專利名稱：一種油菜種子發(fā)育極早期種皮顏色鑒定試劑盒及鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體地說是涉及一種油菜種子發(fā)育極早期種皮顏色快速鑒 定試劑盒及其鑒定方法。
背景技術(shù)：
國(guó)內(nèi)外大量研究表明，在相同遺傳背景下，黃色種皮油菜(簡(jiǎn)稱黃籽油菜)與黑色種皮 油菜(簡(jiǎn)稱黑籽油菜)相比具有種皮薄、含油量高、油中色素和雜質(zhì)少、木質(zhì)素含量低等優(yōu) 點(diǎn)。油菜黃籽一直是油菜育種家們最關(guān)心的問題，尤其是對(duì)種子黃籽性狀的極早期選擇(開 花后10天內(nèi))，但油菜種子顏色要到成熟是才能顯現(xiàn)出來，以前方法很難做到這一點(diǎn)。無論 是黃籽還是黑籽在種子發(fā)育的極早期，種皮都是綠色的，育種者在種子發(fā)育的極早期不能 對(duì)種皮顏色進(jìn)行選擇，需要在種子成熟后才能對(duì)種皮顏色性狀進(jìn)行選擇。同時(shí)，在油菜雜種 優(yōu)勢(shì)利用中，根據(jù)雜交親本之間的種皮顏色的顯隱性關(guān)系，在種子發(fā)育極早期對(duì)雜交種的 親本和雜交種的純度進(jìn)行鑒定。通常要鑒定油菜種皮顏色，都要等到種子成熟后才能判斷， 雖然我們?cè)没瘜W(xué)鑒定法(香草醛染色法)能夠鑒定油菜種皮的顏色，但至少要在授粉10天 后才能判斷，如果能夠在開花后10天內(nèi)就能對(duì)種皮顏色進(jìn)行鑒定，那可以大大減少油菜黃 籽育種的工作量，這樣可以加快育種的進(jìn)程，降低了育種成本，因此油菜種子種皮顏色發(fā)育 極早期的快速鑒定試劑盒及鑒定方法對(duì)于油菜育種有極其重要的意義。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，即PCR)，是目前最流行的體外擴(kuò) 增DNA片段的技術(shù)，具有快速、敏感和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，如能將該技術(shù)用于油菜種皮顏色的 極早期鑒定，將具有重要的意義和廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的種皮顏色極早期鑒定上存在的不足，提供一種快速、 特異性好、靈敏度高的油菜種子發(fā)育極早期(開花后4-5天)快速鑒定種皮顏色的試劑盒，以 便應(yīng)用于油菜的育種；本發(fā)明的另一目的是提供利用上述試劑盒鑒定油菜發(fā)育極早期的種 皮顏色的方法。一種油菜種子發(fā)育極早期種皮顏色鑒定試劑盒，其特征是，所述試劑盒由下列部 件組成
(1)RNA提取A液，內(nèi)裝Trizol液;
(2)RNA提取B液，內(nèi)裝苯酚-氯仿，苯酚、氯仿的體積比為25:24;
(3)RNA提取C液，內(nèi)裝異丙醇；
(4)RNA提取D液，內(nèi)裝75%乙醇；
(5)RNA提取E液，內(nèi)裝DEPC處理后高溫滅菌的超純水；
(6)RT反應(yīng)F液，內(nèi)裝反應(yīng)緩沖液Buffer、dNTP、oligo dT引物、RNA酶抑制和反轉(zhuǎn)錄 酶M-MLV，各組分的體積配比為
反應(yīng)緩沖液(5Xmxiffer)2份
dNTP1 份
oligo dT引物1份RNA酶抑制0. 3份
反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV0. 5份
DEPC處理的超純水4. 2份；
(7)RT-PCR反應(yīng)Gl液，內(nèi)裝含Mg2+的反應(yīng)緩沖液Buffer、dNTP、Taq酶、正向引物F 和反向引物R，各組分的體積配比如下
含mg2+的反應(yīng)緩沖液(IOXmxiffer) 2份 dNTP0. 3 份
正向引物F1份
反向引物R1份
超純水13. 3份
Taq 酶0. 4 份；
