專利名稱：一種克隆水稻抗稻瘟病基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種克隆水稻抗稻瘟病基因的方法。
背景技術(shù)：
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米為主要食 物。稻瘟病是水稻最主要的病害之一，全球每年因稻瘟病造成的水稻減產(chǎn)達11% 30%， 嚴重時減產(chǎn)達40% 50%，甚至顆粒無收。實踐證明，利用抗病水稻品種是應(yīng)對稻瘟病危害的有效辦法之一。到目前為止， 在水稻中定位的抗稻瘟病基因有近百個，已經(jīng)克隆的有14個，它們分別是Pib，Pita, Pi9， Pid2, Pizt, Pi2, Pi36, Pi37, Pi-km, Pi5, Pid3, Pbl, Pit, Pi_kh，其中除了基因 Pid2 編碼 一個絲蘇氨酸受體類似激酶外，其他13個抗稻瘟病基因全都屬于Nucleotide Binding Site-Leucine Rich Repeat (NBS-LRR)基因家族。NBS-LRR基因由N端保守的核苷酸結(jié)合位 點(NBS)和C端富亮氨酸重復(fù)(LRR)區(qū)域構(gòu)成，在LRR區(qū)域，由數(shù)十個(一般15 40個) 不完全的LRR結(jié)構(gòu)構(gòu)成。盡管目前已經(jīng)克隆了 14個抗稻瘟病基因，但由于稻瘟病菌小種眾 多而且變異速度快，為了更好應(yīng)對稻瘟病的危害，克隆更多的抗稻瘟病基因就顯得尤為重 要。目前，對抗稻瘟病基因的克隆還是主要依靠圖位克隆，雖然秈稻9311和粳稻日本 晴都有了全基因組序列，為水稻基因的圖位克隆帶來了巨大方便，但對于抗稻瘟病基因的 克隆來說，依然還存在很多困難。比如對精細定位群體內(nèi)各單株的抗稻瘟病鑒定，不僅工作 量巨大，而且在田間稻瘟病發(fā)病情況還很容易受環(huán)境影響，造成性狀統(tǒng)計錯誤，而不能準確 定位；另外，從已經(jīng)測序的9311和日本晴基因組序列來看，NBS-LRR基因大多都是成簇存 在，即使能夠?qū)⒛繕嘶蚨ㄎ坏侥骋粎^(qū)段，也很難判斷成簇基因中的那一個才是真正的抗 病基因；再者，目前利用的水稻品種遺傳背景狹窄，可利用的抗稻瘟病基因不多，而在野生 稻中卻蘊含著豐富的抗稻瘟病基因，然而，由于對野生稻的研究目前還在起步階段，沒有精 細的遺傳圖譜和物理圖譜，要利用圖位克隆其中抗稻瘟病基因顯然更是困難重重?；趯δ壳耙呀?jīng)克隆的抗稻瘟病基因信息分析，14個基因中有13個屬于NBS-LRR 類基因家族，有理由相信，水稻中抗稻瘟病基因絕大多數(shù)應(yīng)該是屬于NBS-LRR基因家族。 目前，一般認為是變異較大的LRR結(jié)構(gòu)域決定了此類抗病基因?qū)Σ≡R別的?；?，而 NBS-LRR類基因在植物基因組中又是廣泛存在，在已經(jīng)測序的水稻和擬南芥中，NBS-LRR基 因均占了所有編碼基因數(shù)目以上。在水稻與稻瘟病菌協(xié)同進化過程中，眾多的NBS-LRR 基因的存在為水稻抗稻瘟病基因根據(jù)病菌小種變化而通過復(fù)制，重組等方式產(chǎn)生新的抗病 基因提供了便利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種克隆抗稻瘟病基因的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟
1)根據(jù)已知的抗稻瘟病基因設(shè)計引物，得到引物對；2)以對稻瘟病菌高抗水稻基因組DNA為模板，用步驟1)得到的引物對進行PCR擴 增，得到PCR擴增產(chǎn)物；3)將步驟2)得到的PCR擴增產(chǎn)物進行測序，得到抗稻瘟病基因；4)將抗稻瘟病基因轉(zhuǎn)入易感稻瘟病水稻，得到轉(zhuǎn)基因水稻，對轉(zhuǎn)基因水稻進行稻 瘟病的抗譜測定，得到具有新抗譜的抗稻瘟病基因，即為目的抗稻瘟病基因。步驟1)中，所述已知的抗稻瘟病基因為序列表中序列5所示；所述引物對中的一 條引物為序列表中序列3所示，另一條引物為序列表中序列4所示。步驟2)中，所述稻瘟病菌高抗水稻為多年生普通野生稻(Oryza rufipogon)，命 名為多年生普通野生稻(Oryza rufipogon) 38，其IRGC國際編號為100920 ；步驟4)中，所述易感稻瘟病水稻的品種為TP309。