專利名稱：一種厚殼貽貝抗菌肽及制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種厚殼貽貝抗菌肽，本發(fā)明還涉及該厚殼貽貝抗菌肽制備方法， 本發(fā)明還涉及該厚殼貽貝抗菌肽的用途。
背景技術(shù)：
中國(guó)是全球最大的水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，水產(chǎn)品總產(chǎn)量(捕撈+養(yǎng)殖)占全球35%， 其中水產(chǎn)品養(yǎng)殖產(chǎn)量約占全球的70%，2005年水產(chǎn)品產(chǎn)量達(dá)5181萬噸。其中海水產(chǎn)品 觀討萬噸，占總產(chǎn)量的55%，捕撈約1022萬噸，人工養(yǎng)殖產(chǎn)品約1888萬噸。隨著全球 對(duì)水產(chǎn)品的消費(fèi)逐年增加，國(guó)內(nèi)消費(fèi)增長(zhǎng)勢(shì)頭迅猛，另一方面全球海洋捕撈資源衰退， 供給逐步轉(zhuǎn)向以養(yǎng)殖水產(chǎn)品為主，中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)在全球消費(fèi)中越來越重要。人工養(yǎng)殖 比例逐年提高，1978年人工養(yǎng)殖比例占沈％，2005年人工養(yǎng)殖比例達(dá)61%。隨著水產(chǎn) 養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，由于高密度養(yǎng)殖、養(yǎng)殖水域富營(yíng)養(yǎng)化、生態(tài)環(huán)境惡化等原因使得水 產(chǎn)養(yǎng)殖品種頻頻發(fā)生各種疾病，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，已成為21世紀(jì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要制 約因素。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，目前危害水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的病害已達(dá)400 500種，大多數(shù)病害是 由病毒、細(xì)菌、真菌等微生物所引起的。而傳統(tǒng)的抗微生物藥物及飼料添加劑——抗生 素，由于耐藥性病原菌的形成，以及食品安全性等公共衛(wèi)生上問題的提出，目前在世界 各國(guó)養(yǎng)殖業(yè)中的使用都受到嚴(yán)格限制，如歐盟自2006年1月1日起，全面禁止食品動(dòng)物 使用抗生素促生長(zhǎng)飼料添加劑，因此尋找安全的抗生素替代物、開發(fā)安全高效的新型抗 微生物免疫增強(qiáng)劑或能增強(qiáng)養(yǎng)殖品種機(jī)體免疫力的飼料添加劑成為研究的熱點(diǎn)，也是我 國(guó)養(yǎng)殖業(yè)、飼料行業(yè)健康、持續(xù)發(fā)展首要解決的課題之一。
抗菌肽(antimicrobial peptides)作為先天免疫系統(tǒng)的重要部分對(duì)于保護(hù)生物機(jī)體具有不可或缺的作用。至今，已經(jīng)有超過800個(gè)抗菌肽被分離和鑒定。根據(jù)它們的氨基 酸組成和空間結(jié)構(gòu)可分為α-螺旋陽(yáng)離子線性抗菌肽、含二硫鍵的抗菌肽、富含某種氨 基酸殘基的抗菌肽和陰離子抗菌肽?？咕牡目咕钚跃哂羞x擇性高、殺菌快速、作用 廣譜和難以形成抗性的特點(diǎn)，使其成為研究和開發(fā)新型生物抗生素的理想候選。
貽貝抗菌肽是海洋生物抗菌肽研究中的一個(gè)重要內(nèi)容，其特殊的結(jié)構(gòu)與廣譜的 抗菌功能使其具有重要的理論研究?jī)r(jià)值，同時(shí)也具有開發(fā)成為新型生物抗生素的潛力。 近年來在海洋軟體動(dòng)物貽貝中發(fā)現(xiàn)了新的抗菌肽家族，該家族是由特定基因編碼的一類 具有廣譜抗菌活性的小分子多肽，根據(jù)貽貝抗菌肽家族一級(jí)結(jié)構(gòu)的不同可以將其分為4 組Defensins，Mytilins, Myticin和Mytimycin。由于抗菌肽天然產(chǎn)量低，合成抗菌肽的 價(jià)格又太昂貴，因此應(yīng)用基因工程技術(shù)對(duì)其進(jìn)行克隆與表達(dá)，將是研究和開發(fā)利用抗菌 肽的一條有效途徑。Mytidn是貽貝抗菌肽家族中的一類重要成員，目前已從不同種的貽 貝中分離純化到數(shù)種Myticin分子，被認(rèn)為是貽貝防御機(jī)制中最重要的一類抗菌肽分子。