(8)RT-PCR反應(yīng)G2液，內(nèi)裝含Mg2+的反應(yīng)緩沖液，dNTP、Taq酶、內(nèi)參基因Actin的 正向引物ACTF和內(nèi)參基因Actin的反向引物ACTR，各組分的體積配比如下
含mg2+的反應(yīng)緩沖液(IOXmxiffer) 2份 dNTP0. 3 份
正向引物ACTF1份
反向引物ACTR1份
超純水13. 3份
Taq 酶0. 4 份；
(9)陽性對(duì)照Hl液，內(nèi)裝黑籽油菜陽性模板；
(10)陰性對(duì)照H2液，內(nèi)裝黃籽油菜陰性模板。
所述正向引物F序列為5’-TCAGCTGCTGCGGTTTCTATC-3’，所述反向 弓 I 物 R 序列為5’-CAGATAGCTTCTGCATTTCCTTG-3’ ；所述正向引物 ACTF 序 列為5，-GACATTCAACCTCTTGTTTGC-3，，所述反向引物 ACTR 序列為 5’-CTGCTCGTAGTCAAGAGCAATG-3’ 。
一種利用所述試劑盒鑒定油菜發(fā)育極早期種皮顏色的方法，按以下步驟進(jìn)行
(1)取待測(cè)的開花4-5天后的去掉種臍的種皮樣品，加5倍體積的RNA提取A液，冰浴 勻漿，室溫靜止2-5min，得勻漿液；
(2)在上述勻漿液中加入0.5倍體積的RNA提取B液，混勻，靜止2-5min ；
(3)4-10°C , 12000g 離心 5min ；
(4)取上清液，加入1倍體積的RNA提取C液，混勻，靜置5-10min ；
(5)4-100C，12000g 離心 5min ；
(6)棄上清，用RNA提取D液洗滌后，室溫干燥或在超凈臺(tái)中吹干，加RNA提取E液溶 解，得RNA溶液；
(7)取所得RNA溶液，加入4倍體積的RT反應(yīng)F液，42°C保溫30min,然后99°C處理5 min,得RT-PCR的模板；
(8)將RT-PCR的模板、陽性對(duì)照Hl液、陰性對(duì)照H2液分別加到RT-PCR反應(yīng)Gl液和 RT-PCR反應(yīng)G2液中，混勻后至于PCR儀上；
(9)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增先 94°C 3min，再 94°C，30s; 58°C , 30s; 72°C , 30 min, 30 個(gè)循環(huán)后，72°C延長(zhǎng)6 min，反應(yīng)結(jié)束后，得擴(kuò)增產(chǎn)物。(10)取擴(kuò)增產(chǎn)物，加1/5倍體積的上樣緩沖液(含溴酚藍(lán))，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電 泳15-30min后在紫外儀上觀察，若與陽性對(duì)照同一位置的319 bp處出現(xiàn)明亮的條帶，則為 檢測(cè)陽性，說明該待測(cè)樣品種子成熟后種皮為黑色，否則為陰性，說明該待測(cè)樣品種子成熟 后種皮為透明，種子表現(xiàn)出胚的黃色。本發(fā)明有如下有益效果本發(fā)明依據(jù)以油菜黃黑籽種皮中差異表達(dá)的基因序列為 基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，建立了反轉(zhuǎn)錄——聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR體系)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu) 化，建立了油菜種皮顏色發(fā)育極早期的定性鑒定方法，此方法快速、敏感和特異性強(qiáng)，尤其 能鑒定油菜種子發(fā)育的極早期(開花4-5天)的種皮，大大提前了油菜種皮顏色鑒定的時(shí)間， 為油菜種皮顏色育種和黃籽育種的選擇節(jié)約了時(shí)間，提高了育種選擇的效率，具有很高的 實(shí)用價(jià)值。