步驟1)中，所述引物對中的一條引物為序列表中序列3所示，另一條引物為序列 表中序列4所示；步驟4)中，所述抗譜測定的方法為將稻瘟病病原菌(Magnaporthe grisea)接種 到轉(zhuǎn)基因水稻中，得到接菌后轉(zhuǎn)基因水稻，一周后觀察，未出現(xiàn)病斑的轉(zhuǎn)基因水稻中的抗稻 瘟病基因為目的抗稻瘟病基因；所述接種的方法為將稻瘟病病原菌(Magnaporthe grisea)懸浮液注射到轉(zhuǎn)入抗 稻瘟病基因的易感稻瘟病水稻的莖桿基部；所述接種的量為直至懸浮液從水稻莖桿頂部溢出；所述稻瘟病病原菌(Magnaporthe grisea)懸浮液按照如下方法制備將稻瘟病 病原菌(Magnaporthe grisea)孢子用水稀釋，得到稻癌病病原菌(Magnaporthe grisea) 懸浮液，所述稻瘟病病原菌(Magnaporthe grisea)孢子在稻瘟病病原菌(Magnaporthe grisea)懸浮液中的濃度為5 X IO4孢子/毫升；所述稻瘟病病原菌(Magnaporthe grisea)的小種為如下至少一種ZB15、CH43、 Sichuan36、JS2001-108、Sichuan26、CH706、CH45、CH704、Zhongl0-8-14、ZK-10-2、91-65-l、 97-3-1、97-27-2、99-20-2、99-26-1和 99-26-2。本發(fā)明的另一個目的是提供一種水稻抗稻瘟病蛋白及其編碼基因。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，命名為Pid3_38，來源于普通野生稻(Oryza rufipogon) 38, 是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添 加且與植物抗稻瘟病相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。上述序列2由924個氨基酸殘基組成。所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。所述蛋白質(zhì)的編碼基因也是本發(fā)明保護的范圍。所述編碼基因為如下1)或2)或3)所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼所述與植物抗稻瘟病相關(guān)蛋白 質(zhì)的DNA分子；
3)與1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少 具有99%同源性且編碼所述與植物抗稻瘟病相關(guān)蛋白質(zhì)的DNA分子。所述嚴格條件也可為在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65 °C下雜交，然后用 2XSSC,0. 1% SDS和1XSSC，0. 1% SDS各洗膜一次。序列表中的序列1，由2775個核苷酸 組成，編碼區(qū)為序列1的自5’末端的第1-2775位核苷酸。含有所述編碼基因的重組表達載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或表達盒也是本發(fā)明 保護的范圍。所述重組表達載體為將所述的編碼基因插入載體PZHOl的Xbal與Sail酶切 位點之間得到的重組表達載體。擴增所述的編碼基因全長或任一片段的引物對也是本發(fā)明保護的范圍，所述引物 對如下所示一條引物序列如序列表中序列3所示，另一條引物序列如序列表中序列4所
7J\ ο本發(fā)明的第三個目的是提供一種培育抗稻瘟病轉(zhuǎn)基因植物方法，。本發(fā)明提供的方法是將所述的編碼基因?qū)肽康闹参铮@得抗稻瘟病的轉(zhuǎn)基因植 物。所述稻瘟病由下述稻瘟病的病原菌(Magnaporthe grisea)小種中的至少一種引 起Sichuan36、ZhonglO-8-14、ZK-10-2或97-27-2 ；所述目的植物為雙子葉植物或者單子 葉植物，優(yōu)選為單子葉植物。所述目的植物為雙子葉植物或者單子葉植物，優(yōu)選為單子葉植物。所述單子葉植物為水稻。所述蛋白質(zhì)、所述的編碼基因、所述的表達載體或所述的方法在篩選抗稻瘟病基 因中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明的技術(shù)方案能產(chǎn)生以下技術(shù)效果1.本發(fā)明利用已克隆的抗稻瘟病基因序列信息，直接分離其在野生稻或是高抗水 稻品種中的同源基因，直接轉(zhuǎn)化易感稻瘟病水稻品種，，獲得抗稻瘟病的水稻，對轉(zhuǎn)基因植 株進行抗譜測定，篩選出具有新抗譜的抗稻瘟病基因，從而能快速的鑒定出可能具有更好 抗稻瘟病性的同源基因，克服了傳統(tǒng)圖位克隆的過程繁瑣，費時費力等缺點。2.水稻中NBS-LRR類基因眾多，可以大規(guī)模的利用已經(jīng)克隆的基因序列信息來獲 得其他同源基因，通過不同同源基因間的組合，有利于對水稻品種進行整體改良。