厚殼貽貝(Mytilus corascus)是我國(guó)具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的養(yǎng)殖貽貝之一，對(duì)其抗 菌肽的研究目前尚不多見。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)上述的技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種厚殼貽貝抗菌 肽，該抗菌肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌及革蘭氏陰性菌具有顯著抑制作用，具有廣譜抗菌活性和 醫(yī)藥價(jià)值。
本發(fā)明所要解決的又一個(gè)技術(shù)問題是提供一種厚殼貽貝抗菌肽的制備方法。
本發(fā)明所要解決的又一個(gè)技術(shù)問題是提供一種厚殼貽貝抗菌肽的表達(dá)載體。
本發(fā)明所要解決的又一個(gè)技術(shù)問題是提供一種前述表達(dá)載體的重組工程菌。
本發(fā)明提供一種從厚殼貽貝血細(xì)胞克隆到的抗菌肽myticin的cDNA基因，該基 因所編碼的抗菌肽成熟肽分子由40個(gè)氨基酸組成，分子量為3893.7Da。我們利用厚殼貽 貝myticin的cDNA基因，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增其成熟肽區(qū)域的核苷酸序列并利用基因工 程的方法將其重組到表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化釀酒酵母，獲得充足的基因工程菌。對(duì)重組抗菌肽 myticin的體外抗菌實(shí)驗(yàn)表明，mytidn對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌及革蘭氏陰性菌均具有顯著的抑制 作用。鑒于貽貝抗菌肽具有廣譜的抗菌活性以及穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，因而在生物抗生素開發(fā)中 具有重要意義。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種厚殼貽貝抗菌肽，其特征 在于該抗菌肽的mytidn cDNA基因的開放閱讀框核苷酸序列如下
atgaaggcaa caatcttgtt agcggttgta gtggcagtct ttgtcgcagg tacggaagct 60
cattcgcatg cttgcgcatc gtactactgt agcaagttct gtgggactgc tagttgcaca 120
cattacttat gccgagtact tcatcccggg aaactttgcg tctgtgttaa ttgcagcagg 180
gtaaaaaatc ctttcagagc tactcaagat gctaaaagta ttaacgaatt ggattacact 240
ccactaatga agtcgatgga aaatttggac aacggaatgg atatgttata a2910
該抗菌肽的myticin cDNA基因的開放閱讀框的編碼蛋白質(zhì)前體包括
信號(hào)肽MKATILLAVVVAVFVAGTEA；
成熟肽HSHACASYYCSKFCGTASCT HYLCRVLHPG KLCVCVNCSR ；以及
成熟肽后區(qū)域VKNPFRATQDAKSINELDYT PLMKSMENLD NGMDML。
3、一種權(quán)利要求1所述的厚殼貽貝抗菌肽的制備方法，其特征在于包括如下步 驟
cDNA基因的克隆用TRIzol試劑盒從厚殼貽貝血細(xì)胞中提取總RNA，用 MMLV反轉(zhuǎn)錄為cDNA的第一鏈；根據(jù)厚殼貽貝的myticin的氨基酸序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn) 并引物，經(jīng)擴(kuò)增后得到厚殼貽貝抗菌肽myticin的cDNA編碼框；
序列分析和比對(duì)獲得的序列數(shù)據(jù)經(jīng)lasergen軟件中的Editseq模塊進(jìn)行分析， 進(jìn)行載體序列去除，序列拼接以及ORF分析后進(jìn)行在線BLAST搜索。
本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容如下
一、厚殼貽貝抗菌肽myticin的cDNA基因克隆及序列分析
采用TRIZOLReiigent提取厚殼貽貝血細(xì)胞總RNA，并以1.2 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn) 行鑒定，同時(shí)測(cè)定OD260和OD280值，分析所提RNA的濃度和純度。根據(jù)Invitrogen 公司FastTrack 2.0 Kt試劑盒操作手冊(cè)，通過poly (T)纖維素柱進(jìn)行親和層析，從厚殼 貽貝血細(xì)胞總RNA中得poly A+mRNA。用MMLV反轉(zhuǎn)錄為cDNA的第一鏈；根據(jù)不同 種類貽貝的myticin的氨基酸序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到厚殼貽貝抗菌肽myticin的cDNA成熟肽編碼框；
