專利名稱：鑒定地衣芽孢桿菌bl63516菌株的專用rapd引物、鑒定方法及鑒定用基因序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及鑒定地衣芽孢桿菌BL63516菌株(保藏號(hào) CGMCC N0.0183)的專用引物、鑒定方法及鑒定用基因序列，以及所獲得的DNA指紋圖譜。
背景技術(shù)：
地衣芽孢桿菌BL63516屬于硬壁菌門、芽孢桿菌目、芽孢桿菌科、芽孢桿菌 屬、地衣芽孢桿菌種，是一種安全、無毒、有效的菌種。該菌株可用于急慢性腸炎和 腸道菌群失調(diào)癥的治療，目前，擁有廣闊的市場(chǎng)。鑒定地衣芽孢桿菌的方法有兩大 類，一類是依據(jù)表型的常規(guī)方法，包括形態(tài)特征鑒定、培養(yǎng)及生理特征鑒定、生化特 征鑒定；再有就是新興的分子生物技術(shù)，包括G+C含量測(cè)定、DNA/DNA雜交同源 性測(cè)定、16SrDNA基因序列分析及DNA指紋圖譜技術(shù)——隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析 (RAPD)。長期以來，芽孢桿菌分類多以形態(tài)特征和生理生化特征為主要指標(biāo)，盡管這些 方法能對(duì)這類細(xì)菌進(jìn)行初步分類，但由于芽孢桿菌形態(tài)易受培養(yǎng)條件的影響，加之其生 理生化特征相似，以形態(tài)特征和生理生化特征差異為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)分類方法很難對(duì)地衣芽 孢桿菌相近種屬做出正確鑒定，至于同種不同株的鑒定更是難上加難，且傳統(tǒng)的菌種鑒 定方法，檢測(cè)項(xiàng)目繁雜、耗時(shí)較長且準(zhǔn)確性不高。近年來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，開辟了基因診斷技術(shù)在細(xì)菌分類鑒定中的 應(yīng)用。例如G+C含量測(cè)定、DNA/DNA雜交同源性測(cè)定、16SrDNA基因序列分析等。 但這些技術(shù)的開發(fā)和利用在一些G細(xì)菌的鑒定中應(yīng)用的比較多。目前，學(xué)界也逐步利用 這方面技術(shù)，根據(jù)遺傳特征分析來進(jìn)行微生態(tài)細(xì)菌(多為G+菌)的鑒定分類。由此， DNA指紋圖譜技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，該方法可以直接用于細(xì)菌種間、亞種間乃至菌株間的分類 和鑒定，在對(duì)菌株基因序列一無所知的前提下即可分析其DNA的多態(tài)性，具有多態(tài)性 高、信息量大、操作簡單、直觀可靠、DNA用量少、純度要求不高、隨機(jī)引物沒有嚴(yán)格 的種屬界限等優(yōu)點(diǎn)，是普及率最高的一種分子標(biāo)記。因此，研制開發(fā)鑒定地衣芽孢桿菌 BL63516菌株的專用引物、鑒定方法及鑒定用基因序列一直是亟待解決的新課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鑒定地衣芽孢桿菌BL63516 菌株的專用RAPD引物、鑒定方法及鑒定用基因序列，利用其發(fā)明的引物及方法鑒定地 衣芽孢桿菌BL63516，不但可以鑒定到種，還可以直接進(jìn)行地衣芽孢桿菌種內(nèi)，BL63516 與其它不同菌株間的分類和鑒定，準(zhǔn)確性和靈敏度很高。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種鑒定地衣芽孢桿菌BL63516菌株的專用 RAPD引物，該引物的核苷酸序列為5-GAACCTGCGG-3或5-TCACGTCCAC-3 ；鑒定 地衣芽孢桿菌BL63516菌株的鑒定方法，以樣品總DNA為模板，利用引物的核苷酸序列為5-GAACCTGCGG-3或5-TCACGTCCAC-3中任一種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以瓊脂糖凝膠電 泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物判定樣品是否為地衣芽孢桿菌BL63516;利用 弓丨物5-GAACCTGCGG-3若在4500-6000bp位置產(chǎn)生一條特征條帶則判定為陽性；利用 弓丨物5-TCACGTCCAC-3若在1460bp位置產(chǎn)生一條特征條帶則判定為陽性；PCR反應(yīng)體 系為 25 μ L，由 2.5μ L 的 IOXTaq Buffer (μ L)、1.5-1.75 μ L 濃度為 25mmol/L 的 MgCl2 溶液、0.5 μ L濃度為10mmol/L的dNTP、0.25 μ L濃度為5U/ μ L的Taq DNA聚合酶、 1 μ L濃度為0.5pmol/ μ L的隨機(jī)引物、1 μ L濃度為20_30ng/ μ L的DNA模板和余量的 無菌雙蒸水組成；PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性3min; 