圖1為PCR擴增Pid3_38基因電泳2為Pid3_38構(gòu)建到表達載體上示意3為潮霉素和Pid3_38基因CAPS標記檢測4為Pid3_38基因在水稻品種TP309中過表達植株以及對照植株的表達分析圖5為Pid3_38基因在水稻品種TP309中過表達植株以及對照植株的表型
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、Pid3_38的獲得1.設(shè)計引物抗稻瘟病基因Pdi3是從水稻品種地谷中克隆得到的，它對粳稻區(qū)稻瘟病菌小種 具有較好的抗性，其中用來定位克隆的鑒別小種為粳稻區(qū)稻瘟病菌小種zhong-10-8-14。從 NCBI (http //www. ncbi. nlm. nih. gov)上獲得地谷中抗稻瘟病基因Pid3全基因序列，Pid3 基因全長2775bp (序列5)。設(shè)計引物如下d 3 F 5 ‘ _atggcggagggtgttgtgggctc_3 ‘ 禾口 d3R: 5 ‘ -ttattgaatcctttctgcagcc-3‘ 0為了便于后續(xù)試驗將所擴增基因連入表達載體，特在上下游引物中分別加入含有 保護堿基的Xbal和Sail酶切位點，故所用來擴增引物為Pid3F 5' -TTTCTAGAatggcggagggtgttgtgggctc-3‘ (Xbal)(序列 3)；Pid3R 5' -CTGTCGACttattgaatcctttctgcagcc-3‘ (Sail)(序列 4);2、Pid3_38 的獲得提取普通野生稻(Oryza rufipogon) 38 (唐小敏.，幾個重復(fù)序列在稻屬AA染 色體組稻種中的分布及其與稻種分化關(guān)系的研究.中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究 所.2005，博士學位論文，公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所獲得。)葉片基因 組DNA作為模板，用引物Pid3F和Pid3R擴增，擴增反應(yīng)混合物如下
ddH2015. 1 μ 110 X PCR緩沖液2. 5μ 1dNTP Mixture(2. 5mM)2. 5μ 1KOD 酶(5U/ μ 1)0. 2μ 1引物(IOmM)0. 25 μ 1引物(IOmM)0. 25 μ 1模板(DNA)1 μ 1MgS04(25mM)1. 6μ 1DMSO1. 6μ 1Total25 μ 1
PCR反應(yīng)條件先94°C預(yù)變性4min ；然后94°C變性30S ；58°C退火30S ；68°C延伸 3min，共30個循環(huán)；最后68°C延伸5分鐘。對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明獲得約2800bp左右的條帶 (圖1)。切下該目的條帶，純化回收后將PCR產(chǎn)物連接到peasy-TBlimt載體(購自全式金 公司)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，得到轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，送去測序，結(jié)果為該質(zhì)粒中含 有該PCR產(chǎn)物，該PCR產(chǎn)物具有序列表中的序列1，序列表中的序列1由2775個核苷酸組 成，該PCR產(chǎn)物的基因命名為Pid3-38，其編碼區(qū)為序列表中序列1自5’末端第1-2775位 核苷酸，編碼的蛋白命名為Pid3-38，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2，序列2由 924個氨基酸殘基組成。