專利名稱：一種檢測(cè)宮頸癌的試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種檢測(cè)宮頸癌的試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
子宮頸癌是目前唯一一種病因明確的癌癥，最能被有效預(yù)防，早期發(fā)現(xiàn)和有效治 愈的癌癥。子宮頸癌前病變和早期癌多無(wú)癥狀，婦科檢查亦難發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)癥狀時(shí)，80%以上 已為侵潤(rùn)癌，難以治愈。從HPV感染到宮頸癌前病變要經(jīng)歷5-20年的時(shí)間，當(dāng)今的宮頸癌檢查第一步是 以子宮頸抹片方式，會(huì)有很多因素造成漏診。第二步是人類乳突病毒(HPV)檢測(cè)技術(shù)來(lái)檢 測(cè)婦女是否感染病毒與罹患子宮頸癌，這種手法也會(huì)造成假陽(yáng)性的結(jié)果。不僅如此，還很難 判定是否應(yīng)該手術(shù)和手術(shù)的時(shí)期，導(dǎo)致治療不利，影響治療效果。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于以上不足，本發(fā)明的主要目的在于提供一種檢測(cè)宮頸癌的試劑盒及檢測(cè)方法。為了達(dá)到以上目的，本發(fā)明提供的該種檢測(cè)宮頸癌的試劑盒，包括a.針對(duì)SOXl、PAXl、LMX1A、NKX6-1、WTl和ONECUT1基因的甲基化特異性和非甲基 化特異性的引物對(duì)；和/或，b.針對(duì)HPV-Ll蛋白的特異性和非特異性引物對(duì)。上述試劑盒還包括用于提取DNA、PCR、雜交、顯色等所需的試劑，如提取液、擴(kuò)增 液、雜交液、酶、對(duì)照液等。本發(fā)明還提供一種檢測(cè)宮頸癌的方法，包括以下步驟a).從宮頸刮片的組織細(xì)胞中提取DNA ；b).對(duì)基因 S0X1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1 和 0NECUT1 進(jìn)行 PCR 增殖，采用異常甲 基化檢測(cè)方法(MSP)檢測(cè)得出是否甲基化結(jié)果，如果得出甲基化結(jié)果，說(shuō)明該病人的HPV感 染涉及到了基因水平的變化，提示病情的惡性轉(zhuǎn)歸，需及早治療；c).將宮頸組織進(jìn)行PCR增殖，電泳，檢測(cè)是否存在HPV-L1，如果檢測(cè)出HPV-L1的 陽(yáng)性結(jié)果，說(shuō)明該病人有向好的方向轉(zhuǎn)歸的提示。S0X1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1和0NECUT1基因是與宮頸癌相關(guān)的腫瘤抑制基因， 其啟動(dòng)子部位CpG島甲基化是SOXl、PAXl、LMX1A、NKX6-1、WTl和0NECUT1基因失活的主要 機(jī)制之一。本發(fā)明是應(yīng)用甲基化特異性PCR(Methylation specific PCR,MSP)對(duì)不同宮頸 鱗癌細(xì)胞系SOXl、PAXl、LMX1A、NKX6-1、WTl和ONECUT1基因啟動(dòng)子CpG島甲基化狀態(tài)進(jìn)行 檢測(cè)，在分子水平上了解S0X1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WTl和ONE⑶Tl甲基化與宮頸癌的相 關(guān)性，并且早期作出診斷；而HPV-Ll蛋白的存在又提示宮頸癌前病變可以轉(zhuǎn)歸，也就是可 以自身修復(fù)。如果兩者都存在的前提下，首先要把宮頸相關(guān)的基因S0X1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、
3WTl和ONE⑶Tl去甲基化，然后觀察其預(yù)后。上述檢測(cè)SOXl、PAXl、LMX1A、NKX6-1、WTl和0NECUT1是否甲基化的方法，對(duì)于宮 頸癌的判斷準(zhǔn)確率達(dá)到99%。本發(fā)明通過(guò)分別檢測(cè)SOXl、PAXl、LMX1A、NKX6-1、WTl和0NECUT1是否甲基化以及 檢測(cè)是否存在HPV-L1，可以很明確的判定患者是否患宮頸癌，以及提早治療基因的甲基化， 和用HPV-Ll蛋白檢測(cè)轉(zhuǎn)歸。這樣在分子水平上很完善的評(píng)估患者的宮頸癌變和轉(zhuǎn)歸的實(shí) 際情況，有效的指導(dǎo)治療。從而避免了現(xiàn)今宮頸癌治療的誤診和過(guò)治療，以及漏診。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步說(shuō)明，但不作對(duì)其的限定本發(fā)明提供的該種檢測(cè)宮頸癌的試劑盒，包括a.針對(duì)S0X1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1和0NECUT1基因的甲基化特異性和非甲基 化特異性的引物對(duì)；和/或，b.針對(duì)HPV-Ll蛋白的特異性引物對(duì)。上述針對(duì)SOXl、PAXl、LMX1A、NKX6-1、WTl和0NECUT1基因的甲基化特異性和非甲 基化特異性的引物對(duì)，采用異常甲基化檢測(cè)方法(MSP)，可以得到的結(jié)果是甲基化特異性 引物和非甲基化特異性引物均擴(kuò)增出目的條帶，呈現(xiàn)出甲基化雜合性狀態(tài)；或甲基化特異 性引物擴(kuò)增出了目的條帶，非甲基化特異性引物未擴(kuò)增出目的條帶，表現(xiàn)為完全甲基化狀 態(tài)。DNA甲基化改變不僅可以直接或間接影響基因轉(zhuǎn)錄，也可通過(guò)5甲基胞嘧啶脫氨基誘發(fā) 胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?