94°C變性45s、36°C退火60s、72°C 延伸2min，共40個(gè)循環(huán)；72°C修復(fù)延伸IOmin ；鑒定地衣芽孢桿菌BL63516菌株的基因 序列，利用引物的核苷酸序列5-TCACGTCCAC-3進(jìn)行擴(kuò)增，用于鑒定BL63516基因序 列為 TCACGTCCACTTACGACGGAATGGCGCTTGCGCAGGCAATCATCGAGTACGT TCACGAGCACATCGGCGCGAAGACTTTATTTTCCACTCACTATCACGAGCTGACATCC CTTGAAGAAAAGCTTGCCGACTTGAAGAATGTTCACGTTCGTGCGGAAGAATACGAA GGAAAGGTCGTATGCCTTCACCAGATAAAAGAAGGCGCAGCAGATAAAAGCTACGGT ATCCATGTCGCGCAGCTTGCCGAATTGCCCGACGGTTTGATCAGCAGGGCGAAAACG ATTCTGAAAGAGCTTGAATCCGGCGCCAAAGAAGCGGTTCCATCAACGGCTCCGAAT ACGGTAAAAGAGGCGGCGGAAGAAGTCGCGGCAACTGTTGCAGATCAACCGGCCCA GCTGTCATTTTTTGAAACGGACAAGCCGAAAGAAAAAGAGACGAAGCTCTCCAAAA AAGAGCAGGCTGTTTTAGCCGAATTTAAAACGATGGATCTGCTCGATATGACGCCTAT ACAAGTCATGAATGAACTGTACAGGCTGCAAAAAAAATTAAAGTAATAAAGAGGTGA CCCAACTTGGCAAAAATTGTTCAGCTGCCAGACGATTTATCGAATAAAATCGCGGCG GGTGAAGTAGTGGAAAGGCCTGCGTCGGTCGTCAAAGAGCTTGTCGAAAATGCAAT CGATGCGAACAGCTCCGTGATTGAAATCGATGTTGAAGAAGCGGGTCTCGCCTCGAT TAAAGTGCTTGACGACGGCGAAGGGATGGATGCAGAAGACTGCAGAACGGCTTTTTT GCGTCATGCCACAAGCAAAATCAAAGACGAAAACGATCTGTTTCGCGTCAGAACGCT CGGATTTCGCGGAGAAGCTTTGCCAAGTATCGCGTCTGTCTCACATCTAAGCATTAAA ACGAGCACCGGAGAAGGAGCAGGCACCCATTTGACGCTTCAGGGGGGGAGAATCAT TTCCGAGCAAAAAGCGTCAAGCCGCAGAGGAACCGAAATTACGGTTACCAATCTGTT TTTTAATACGCCGGCAAGGCTGAAATATATGAAAACGATCCATACGGAGCTTGGCAAC ATTACAGATGTGGTCAACAGAATTGCCCTTGCCCACCCGGAAGTTTCGATCAGGCTGC GTCATCAAGGGAAAACGCTTCTGCAGACAAACGGAAACGGCGATGTCCGCCACGTG CTTGCGGCGATTTACGGCACGGCGGTTGCCAAAAAAATGCTCCCGCTTGAAGCGAGA TCTCTTGATTTTGAAGTGAAAGGCTATATCGCCCTTCCCGAAATTACGCGTGCATCGC GAAATTACATGTCATCTGTCGTCAACGGCAGATACATTAAAAATTTTCCGCTCGTGAA AGCGATCCACGAGGGCTACCATACGCTTCTTCCGATCGGCCGCCATCCGATCACGTTT ATTGAAATCAACATGGACCCGCTGCTTGTGGACGTGA鑒定地衣芽孢桿菌BL63516菌株的專用RAPD引物，含引物的核苷酸序列為 5-GAACCTGCGG-3或5-TCACGTCCAC-3的試劑盒；鑒定地衣芽孢桿菌BL63516菌株的鑒定方法，其特征在于利用鑒定地衣芽孢桿菌BL63516菌株的鑒定方法得到的鑒定 地衣芽孢桿菌BL63516DNA指紋圖譜。本發(fā)明的要點(diǎn)在于鑒定地衣芽孢桿菌BL63516菌株的專用RAPD引物，該引物 的核苷酸序列為5-GAACCTGCGG-3或5-TCACGTCCAC-3 ；在25 μ L的PCR反應(yīng)體系 中，濃度為25mmol/L的MgCl2溶液用量為1.5-1.75 μ L。鑒定地衣芽孢桿菌BL63516菌株的專用RAPD引物、鑒定方法及鑒定用基因序 列與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有多態(tài)性高、信息量大、操作簡單、直觀可靠、DNA用量少、純 度要求 不高、隨機(jī)引物沒有嚴(yán)格的種屬界限等優(yōu)點(diǎn)，將廣泛的應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域中。