獲得的序列數(shù)據(jù)經(jīng)lasergen7.0軟件中的Editseq模塊進(jìn)行分析，進(jìn)行載體序列去 除，序列拼接以及ORF分析后進(jìn)行在線BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)搜索。
二、重組厚殼貽貝抗菌肽myticin基因的釀酒酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及在釀酒酵母 中的表達(dá)
1、表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
根據(jù)myticin的cDNA基因成熟肽序列(120bp)兩端序列設(shè)計(jì)正反向引物。正向 引物在5’端分別加入兩個(gè)保護(hù)堿基CG和酶切位點(diǎn)TCTAGA(Xba I )；其后加一個(gè)T 防止ORF移位；接著加密碼子AAGAGA，其編碼的KR兩個(gè)氨基酸，以便酵母本身分泌 的前體加工酶Kex2能把后面的成熟肽切割，并將表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中；反向引物在 5，端分別加入三個(gè)保護(hù)堿基CCG和酶切位點(diǎn)AAGCTT (Hind III) ； ρVT-I和pVT_2為 測(cè)序引物。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，之后，取2yL PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
將PCR純化產(chǎn)物和表達(dá)載體pVT102U/ α用Xba I和Hind III雙酶切，酶切產(chǎn)物分別用PCR產(chǎn)物純化試劑盒和小量質(zhì)粒提取試劑盒純化。之后，將兩者混合并加入 T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，16°C過夜。次日取10 μ L連接液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于AMP+的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒 定，陽(yáng)性克隆送上海美季生物公司測(cè)序鑒定，測(cè)序引物為正向引物pVT-Ι和反向引物 pVT-2。經(jīng)測(cè)序表明克隆序列正確，表達(dá)載體質(zhì)粒于_70°C保存于含30%甘油的LB液體 培養(yǎng)基中。
2、表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化以及重組釀酒酵母的發(fā)酵
利用LiAC轉(zhuǎn)化法將表達(dá)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細(xì)胞S78中，細(xì)胞懸浮液 涂YSD板，30°C培養(yǎng)4-6天；挑取YSD板上菌斑于YSD溶液(50mL)中擴(kuò)大培養(yǎng)24h ； 最后以 1 25 的比例轉(zhuǎn)入 ILYPD (Peptone 20g/L，Yeast extract lOg/L, Glucose 20g/L, 121°C滅菌15min)溶液中，30°C，250轉(zhuǎn)/η ι擴(kuò)大培養(yǎng)3_4天。
3、表達(dá)產(chǎn)物的分離純化
發(fā)酵液經(jīng)離心及過濾后上樣陽(yáng)離子交換高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行第一步分 離。采用半制備型Waters 600型HPLC、美國(guó)GE公司的HiprepTM16/10 CM FF預(yù)裝柱 進(jìn)行分離。Waters M87檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為^Onm。流動(dòng)相為四相洗脫系統(tǒng)，流速 為2mL/mte。洗脫液分別為A相為0.1M醋酸，B相為0.1M醋酸鈉溶液，C相IM氯化 鈉溶液，D相為去離子水。以50分鐘內(nèi)D液比例從0%到50%的線性梯度洗脫。
第二步為反相HPLC分離，采用半制備型Waters 600型HPLC、分析型Vydac C18RP-HPLC 反相柱 Q18TP54，4.6X250mm), Waters 2487 檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為 ^Onm。流動(dòng)相為含0.1% TFA的水(A)和乙腈(B)，洗脫速度為lmL/η ι，柱溫為 40 V。40分鐘內(nèi)B液比例從5 %到60 %線性梯度洗脫。
通過Tris-Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的分子量范圍。
4、重組厚殼貽貝myticin的抗菌活性檢測(cè)