附圖是不同種皮顏色油菜材料開花4-5天種皮樣品的RT-PCR鑒定結(jié)果圖。圖中ACT: β-Actin基因?yàn)閮?nèi)參；B:黑籽種皮陽性對(duì)照；Y:黃籽種皮陰性對(duì) 照；Lane 1-8 鑒定的甘藍(lán)型油菜種皮樣品(種子成熟后1、2、4、6為黃籽，3、5、7、8為黑籽); Lane 9_16 鑒定的芥菜型油菜種皮樣品(種子成熟后14為黃籽，9、10、11、12、13、15、16為 黑籽)；Lane 17-18:鑒定的白菜型油菜種皮樣品(種子成熟后17為黃籽，18為黑籽)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
油菜種子發(fā)育早期種皮顏色鑒定試劑盒由以下各部分組成
(1)RNA提取A液，內(nèi)裝Trizol液，2管，5ml/管。
(2)RNA提取B液，內(nèi)裝苯酚-氯仿，苯酚、氯仿的體積比為25:24，1管，5ml/管。(3) RNA提取C液，內(nèi)裝異丙醇，2管，5ml/管。(4) RNA提取D液，內(nèi)裝75%乙醇，2管，5ml/管。(5) RNA提取E液，內(nèi)裝DEPC處理后高溫滅菌的超純水，1管，Iml/管。(6) RT反應(yīng)F液，內(nèi)裝反應(yīng)緩沖液(5XBuffer)、dNTP、oligo dT引物、RNA酶抑 制、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV和DEPC處理的超純水，1管，0. 2ml/管
(7)RT-PCR反應(yīng)Gl液，內(nèi)裝含Mg2+的反應(yīng)緩沖液(10XBuffer)、 dNTP、Taq酶、正向引物F、反向引物R和超純水，1管，0. 4ml/管；所述正向 引物F序列為5’-TCAGCTGCTGCGGTTTCTATC-3’，所述反向引物R序列為 5，-CAGATAGCTTCTGCATTTCCTTG-3，；
(8)RT-PCR反應(yīng)G2液，內(nèi)裝含Mg2+的反應(yīng)緩沖液(10 XBuffer)，dNTP、Taq酶、內(nèi)參 基因Actin的正向引物ACTF、內(nèi)參基因Actin的反向引物ACTR和超純水，1管，0. 4ml/管; 所述正向引物ACTF序列為5' -GACATTCAACCTCTTGTTTGC-3'，反向引物ACTR序列為5'-CTGCTCGTAGTCAAGAGCAATG-3'；
(9)陽性對(duì)照Hl液，內(nèi)裝黑籽油菜陽性模板，1管，0.02ml/管。(10)陰性對(duì)照H2液，內(nèi)裝黃籽油菜陰性模板，1管，0. 02ml/管。
(11)長(zhǎng)方形盒子，大小為8 cm X 6 cm X 5cm;內(nèi)含一塊大小為8 cm X 6 cm硬紙板， 上有孔徑為1. 5cm的孔8個(gè)，上有孔徑為0. 75cm的孔6個(gè)，上述各小管分別放置于對(duì)應(yīng)的 孔內(nèi)。
10 μ L體系的RT反應(yīng)F液的組分及各組分的體積如下
反應(yīng)緩沖液(5Xmxiffer)2μ L
dNTP1 μ L
oligo dT 引物IyL
RNA酶抑制0. 3 μ L
反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV0. 5 μ L
DEPC處理的超純水4. 2 μ L
20 μ L體系的RT-PCR反應(yīng)Gl液的組分及各組分的體積如下
含mg2+的反應(yīng)緩沖液(10 X Bbuffer) 2μ L
dNTP0. 3 μ L
正向引物FIuL
反向引物RIuL
超純水13.3yL
Taq 酶0. 4 μ L
20 μ L體系的RT-PCR反應(yīng)G2液的組分及各組分的體積如下
含mg2+的反應(yīng)緩沖液(10XBbuffer) 2μ L
dNTP0. 3 μ L
正向引物ACTFIuL
反向引物ACTRIuL
超純水13.3yL
Taq 酶0. 4 μ L
實(shí)施例2