下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。圖1為利用引物5-GAACCTGCGG-3，分別在Mg2+濃度為1.5和1.75 μ L的條件 下鑒定6株地衣芽孢桿菌與1株蠟狀芽孢桿菌獲得的DNA指紋圖譜，其中M代表DNA Ladder(BeyoRed)，1-7為表1中1-7號(hào)菌株，分別為左l_7(Mg2+濃度1.5yL)和右 1-7 (Mg2+濃度 1.75 μ L)。圖2為利用引物5-TCACGTCCAC-3，分別在Mg2+濃度為1.5和1.75 μ L的條件 下鑒定6株地衣芽孢桿菌與1株蠟狀芽孢桿菌獲得的DNA指紋圖譜，其中M代表DNA Ladder(BeyoRed)，1-7為表1中1-7號(hào)菌株，分別為左l_7(Mg2+濃度1.5yL)和右 1-7 (Mg2+濃度 1.75 μ L)。圖3為圖1和圖2中的Μ。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一，鑒定地衣芽孢桿菌BL63516菌株的專用RAPD引物、鑒定方法及鑒 定用基因序列中總DNA的提取，本實(shí)驗(yàn)所用菌株見表1。表 1
__菌種編號(hào)__菌種拉丁名
1BL63516Bacillus Iich eni form is
2BL20389Bacillus licheniformis (保藏號(hào) CMGCC NO. 0298)3CGMCC1. 0265Bacillus licheniformis
4CGMCC1. 0813Bacillus licheniformis
5CGMCC1. 0106Bacillus Iich eni form is
6CGMCC1. 91Bacillus Iich eni form is
7CGMCC1. 0807Bacillus licheniformis
將1-7號(hào)菌種接種于培養(yǎng)液(牛肉粉0.5%、蛋白胨1%、氯化鈉0.5%，其余用 水補(bǔ)齊，調(diào)pH至7.2)中，37°C，150r/min培養(yǎng)過夜，使用細(xì)菌DNA提取試劑盒(生工 生物工程(上海)有限公司SK1201)提取1-7號(hào)菌種的DNA。實(shí)施例二，鑒定地衣芽孢桿菌BL63516菌株的專用引物、鑒定方法及鑒定用基 因序列中專用引物的篩選，用50條RAPD引物對(duì)1-7號(hào)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物編號(hào)及 核苷酸序列如表2所示(由生工生物工程(上海)有限公司合成)表權(quán)利要求
1.一種鑒定地衣芽孢桿菌BL63516菌株的專用RAPD引物，其特征在于該引物的 核苷酸序列為 5-GAACCTGCGG-3 或 5-TCACGTCCAC-3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定地衣芽孢桿菌BL63516菌株的鑒定方法，其特 征在于以樣品總DNA為模板，利用引物的核苷酸序列為5-GAACCTGCGG-3或 5-TCACGTCCAC-3中任一種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根 據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物判定樣品是否為地衣芽孢桿菌BL63516 ；利用引物5_GAACCTGCGG_3 若在4500-6000bp位置產(chǎn)生一條特征條帶則判定為陽性；利用引物5-TCACGTCCAC-3 若在1460bp位置產(chǎn)生一條特征條帶則判定為陽性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒定地衣芽孢桿菌BL63516菌株的鑒定方法，其特征在 于所述 PCR 反應(yīng)體系為 25 μ L，由 2.5yL 的 lOXTaqBuffer(yL)、1.5-1.75 μ L 濃度 為 25mmol/L 的 MgCl2 溶液、0.5 μ L 濃度為 10mmol/L 的 dNTP、0.25 μ L 濃度為 5U/ μ L 的Taq DNA聚合酶、1 μ L濃度為0.5pmol/ μ L的隨機(jī)引物、1 μ L濃度為20_30ng/ μ L的 DNA模板和余量的無菌雙蒸水組成；PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性3min; 94°C變性45s、 36°C退火60s、72°C延伸2min，共40個(gè)循環(huán)；72°C修復(fù)延伸lOmin。