采用培養(yǎng)基倍比稀釋法測(cè)定厚殼貽貝抗菌肽myticin抗菌活性。細(xì)菌用LB液體 培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(A630nm為0.001)，在96孔板每個(gè)孔加入90 μ L菌液。多肽5預(yù)先用PBS溶解，最高濃度為ImM，然后倍比稀釋，最低濃度為25μΜ。并將各濃度 多肽溶液加入96孔板中，10 μ L/孔，PBS作為陰性對(duì)照。
將96孔板在振蕩器上輕柔的振蕩使樣品和菌液充分混合，然后放入37°C培養(yǎng) 16-24h。采用酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)孔的OD值以衡量多肽對(duì)于細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用。多肽的 最低抑制濃度(Mteimal inhibitory concentrations，MIC)用[a]_[b]表示，其中[a]代表細(xì)菌繼續(xù)生長(zhǎng)的最大濃度，而[b]代表細(xì)菌完全被殺滅的最低濃度?？拐婢囼?yàn)與上述基本相 同，只是真菌在Sabourand液體培養(yǎng)基中30 V培養(yǎng)4 后檢測(cè)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的抗菌肽及其多核苷酸序列具有下列用途
1).作為飼料添加劑可替代傳統(tǒng)飼料中的某些抗生素，用于海水養(yǎng)殖業(yè)，實(shí)現(xiàn)綠 色養(yǎng)殖，減少乃至消除抗生素在水產(chǎn)品中的蓄積，提高水產(chǎn)品質(zhì)量。
2).可作為新型生物抗生素，用于細(xì)菌性疾病的治療或預(yù)防。
3).將序列<400>1或其互補(bǔ)的多核苷酸(包括DNA和RNA)，或其片段，進(jìn)行 標(biāo)記后，可以通過southern印跡，northern印跡，基因芯片，微陣列技術(shù)等，用于檢測(cè)動(dòng) 物中該抗菌肽基因或片段的存在，或檢測(cè)抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄情況。
4).根據(jù)序列<400>1或其互補(bǔ)的多核苷酸(包括DNA和RNA)設(shè)計(jì)引物，可通 過熒光定量PCR檢測(cè)在動(dòng)物體內(nèi)各組織以及動(dòng)物發(fā)育過程中，該抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄分布 特異性。


圖1為厚殼貽貝myticin的cDNA基因PCR擴(kuò)增圖(M為DNA Marker)。
圖2為重組表達(dá)質(zhì)粒菌落PCR鑒定(M為DNA Marker)。
圖3為重組厚殼貽貝myticin經(jīng)陽(yáng)離子交換層析分離后的圖譜(*號(hào)標(biāo)注為目的 峰)。
圖4為重組厚殼貽貝myticin經(jīng)陽(yáng)離子交換層析分離后，目的峰進(jìn)一步經(jīng)C18反 相高效液相層析分離的圖譜(*號(hào)標(biāo)注為重組myticin的洗脫峰)。
圖5為重組厚殼貽貝myticin經(jīng)分離純化后，tricin-SDS_PAGE電泳檢測(cè)圖譜。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
實(shí)施例一厚殼貽貝抗菌肽mytidn的cDNA基因克隆
采用TRIZOLReiigent提取厚殼貽貝血細(xì)胞總RNA，并以1.2 %瓊脂糖凝膠電泳進(jìn) 行鑒定，同時(shí)測(cè)定OD26t^nOD28tl值，分析所提RNA的濃度和純度。根據(jù)Iiwitrogen公 司FaStTraCk 2.0]iit試劑盒操作手冊(cè)，通過poly(T)纖維素柱進(jìn)行親和層析，從厚殼貽貝 血細(xì)胞總RNA中得poly A+mRNA。用MMLV反轉(zhuǎn)錄為cDNA的第一鏈；
根據(jù)從NCBI中搜索到的地中海貽貝(M.galloprovincialis) myticin的基因序列 (GenBank登錄號(hào)AF1623!35和AF1623;34)中的保守區(qū)域設(shè)計(jì)上游引物(myticin2F 5’ -CAAACGTACAACATGAAGG-3 ‘)，下游引物為載體特異性引物(T7 5’ -TAATACGACTCACTATAGGG-3‘)，以厚殼貽貝血細(xì)胞cDNA的第一鏈為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，體系如下IOXEasy Taq Buffer 5μ1; IOmMdNTPlyl; 10 μ M SP6 1 μ 1 ；10 μ MmytilinR 1 μ 1 ； 5U/μ 1 DNA Polymerase 0.5 μ 1 ；模板3 μ 1 ；用水補(bǔ)足 50 μ 1。反應(yīng)條件如下94°C 預(yù)變性 3min; PCR 設(shè)；35 個(gè)循環(huán)94 °C，30s ； 54°C, 30s ； 72 °C， Imin。最后 72°C 延伸 7η ι。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的片段用膠回收試劑盒純化后，與 PMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化E.C0liDH5ci感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，利用引物對(duì) SP6/mytilinR進(jìn)行菌落PCR鑒定后，送上海英駿生物公司測(cè)序。
