酵罐培養(yǎng)液的糖濃度為10%，培養(yǎng)時(shí)間72小時(shí)。實(shí)施例四首先，以葡萄糖作為碳源，添加到酵母酒精發(fā)酵的常規(guī)培養(yǎng)基中，調(diào)整PH值4. 0， 開(kāi)始使用。其次，酒精發(fā)酵將MLBl菌株按微生物發(fā)酵常規(guī)液體種子培養(yǎng)方法、以滅菌培養(yǎng)基(含糖濃度為3%)進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)搖瓶、種子罐一系列培養(yǎng)后，當(dāng)每毫升培養(yǎng)液含酵母菌數(shù)大于1 X IO8個(gè)時(shí)，按發(fā)酵罐培養(yǎng)液(已滅菌，含糖濃度大于5% ) 1/15的量投入到發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度控制在28°C，pH值控制在4.0，保持持續(xù)或間斷通入無(wú)菌空氣，即每間隔1 小時(shí)通氣10分鐘。培養(yǎng)48小時(shí)。第三，蒸餾按現(xiàn)行常規(guī)酒精生產(chǎn)蒸餾方法進(jìn)行。葡萄糖的利用率為100%，產(chǎn)生酒精的轉(zhuǎn)化率> 60%。
權(quán)利要求
1. 一株能直接利用木糖的異常畢赤酵母菌菌株，其特征在于異常畢赤酵母 (Pichiaanomala)MLBl菌株，于2010年10月22日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCCNo. 4252。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株能直接利用木糖的異常畢赤酵母菌株，屬工業(yè)微生物發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及的菌株MLB1是分離自云南省元江縣城郊自然生態(tài)環(huán)境，并能直接發(fā)酵木糖產(chǎn)生酒精的野生型菌株。該菌株經(jīng)分類(lèi)學(xué)鑒定屬于異常畢赤酵母Pichia anomala，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC No.4252。該菌株能100％直接發(fā)酵木糖或葡萄糖產(chǎn)生酒精，以木糖為碳源的酒精產(chǎn)率大于50％，以葡萄糖為碳源的酒精轉(zhuǎn)化率大于60％。本發(fā)明提供的能直接利用木糖產(chǎn)生酒精的異常畢赤酵母菌菌株，彌補(bǔ)了木糖工程菌株利用木糖能力的不足，從而擴(kuò)寬現(xiàn)行酒精生產(chǎn)菌株生產(chǎn)酒精的原料來(lái)源的，降低纖維素生產(chǎn)酒精的成本。同時(shí)，還為酵母菌利用木糖發(fā)酵酒精提供遺傳依據(jù)。
文檔編號(hào)C12R1/84GK102154128SQ201010593070
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2010年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月17日
發(fā)明者喬敏, 余澤芬, 周薇, 張克勤, 賈東晨 申請(qǐng)人:云南大學(xué)