油菜種子發(fā)育早期種皮顏色的鑒定方法，使用實(shí)施例1中的試劑盒，按下列步驟進(jìn)行 (1)取去掉種臍部分后的新鮮種皮0. 05、. Ig,加入500 μ L的RNA提取A液，冰浴勻 漿，室溫靜止2 5min。(2)在上述勻漿液中加入250 μ L的RNA提取B液，混勻，靜止2_5min。(3)4_10°C，12000g 離心 5min。(4)取上清液500 μ L，加入500 μ L的RNA提取C液，混勻，靜置5-10 min。(5)4-10°C,12000g離心5min。去掉上清液，用250 μ L的RNA提取D液洗滌2次 后，室溫干燥或在超凈臺(tái)中吹干，加15 30 μ L的RNA提取E液溶解，得RNA溶液。(6)取IyL的上述RNA溶液，加入9μ L的RT反應(yīng)F液，42°C保溫30 min，然后 99°C處理5 min，得RT-PCR的模板。(7)分別將2 μ L的RT-PCR的模板、陽性對(duì)照Hl液和陰性對(duì)照Η2液加到18 μ L 的RT-PCR反應(yīng)Gl液和RT-PCR反應(yīng)G2液中，混勻后置于PCR儀上。(8)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增先 94°C 3min，再 94°C，30s; 58°C , 30s; 72°C , 30 min, 共30個(gè)循環(huán)后，72 °C延長(zhǎng)6 min，反應(yīng)結(jié)束后，得擴(kuò)增產(chǎn)物。
(9)取8-10 μ L擴(kuò)增產(chǎn)物，力卩2 μ L上樣緩沖液(含溴酚藍(lán))，混勻，經(jīng)1%的瓊脂糖 凝膠電泳15-30min后在紫外儀上觀察，若與319 bp處出現(xiàn)明亮的條帶(與陽性對(duì)照同一 位置的)則為檢測(cè)陽性，說明該待測(cè)樣品種子成熟后種皮為黑色，否則為陰性，說明該待測(cè) 樣品種子成熟后種皮為透明，種子表現(xiàn)出黃色(見圖1)。
權(quán)利要求
1. 一種油菜種子發(fā)育極早期種皮顏色鑒定試劑盒，其特征是，所述試劑盒由下列部件 組成(1)RNA提取A液，內(nèi)裝Trizol液;(2)RNA提取B液，內(nèi)裝苯酚-氯仿，苯酚、氯仿的體積比為25:24;(3)RNA提取C液，內(nèi)裝異丙醇；(4)RNA提取D液，內(nèi)裝75%乙醇；(5)RNA提取E液，內(nèi)裝DEPC處理后高溫滅菌的超純水；(6)RT反應(yīng)F液，內(nèi)裝反應(yīng)緩沖液Buffer、dNTP、oligo dT引物、RNA酶抑制和反轉(zhuǎn)錄 酶M-MLV，各組分的體積配比為反應(yīng)緩沖液(5Xmxiffer)2份dNTP1 份oligo dT引物1份RNA酶抑制0. 3份反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV0. 5份DEPC處理的超純水4. 2份；(7) RT-PCR反應(yīng)Gl液，內(nèi)裝含Mg2+的反應(yīng)緩沖液Buffer、dNTP、Taq酶、正向引物F 和反向引物R，各組分的體積配比如下含mg2+的反應(yīng)緩沖液(IOXmxiffer) 2份 dNTP0. 3 份正向引物F1份反向引物R1份超純水13. 3份Taq 酶0. 4 份；(8) RT-PCR反應(yīng)G2液，內(nèi)裝含Mg2+的反應(yīng)緩沖液，dNTP、Taq酶、內(nèi)參基因Actin的 正向引物ACTF和內(nèi)參基因Actin的反向引物ACTR，各組分的體積配比如下 含mg2+的反應(yīng)緩沖液(IOXmxiffer) 2份 dNTP0. 3 份正向引物ACTF1份反向引物ACTR1份超純水13. 3份Taq 酶0. 4 份；(9)陽性對(duì)照Hl液，內(nèi)裝黑籽油菜陽性模板；(10)陰性對(duì)照H2液，內(nèi)裝黃籽油菜陰性模板。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的油菜種子發(fā)育極早期種皮顏色鑒定試劑盒，其特征是，所述正向引物F序列為5’-TCAGCTGCTGCGGTTTCTATC-3’， 所述反向引物R序列為5’-CAGATAGCTTCTGCATTTCCTTG-3’ ；所述正向引 物ACTF序列為5，-GACATTCAACCTCTTGTTTGC-3，，所述反向引物ACTR序列為 5’-CTGCTCGTAGTCAAGAGCAATG-3’ 。