測(cè)序結(jié)果經(jīng)去除載體序列和引物序列后，利用Lasergene v7.1軟件中的EditSeq 模塊進(jìn)行開放閱讀框(open reading frame, ORF)分析；信號(hào)肽用^gnalP 3.0在線軟件 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行預(yù)測(cè)；成熟肽分子量及等電點(diǎn)利用在線軟 件(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)進(jìn)行計(jì)算；序列在線 BLAST 同源檢索在 NCBI 中進(jìn)行(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)；序列比對(duì)分析采用 MEGA4.0 軟件 中Clustal W模塊進(jìn)行。
實(shí)施例二 厚殼貽貝抗菌肽mytidn的真核表達(dá)載體的構(gòu)建
根據(jù)mytilin-1，2，3 禾Π myticin-3, 5 的 cDNA 基因成熟肽序列(mytilin 為 102bp, myticin為120bp)兩端序列設(shè)計(jì)正反向引物。正向引物在5’端分別加入兩個(gè)保 護(hù)堿基CG和酶切位點(diǎn)TCTAGA (Xba I )；其后加一個(gè)T防止ORF移位；接著加密碼子 AAGAGA,其編碼的KR兩個(gè)氨基酸，以便酵母本身分泌的前體加工酶Kex2能把后面的 成熟肽切割，并將表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中；反向引物在5’端分別加入三個(gè)保護(hù)堿基 CCG和酶切位點(diǎn)AAGCTTCffind III) ； pVT_l和pVT_2為測(cè)序引物。所有引物由上海美 季生物公司合成，相關(guān)引物如下
Myticin-F CGTCTAGATAAGAGACATTCGCATGCTTGCACA
Myticin-R CCGAAGCTTCTTGCTGCAATTAACACA
ρ VT-I GC AAGGTAG AC AAGC
pVT-2 CTGCACAATATTTCAAGC
PCR擴(kuò)增50 μ L 反應(yīng)體系。94°C預(yù)變性 3min ； 94°C變性 30s ； 54°C退火 30s ； 72°C延伸2min(35個(gè)循環(huán))；72°C延伸ΙΟη ι。PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純 化，之后，取2yLPCR純化產(chǎn)物進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。鑒定圖譜見圖1， 由圖1可見，目的條帶的分子量約為150bp左右，與預(yù)期分子量相符。
將PCR純化產(chǎn)物和表達(dá)載體pVT102U/ α用Xba I和Hind III雙酶切，酶切 體系如下IOX 酶切緩沖液 2yL， Xba IluL, Hind III 2 μ L, PCR 產(chǎn)物 7.5yL， ddH207.5uL, 37°C過夜。酶切產(chǎn)物分別用PCR產(chǎn)物純化試劑盒和小量質(zhì)粒提取試劑盒純 化。之后，將兩者混合并加入T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，16°C過夜。次日取IOyL連 接液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于AMP+的LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)，挑 取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，圖2顯示了重組表達(dá)質(zhì)粒菌落PCR后的電泳檢測(cè)圖譜，目 的條帶分子量約為150bp，與預(yù)期分子量相符，說明目的基因已成功的插入表達(dá)載體。陽(yáng) 性克隆送上海美季生物公司測(cè)序鑒定，測(cè)序引物為正向引物pVT-Ι和反向引物pVT-2。 經(jīng)測(cè)序表明克隆序列正確，表達(dá)載體質(zhì)粒于_70°C保存于含30%甘油的LB液體培養(yǎng)基 中。