實施例2、轉(zhuǎn)Pid3_38水稻及其功能研究一、轉(zhuǎn) Pid3-38 水稻將實施例1得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過Xbal與Sail酶切，得到的片段與經(jīng)過同樣酶切 植物雙元表達載體 PZHOl (Xiao, H.，Wang, Y.，Liu, D.，Wang, W. , Li, X. , Zhao, X.，Xu, J.， Zhai, W. and Zhu, L(2003)Functional analysis of the rice AP3 homologue 0sMADS16 by RNA interference. Plant Mol. Biol. 52，957-966.，公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育生 物學研究所獲得。)的載體片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，得到轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子 提取質(zhì)粒，送去測序，結(jié)果為該質(zhì)粒為將序列表中序列1的自5’末端第1-2775位核苷酸插 入到PZH01的Xbal與Sail酶切位點間得到的載體，將該質(zhì)粒命名為PZH01_38pid3，該質(zhì)粒 即為重組表達載體，構(gòu)建圖譜如圖2所示。將PZH01-38pid3轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404中(Chen，X.，J. Shang，D. Chen,C. Lei, Y. Zou et al.,2006 A B-Iectin receptor kinase gene conferring rice blast resistance. Plant J. 46:794-804.，公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所獲得。)，得到轉(zhuǎn) 化子，提取質(zhì)粒送去測序，結(jié)果該質(zhì)粒為PZH01-38pid3，將含有該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子命名為 A-PZHOl-38pid3。將A-PZHO l-38pid3 轉(zhuǎn)入品種為 TP309 的水稻(Junjun Shang.，et al. Identification of a New Rice Blast Resistance Gene, Pid3, by Genomewide Comparison of Paired Nucleotide-Binding Site-Leucine-RichRepeat Genes and Their Pseudogene Alleles Between the Two Sequenced Rice Genomes. Genetics,2009 年， 182 :1303-1311,公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所獲得)，得到7個TO代轉(zhuǎn) Pid3-38水稻株系，編號為0E1、0E2、0E3、0E4、0E5、0E6、0E7。采用同樣的方法將空載體 PZH01導(dǎo)入到品種為TP309的水稻中，得到8株轉(zhuǎn)空載體水稻。提取葉片DNA進行PCR鑒 定，引物為Pid3F和Pid3R，結(jié)果為不含有目的基因Pid3_38。2、分子檢測分別提取7個TO代轉(zhuǎn)Pid3-38水稻株系(編號為OEl、0E2、0E3、0E4、 0E5、0E6、0E7)和轉(zhuǎn)空載體水稻的DNA (CK)作為模板，利用CAPS標記引物Pid3JF 5' -TACTACTCATGGAAGCTAGTTCTC-3和Pid3JR -ACGTCACAAATCATTCGCTC-3‘進行擴增， 以野生型水稻(水稻品種TP309)為對照。結(jié)果為，野生型水稻(水稻品種TP309)和7個TO 代轉(zhuǎn)Pid3-38水稻株系均得到約600bp大小的PCR產(chǎn)物。然后將各個擴增產(chǎn)物進行BamHl 酶切，電泳檢測。