，引起基因異常表達(dá)，還可引起染色體結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致基因表達(dá)不穩(wěn) 定，由此通過(guò)以上與宮頸癌密切相關(guān)的抑癌基因的甲基化判定宮頸癌的發(fā)生。上述針對(duì)HPV-Ll蛋白的特異性和非特異性引物對(duì)，同樣用PCR增殖的形式，檢測(cè) HPV-Ll的存在，HPV Ll殼蛋白是HPV病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，Ll殼蛋白單體會(huì)與T細(xì)胞(⑶4/ CD8)及MHHC I/II(主要組織相容性復(fù)合體)形成免疫復(fù)合物，僅一個(gè)單一的免疫復(fù)合物即 會(huì)激活免疫連鎖反應(yīng)并在局部形成高濃度的免疫抗體。HPV Ll在機(jī)體中的表達(dá)往往說(shuō)明機(jī) 體受到HPV感染且病毒處于復(fù)制階段，正常情況下，Ll的表達(dá)有利于激發(fā)人體細(xì)胞免疫，清 除感染的細(xì)胞。但是當(dāng)HPV病毒DNA整合到宿主基因后，HPV Ll殼蛋白表達(dá)缺失，機(jī)體無(wú) 法識(shí)別清除病變細(xì)胞，引發(fā)宮頸病變或病變的進(jìn)展。因此，HPV Ll殼蛋白的存在意味著非 進(jìn)展性的病變，而其缺失則是HPV相關(guān)惡性轉(zhuǎn)化的分子基礎(chǔ)。上述試劑盒還包括用于提取DNA、PCR、雜交、顯色等所需的試劑，如提取液、擴(kuò)增 液、雜交液、酶、對(duì)照液等。本發(fā)明還提供一種檢測(cè)宮頸癌的方法，包括以下步驟a).從宮頸刮片細(xì)胞中提取DNA ；b).對(duì)基因 S0X1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1 和 0NECUT1 進(jìn)行 PCR 增殖，采用異常甲 基化檢測(cè)方法(MSP)檢測(cè)得出是否甲基化結(jié)果，如果得出甲基化結(jié)果，說(shuō)明該病人的HPV感 染涉及到了基因水平的變化，提示病情的惡性轉(zhuǎn)歸，需及早治療；c)檢測(cè)是否存在HPV-Ll，如果檢測(cè)出HPV-Ll的陽(yáng)性結(jié)果，說(shuō)明該病人有向好的方 向轉(zhuǎn)歸的提示。S0X1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1和0NECUT1基因是與宮頸癌相關(guān)的腫瘤抑制基因，
4其啟動(dòng)子部位CpG島甲基化是SOXl、PAXl、LMX1A、NKX6-1、WTl和0NECUT1基因失活的主要 機(jī)制之。上述SOXl、PAXl、LMX1A、NKX6-1、WTl和0NECUT1基因與宮頸癌的相關(guān)信息如表1 所示表 權(quán)利要求
一種檢測(cè)宮頸癌的試劑盒，其特征在于，包括a.針對(duì)SOX1、PAX1、LMX1A、NKX6 1、WT1和ONECUT1基因的甲基化特異性和非甲基化特異性的引物對(duì)；和/或，b.針對(duì)HPV L1蛋白的特異性和非特異性引物對(duì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)宮頸癌的試劑盒，其特征在于，還包括用于提取DNA、 PCR、雜交、顯色所需的試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)宮頸癌的試劑盒，其特征在于，所述試劑包括提取液、擴(kuò) 增液、雜交液、酶、對(duì)照液。
4.一種檢測(cè)宮頸癌的方法，其特征在于，包括以下步驟a).從宮頸刮片中提取DNA;b).對(duì)基因S0X1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1和0NECUT1進(jìn)行PCR±曾殖，采用異常甲基化 檢測(cè)方法檢測(cè)得出是否基化結(jié)果；c).將宮頸組織進(jìn)行PCR增殖，電泳，檢測(cè)是否存在HPV-Ll。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)宮頸癌的方法，其特征在于，在步驟b)得出結(jié)果為已 甲基化，以及步驟c)得出HPV-Ll的陽(yáng)性結(jié)果，進(jìn)一步包括以下步驟把宮頸相關(guān)的基因 SOXl、PAXl、LMX1A、NKX6-1、WTl和0NECUT1去甲基化，然后觀察其預(yù)后。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別提供一種檢測(cè)宮頸癌的試劑盒及檢測(cè)方法。SOX1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1和ONECUT1基因是與宮頸癌相關(guān)的腫瘤抑制基因，其啟動(dòng)子部位CpG島甲基化是所述基因失活的主要機(jī)制之一。本發(fā)明通過(guò)分別檢測(cè)SOX1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1和ONECUT1基因啟動(dòng)子部位CpG島甲基化以及檢測(cè)是否存在HPV-L1，可以很明確的判定患者是否患宮頸癌，以及提早治療基因的甲基化，和用HPV-L1蛋白檢測(cè)轉(zhuǎn)歸。這樣在分子水平上很完善的評(píng)估患者的宮頸癌變和轉(zhuǎn)歸的實(shí)際情況，有效的指導(dǎo)治療。從而避免了現(xiàn)今宮頸癌治療的誤診和過(guò)治療，以及漏診。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101974645SQ20101055599
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月24日
發(fā)明者張秀茹 申請(qǐng)人:張秀茹