3. 一種利用權(quán)利要求1所述試劑盒鑒定油菜發(fā)育極早期種皮顏色的方法，其特征是， 按以下步驟進(jìn)行(1)取待測(cè)的開花4-5天后的去掉種臍的種皮樣品，加5倍體積的RNA提取A液，冰浴 勻漿，室溫靜止2-5min，得勻漿液；(2)在上述勻漿液中加入0.5倍體積的RNA提取B液，混勻，靜止2-5min ；(3)4-10°C , 12000g 離心 5min ；(4)取上清液，加入1倍體積的RNA提取C液，混勻，靜置5-10min ；(5)4-100C，12000g 離心 5min ；(6)棄上清，用RNA提取D液洗滌后，室溫干燥或在超凈臺(tái)中吹干，加RNA提取E液溶 解，得RNA溶液；(7)取所得RNA溶液，加入4倍體積的RT反應(yīng)F液，42°C保溫30min,然后99°C處理5 min,得RT-PCR的模板；(8)將RT-PCR的模板、陽性對(duì)照Hl液、陰性對(duì)照H2液分別加到RT-PCR反應(yīng)Gl液和 RT-PCR反應(yīng)G2液中，混勻后至于PCR儀上；(9)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增先 94°C 3min，再 94°C，30s; 58°C , 30s; 72°C , 30 min, 30 個(gè) 循環(huán)后，72°C延長(zhǎng)6 min，反應(yīng)結(jié)束后，得擴(kuò)增產(chǎn)物；(10)取擴(kuò)增產(chǎn)物，加1/5倍體積的上樣緩沖液(含溴酚藍(lán))，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳 15-30min后在紫外儀上觀察，若與陽性對(duì)照同一位置的319 bp處出現(xiàn)明亮的條帶，則為檢 測(cè)陽性，說明該待測(cè)樣品種子成熟后種皮為黑色，否則為陰性，說明該待測(cè)樣品種子成熟后 種皮為透明，種子表現(xiàn)出胚的黃色。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鑒定試劑盒，具體公開了一種在油菜種子發(fā)育極早期快速鑒定種皮顏色的鑒定方法。本發(fā)明的試劑盒及鑒定方法是依據(jù)在油菜黃黑籽發(fā)育極早期差異表達(dá)基因的序列設(shè)計(jì)的一對(duì)引物為主體的基礎(chǔ)上而產(chǎn)生的。本發(fā)明采用反轉(zhuǎn)錄——聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)，對(duì)油菜發(fā)育早期(開花4-5天后)種皮(去掉種臍部分)的特異RNA核酸片段進(jìn)行的定性檢測(cè)，簡(jiǎn)便快速，特異性好，靈敏度高，可以廣泛應(yīng)用于油菜種皮顏色育種中的極早期選擇，從而提高育種效率，加快育種進(jìn)程，節(jié)約育種成本，提高科學(xué)管理效率，具有很高的使用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102134587SQ20101052622
公開日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2010年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月1日
發(fā)明者嚴(yán)明理, 劉麗莉, 向建華, 屠波, 譚勇俊, 陸贏 申請(qǐng)人:湖南科技大學(xué)