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同時以 7 個 TO 代轉(zhuǎn) Pid3-38 水稻株系(編號為 0E1、0E2、0E3、0E4、0E5、0E6、0E7) 和轉(zhuǎn)空載體水稻的DNA (CK)為模板，所用引物為HYGF 5 ‘ -GACGGTGTCGTCCATCACAGTTT-3 和HYGR:5' -ACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAA-3‘，檢測潮霉素抗性基因(HYG)轉(zhuǎn)入情況。電 泳檢測。以野生型水稻(水稻品種TP309)為對照。結(jié)果如圖3所示，可以看出，與野生型水稻(TP309)和轉(zhuǎn)空載體水稻(CK)比較，經(jīng) 過BamHl酶切電泳檢測后，7個TO代轉(zhuǎn)Pid3_38水稻株系(編號為0E1、0E2、0E3、0E4、0E5、 0E6、0E7)均得到的2條帶的CAPS標記的片段(序列表1的第2204-2209位為BamHl酶切 位點)，說明7個TO代轉(zhuǎn)Pid3-38水稻株系均為陽性TO代轉(zhuǎn)Pid3-38水稻株系。而HYG基 因(HYG基因存在在載體PZHOl上)在野生型水稻中沒有，HYG基因在7個TO代轉(zhuǎn)Pid3_38 水稻株系和轉(zhuǎn)空載體水稻中均有，進一步說明7個TO代轉(zhuǎn)Pid3-38水稻株系均為陽性TO 代轉(zhuǎn)Pid3-38水稻株系。3、基因過表達分析以7個TO代轉(zhuǎn)Pid3_38水稻株系、野生型水稻(TP309)和轉(zhuǎn)空載體水稻 (CK)為實驗材料，提取其葉片總RNA，利用OligdT將其反轉(zhuǎn)錄為CDNA。以此cDNA為 模板，用引物Pid3JF和Pid3JR擴增，同時以Actin為檢測內(nèi)參，所用引物為ActinF 5' -AGCAACTGGGATGATATGGA-3‘和 ActinR :5' -CAGGGCGATGTAGGAAAGC-3‘。結(jié)果如圖4所示，與轉(zhuǎn)空載體水稻和野生型水稻相比，7個轉(zhuǎn)基因株系得到PCR產(chǎn) 物量大，由于載體PZHOl上有過表達啟動子35S，因此進一步證明7個轉(zhuǎn)基因株系均為陽性 株系。二、轉(zhuǎn)Pid3_38水稻功能研究禾g ■ _ 的 _ 帛胃(Magnaporthe grisea) /]、禾中 ZB15、 CH43、 Sichuan36> JS2001-108、Sichuan26、CH706、CH45、CH704、ZhonglO-8-14、ΖΚ-10-2、91-65-1、97-27_2、 99-20-2,99-26-1和99_26_2均記載在，尚俊軍，水稻NBS-LRR基因家族分析與抗稻瘟病因 基因Pid3的克隆，中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所.2007，博士學位論文中，以上小種 公眾均可從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所獲得。1、初步鑒定在大田中，將轉(zhuǎn)空載體水稻、水稻品種TP309 (野生型水稻)和7個TO代轉(zhuǎn)Pid3_38 水稻株系(編號分別為OEl、0E2、0E3、0E4、0E5、0E6、0E7)的植株均移栽后一個月左右未 孕穗前利用注射器分別進行注射接菌，具體為用無菌水將稻瘟病的病原菌(Magnaporthe grisea)小種zhong-10-8-14配置成5 X IO4孢子/毫升的孢子懸浮液，用普通醫(yī)用注射器 從水稻莖桿基部將Iml孢子懸浮液注入直至懸浮液從水稻莖桿頂部溢出。轉(zhuǎn)空載體水稻和 野生型水稻(TP309)各為3株，實驗重復(fù)三次。一周后調(diào)查發(fā)病情況，觀察植株，無病斑的為抗稻瘟病(R)，有褐點病斑的為感稻 瘟病(S)。結(jié)果如圖5所示，發(fā)現(xiàn)，7個TO代轉(zhuǎn)Pid3_38水稻株系(編號分別為0E1、0E2、 0E3、0E4、0E5、0E6、0E7)均無任何病斑出現(xiàn)，說明7個TO代轉(zhuǎn)Pid3_38水稻株系抗稻瘟病 菌Magnaporthe grisea小種zhong-10-8-14。而3株轉(zhuǎn)空載體水稻(CK)和3株野生型水稻 (TP309)均有褐點病斑出現(xiàn)，說明不抗稻瘟病菌Magnaporthe grisea小種zhong-10-8-14。2、感病鑒定