實(shí)施例三表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化以及重組釀酒酵母的發(fā)酵
利用LiAC轉(zhuǎn)化法將表達(dá)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細(xì)胞S78中，細(xì)胞懸浮 液涂 YSD(YNB 6.7g/L、Glucose 20g/L、Leucine 20Omg/L、Adenine 5Omg/L、Inositol 200mg/L和Agar 20g/L, 121°C滅菌15min)板，30°C培養(yǎng)4-6天；挑取YSD板上菌斑于 YSD溶液(50mL)中擴(kuò)大培養(yǎng)24h ；最后以1 25的比例轉(zhuǎn)入ILYPD (Peptone 20g/L, Yeast extract lOg/L, Glucose 20g/L，121°C滅菌 15min)溶液中，30°C，250 轉(zhuǎn)/min 擴(kuò)大 培養(yǎng)3-4天。
實(shí)施例4 表達(dá)產(chǎn)物的分離純化
發(fā)酵液經(jīng)離心及過濾后上樣陽(yáng)離子交換高效液相色譜(HPLC)進(jìn)行第一步分 離。采用半制備型Waters 600型HPLC、美國(guó)GE公司的HiprepTM16/10 CM FF預(yù)裝柱 進(jìn)行分離。Waters M87檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。流動(dòng)相為四相洗脫系統(tǒng)，流 速為2mL/mte。洗脫液分別為A相為0.1M醋酸，B相為0.1M醋酸鈉溶液，C相IM氯 化鈉溶液，D相為去離子水。以50分鐘內(nèi)D液比例從0%到50%的線性梯度洗脫。圖 3展示了發(fā)酵液經(jīng)陽(yáng)離子交換素樸分離后的洗脫圖譜，各洗脫峰經(jīng)電泳檢測(cè)后初步確定三 號(hào)峰(*號(hào)標(biāo)注)含有重組蛋白，收集該目的峰上樣反相高效液相色譜法進(jìn)行進(jìn)一步分離 純化。
第二步為反相HPLC分離，采用半制備型Waters 600型HPLC、分析型Vydac C18RP-HPLC 反相柱 Q18TP54，4.6X250mm), Waters 2487 檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為 ^Onm。流動(dòng)相為含0.1% TFA的水(A)和乙腈(B)，洗脫速度為lmL/η ι，柱溫為 40°C。40分鐘內(nèi)B液比例從5%到60%線性梯度洗脫。圖4展示了發(fā)酵液經(jīng)陽(yáng)離子交 換層析后的目的峰經(jīng)反相高效液相色譜分離后的洗脫曲線，其中重組蛋白所在目的峰以* 號(hào)標(biāo)注，收集該目的峰進(jìn)行Tris-Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)以確定其分子量范圍。
通過Tris-Tricine-SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的分子量范圍。由圖5可見， 經(jīng)兩部層析分離后，目的峰在電泳檢測(cè)中為單一條帶(箭頭所指條帶)，其分子量約為 4kDa左右，與預(yù)期分子量相符，且抑菌活性測(cè)試表明，該產(chǎn)物具有與天然mytidn類似的 抑菌活性，由此可以確認(rèn)厚殼貽貝抗菌肽mytidn的重組表達(dá)獲得成功，表達(dá)出來的重組 myticin與天然myticin相比具有一致的一級(jí)結(jié)構(gòu)和抑菌功能。
實(shí)施例五重組厚殼貽貝mytidn的抗菌活性檢測(cè)
采用培養(yǎng)基倍比稀釋法測(cè)定厚殼貽貝抗菌肽myticin抗菌活性。細(xì)菌用LB液體 培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(A63tlnm為0.001)，在96孔板每個(gè)孔加入90 μ L菌液。多肽預(yù) 先用PBS溶解，最高濃度為500 μ Μ，然后倍比稀釋，最低濃度為1.25 μ Μ。并將各濃 度多肽溶液加入96孔板中，10 μ L/孔，PBS作為陰性對(duì)照。
將96孔板在振蕩器上輕柔的振蕩使樣品和菌液充分混合，然后放入37°C培養(yǎng) 16-24h。采用酶標(biāo)儀測(cè)定每個(gè)孔的OD值以衡量多肽對(duì)于細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用。多肽的 最低抑制濃度(Mteimal inhibitory concentrations，MIC)用[a]_[b]表示，其中[a]代表細(xì)菌 繼續(xù)生長(zhǎng)的最大濃度，而[b]代表細(xì)菌完全被殺滅的最低濃度。抗真菌試驗(yàn)與上述基本相 同，只是真菌在Sabourand液體培養(yǎng)基中30 V培養(yǎng)4 后檢測(cè)。