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定地衣芽孢桿菌BL63516菌株的基因序列，其特征在于 利用引物的核苷酸序列5-TCACGTCCAC-3進(jìn)行擴(kuò)增，用于鑒定BL63516基因序列為TCACGTCCACTTACGACGGAATGGCGCTTGCGCAGGCAATCATCGAGTACGTTCA CGAGCACATCGGCGCGAAGACTTTATTTTCCACTCACTATCACGAGCTGACATCCCTT GAAGAAAAGCTTGCCGACTTGAAGAATGTTCACGTTCGTGCGGAAGAATACGAAGG AAAGGTCGTATGCCTTCACCAGATAAAAGAAGGCGCAGCAGATAAAAGCTACGGTAT CCATGTCGCGCAGCTTGCCGAATTGCCCGACGGTTTGATCAGCAGGGCGAAAACGAT TCTGAAAGAGCTTGAATCCGGCGCCAAAGAAGCGGTTCCATCAACGGCTCCGAATAC GGTAAAAGAGGCGGCGGAAGAAGTCGCGGCAACTGTTGCAGATCAACCGGCCCAGC TGTCATTTTTTGAAACGGACAAGCCGAAAGAAAAAGAGACGAAGCTCTCCAAAAAA GAGCAGGCTGTTTTAGCCGAATTTAAAACGATGGATCTGCTCGATATGACGCCTATAC AAGTCATGAATGAACTGTACAGGCTGCAAAAAAAATTAAAGTAATAAAGAGGTGACC CAACTTGGCAAAAATTGTTCAGCTGCCAGACGATTTATCGAATAAAATCGCGGCGGG TGAAGTAGTGGAAAGGCCTGCGTCGGTCGTCAAAGAGCTTGTCGAAAATGCAATCGA TGCGAACAGCTCCGTGATTGAAATCGATGTTGAAGAAGCGGGTCTCGCCTCGATTAA AGTGCTTGACGACGGCGAAGGGATGGATGCAGAAGACTGCAGAACGGCTTTTTTGCG TCATGCCACAAGCAAAATCAAAGACGAAAACGATCTGTTTCGCGTCAGAACGCTCGG ATTTCGCGGAGAAGCTTTGCCAAGTATCGCGTCTGTCTCACATCTAAGCATTAAAACG AGCACCGGAGAAGGAGCAGGCACCCATTTGACGCTTCAGGGGGGGAGAATCATTTCC GAGCAAAAAGCGTCAAGCCGCAGAGGAACCGAAATTACGGTTACCAATCTGTTTTTT AATACGCCGGCAAGGCTGAAATATATGAAAACGATCCATACGGAGCTTGGCAACATTA CAGATGTGGTCAACAGAATTGCCCTTGCCCACCCGGAAGTTTCGATCAGGCTGCGTC ATCAAGGGAAAACGCTTCTGCAGACAAACGGAAACGGCGATGTCCGCCACGTGCTT GCGGCGATTTACGGCACGGCGGTTGCCAAAAAAATGCTCCCGCTTGAAGCGAGATCT CTTGATTTTGAAGTGAAAGGCTATATCGCCCTTCCCGAAATTACGCGTGCATCGCGAAATTACATGTCATCTGTCGTCAACGGCAGATACATTAAAAATTTTCCGCTCGTGAAAGC GATCCACGAGGGCTACCATACGCTTCTTCCGATCGGCCGCCATCCGATCACGTTTATTG AAATCAACATGGACCCGCTGCTTGTGGACGTGA
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒定地衣芽孢桿菌BL63516菌株的專用RAPD引物，其特 征在于含引物的核苷酸序列為5-GAACCTGCGG-3或5-TCACGTCCAC-3的試劑盒。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒定地衣芽孢桿菌BL63516菌株的鑒定方法，其特征在于 利用鑒定地衣芽孢桿菌BL63516菌株的鑒定方法得到的鑒定地衣芽孢桿菌BL63516DNA 指紋圖譜。
全文摘要
一種應(yīng)用于生物技術(shù)領(lǐng)域中的鑒定地衣芽孢桿菌BL63516菌株的專用RAPD引物，該引物的核苷酸序列為5-GAACCTGCGG-3或5-TCACGTCCAC-3；鑒定地衣芽孢桿菌BL63516菌株的鑒定方法，以樣品總DNA為模板，利用引物的核苷酸序列為5-GAACCTGCGG-3或5-TCACGTCCAC-3中任一種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物判定樣品是否為地衣芽孢桿菌BL63516；利用引物5-GAACCTGCGG-3若在4500-6000bp位置產(chǎn)生一條特征條帶則判定為陽性；利用引物5-TCACGTCCAC-3若在1460bp位置產(chǎn)生一條特征條帶則判定為陽性鑒定地衣芽孢桿菌BL63516菌株的鑒定方法，利用引物的核苷酸序列5-TCACGTCCAC-3進(jìn)行擴(kuò)增。該發(fā)明多態(tài)性高、信息量大、操作簡單、直觀可靠、DNA用量少、純度要求不高、隨機(jī)引物沒有嚴(yán)格的種屬界限。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102010909SQ201010549709
公開日2011年4月13日 申請(qǐng)日期2010年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月18日
發(fā)明者李顯林, 李雪龍, 汲涌, 蘇顯英 申請(qǐng)人:東北制藥(沈陽)科技發(fā)展有限公司