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收獲TO代轉(zhuǎn)Pid3_38水稻株系(編號分別為0E1)的種子，播種后得到Tl代轉(zhuǎn) Pid3-38水稻株系0E1。將Tl代轉(zhuǎn)Pid3_38水稻株系OEl提取DNA，進行分子檢測，引物為 Pid3JF和Pid3JR，得到的PCR產(chǎn)物再BamHl酶切，得到兩條帶的為陽性，得到53株陽性Tl 代轉(zhuǎn)Pid3-38水稻0E1。分另Ij Mf 稻癌病的病原菌 Magnaporthe grisea 小種 ZB15、CH43、Sichuan36、 JS2001-108、Sichuan26、CH706、CH45、CH704、ZhonglO-8-14、ΖΚ-10-2、91-65-1、97-27_2、 99-20-2,99-26-1和99_26_2接種到Tl代轉(zhuǎn)Pid3_38水稻OEl進行稻瘟病抗譜測定，具體 接種方法如下分別用無菌水將不同小種配置5X IO4孢子/毫升的孢子懸浮液，用普通醫(yī) 用注射器從水稻莖桿基部將Iml孢子懸浮液注入直至懸浮液從水稻莖桿頂部溢出，每個菌 接三株，每株接三個分蘗。以TP309水稻(野生型)、轉(zhuǎn)空載體的轉(zhuǎn)基因水稻和純合的轉(zhuǎn)地谷Pid3轉(zhuǎn)基因水 禾苗(Junjun Shang.，et al. Identification of a New Rice Blast Resistance Gene，Pid3， by Genomewide Comparison of Paired Nucleotide-Binding Site-Leucine-RichRepeat Genes and Their Pseudogene Alleles Between the Two Sequenced Rice Genomes. Genetics，2009年，182 :1303_1311，公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所獲得) 為對照。接種每個菌株的以上各株系各取3株進行實驗，實驗重復(fù)三次。觀察無病斑的為抗稻瘟病(R)，有褐點病斑的為感稻瘟病(S)，結(jié)果如表1所示，轉(zhuǎn) 地谷中pid3轉(zhuǎn)基因水稻(轉(zhuǎn)Pid3水稻)和Tl代轉(zhuǎn)Pid3-38水稻OEl (轉(zhuǎn)Pid3_38水稻 (OEl))對稻瘟病菌的抗譜存在差異。
表1轉(zhuǎn)Pid3-38水稻(OEl)對稻瘟病菌抗譜存在差異
菌株ΤΡ309轉(zhuǎn)空載轉(zhuǎn)Pid3水稻 轉(zhuǎn)Pid3_
ZB15SSSS
CH43SSRS
Sichuan36SSRR
JS2001-108SSRS
Sichuan26SSSS
CH706SSRS
CH45SSSS
CH704SSS5
ZhonglO-8-14SSRR
ZK-10-2SSRR
91-65-1SSSS
97-27-2SSSR
99-20-2SSRS
99-26-1SSSS
99-26-2SSRS
野生型水稻(ΤΡ309)與轉(zhuǎn)空載體水稻結(jié)果無顯著差異。
從表1中看出，野生型水稻(ΤΡ309)和轉(zhuǎn)Pid3-38水稻(OEl)
與野生型水稻(TP309)相比，轉(zhuǎn) Pid3_38 水稻(OEl)對 Sichuan36、ZhonglO-8_14、 ZK-10-2,97-27-2有抗性；而轉(zhuǎn)Pid3水稻對97_27_2沒有抗性，說明轉(zhuǎn)Pid3_38水稻(OEl) 在抗97-27-2菌方面，優(yōu)于轉(zhuǎn)Pid3水稻。
權(quán)利要求
一種克隆抗稻瘟病基因的方法，包括如下步驟1)根據(jù)已知的抗稻瘟病基因設(shè)計引物，得到引物對；2)以對稻瘟病菌高抗水稻基因組DNA為模板，用步驟1)得到的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；3)將步驟2)得到的PCR擴增產(chǎn)物進行測序，得到抗稻瘟病基因；4)將步驟3)得到抗稻瘟病基因轉(zhuǎn)入易感稻瘟病水稻，得到轉(zhuǎn)基因水稻，對轉(zhuǎn)基因水稻進行稻瘟病的抗譜測定，得到具有新抗譜的抗稻瘟病基因，即為目的抗稻瘟病基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述已知的抗稻瘟病基因為序列表中序列5所示；步驟2)中，所述稻瘟病菌高抗水稻為普通野生稻(Oryza rufipogon)；步驟4)中，所述易感稻瘟病水稻的品種為TP309。