重組myticin的抗菌活性如下表所示
菌種名稱myticin ( μ Μ)
革蘭氏陰性菌8
大腸桿菌Escherichia coli12-25
副溶血弧菌 VibrioParahaemolyticus 12-25
綠]]農(nóng)桿菌 Pseudomonas aeruginosa 12-25
普通變形桿菌 Proteus vulgaris 25-50
哈維氏弧菌Vibrio.harveyi25-50
溶藻弧菌Vibrio alginolyticus 25-50
革蘭氏陽(yáng)性菌
枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 2.5-5.0
金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 2.5-5.0
蘇云金芽孢桿菌 Bacillus thuringiensis 6.5—12.5
藤黃疊球菌 Sarcina Iuteus12-25
巨大芽孢桿菌 Bacillus megaterium 6.5-12.5
真菌
白假絲酵母Candida albicans 25-50
白色念珠菌 Monilia albican25-50
權(quán)利要求
1.一種厚殼貽貝抗菌肽，其特征在于該抗菌肽的myticin cDNA基因的開放閱讀框核 苷酸序列如下atgaaggcaa caatcttgtt agcggttgta gtggcagtct ttgtcgcagg tacggaagct 60 cattcgcatg cttgcgcatc gtactactgt agcaagttct gtgggactgc tagttgcaca 120 cattacttat gccgagtact tcatcccggg aaactttgcg tctgtgttaa ttgcagcagg 180 gtaaaaaatc ctttcagagc tactcaagat gctaaaagta ttaacgaatt ggattacact 240 ccactaatga agtcgatgga aaatttggac aacggaatgg atatgttata a2910
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的厚殼貽貝抗菌肽，其特征在于該抗菌肽的myticincDNA基 因的開放閱讀框的編碼蛋白質(zhì)前體包括信號(hào)肽MKATILLAVVVAVFVAGTEA ;成熟肽HSHACASYYC SKFCGTASCT HYLCRVLHPG KLCVCVNCSR ；以及 成熟肽后區(qū)域VKNPFRATQDAKSINELDYTPLMKSMENLD NGMDML。
3.一種權(quán)利要求1所述的厚殼貽貝抗菌肽的制備方法，其特征在于包括如下步驟 cDNA基因的克隆用TRIzol試劑盒從厚殼貽貝血細(xì)胞中提取總RNA，用MMLV反轉(zhuǎn)錄為cDNA的第一鏈；根據(jù)厚殼貽貝的myticin的氨基酸序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物， 經(jīng)擴(kuò)增后得到厚殼貽貝抗菌肽myticin的cDNA編碼框；序列分析和比對(duì)獲得的序列數(shù)據(jù)經(jīng)Iasergen軟件中的Editseq模塊進(jìn)行分析，進(jìn)行 載體序列去除，序列拼接以及ORF分析后進(jìn)行在線BLAST搜索。
4.一種表達(dá)載體，其特征在于它含有權(quán)利要求1所述的核苷酸。
5.一種重組工程菌，其特征在于它含有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組工程菌，其特征在于它的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母得到的。
7.權(quán)利要求1所述的厚殼貽貝抗菌肽在制備抗生素中的應(yīng)用。
全文摘要
一種厚殼貽貝抗菌肽，該抗菌肽的名稱為myticin，其編碼的cDNA基因的開放閱讀框具有特殊的核苷酸序列，本發(fā)明還公開了厚殼貽貝抗菌肽的制備方法和真核表達(dá)載體及在制備抗生素中的應(yīng)用。本發(fā)明的抗菌肽可以作為飼料添加劑可替代傳統(tǒng)飼料中的某些抗生素，可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，實(shí)現(xiàn)綠色養(yǎng)殖，減少乃至消除抗生素在水產(chǎn)品中的蓄積，提高水產(chǎn)品質(zhì)量，也可以作為新型生物抗生素，用于細(xì)菌性疾病的治療或預(yù)防。
文檔編號(hào)C12R1/865GK102020709SQ20101053518
公開日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2010年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月1日
發(fā)明者廖智, 武梅, 王健鑫, 王日昕, 石戈, 范美華 申請(qǐng)人:浙江海洋學(xué)院