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述引物對中的一條引物為序列表中序列3所示，另一條引物為序列表中 序列4所示；步驟4)中，所述抗譜測定的方法為將稻瘟病病原菌(Magnaporthe grisea)接種到轉(zhuǎn) 基因水稻中，得到接菌后轉(zhuǎn)基因水稻，一周后觀察，未出現(xiàn)病斑的轉(zhuǎn)基因水稻中的抗稻瘟病 基因為目的抗稻瘟病基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述稻瘟病病原菌(Magnaporthe grisea)的小種為如下至少一種ZB15、CH43、 Sichuan36、JS2001-108、Sichuan26、CH706、CH45、CH704、Zhongl0-8-14、ZK-10-2、91-65-l、 97-3-1、97-27-2、99-20-2、99-26-1和 99-26-2。
5.一種蛋白質(zhì)，是如下1)或2)的蛋白質(zhì)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且 與植物抗稻瘟病相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
6.權(quán)利要求5所述蛋白質(zhì)的編碼基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下1)或2)或3) 所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼所述與植物抗稻瘟病相關(guān)蛋白質(zhì)的 DNA分子；3)與1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有 99%同源性且編碼所述與植物抗稻瘟病相關(guān)蛋白質(zhì)的DNA分子。
8.含有權(quán)利要求6或7所述編碼基因的重組表達載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或表達 盒；所述重組表達載體具體為將權(quán)利要求6或7所述的編碼基因插入載體PZHOl的多克隆 位點得到的重組表達載體。
9.一種培育抗稻瘟病轉(zhuǎn)基因植物方法，為將權(quán)利要求6或7所述的編碼基因?qū)肽康?植物，獲得抗稻瘟病的轉(zhuǎn)基因植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述稻瘟病由下述稻瘟病的病原菌 (Magnaporthe grisea) /]、禾中中的—禾中弓I fe :Sichuan36> Zhongl0_8_14、 ZK-10-2 97-27-2 ；所述目的植物為雙子葉植物或者單子葉植物，優(yōu)選為單子葉植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種克隆抗稻瘟病基因的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟1)根據(jù)已知的抗稻瘟病基因設(shè)計引物，得到引物對；2)以對稻瘟病菌高抗水稻為模板，用步驟1)得到的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；3)將步驟2)得到的PCR擴增產(chǎn)物進行測序，得到抗稻瘟病基因；4)將抗稻瘟病基因轉(zhuǎn)入易感稻瘟病水稻，進行稻瘟病的抗譜測定，得到具有新抗譜的抗稻瘟病基因，即為目的抗稻瘟病基因。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明直接分離野生稻中的抗稻瘟病基因，轉(zhuǎn)化水稻品種，獲得抗稻瘟病的水稻，對轉(zhuǎn)基因植株進行抗譜測定，篩選出具有新抗譜的抗稻瘟病基因，有利于對水稻品種進行整體改良。
文檔編號C12N15/10GK101979543SQ20101052926
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月28日
發(fā)明者呂啟明, 朱立煌, 李仕貴, 李曉兵, 江光懷 申請人:中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所