專利名稱：一種枯草芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種枯草芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，隨著現(xiàn)代醫(yī)療水平的提高，癌癥、艾滋病、器官和骨髓移植等病人的存活 率大大上升，但是這些患者由于經(jīng)常使用大劑量抗生素、抗腫瘤藥物、激素、免疫抑制劑等 藥物，以及化療和靜脈插管、血液透析等介入性治療，造成免疫力下降，極易被本來不顯病 原性的條件致病真菌侵入造成深部真菌病(Systemic fungal infection)。近年來這種嚴(yán) 重威脅生命的真菌感染呈快速增長趨勢，患者人數(shù)不斷增加。在臨床上，隨著真菌感染率的上升，對抗真菌藥物的使用率提高了，隨之而來耐藥 菌株也不斷增多，給臨床的治療帶來一定的困難。而抗真菌新藥相對于抗細(xì)菌感染藥而顯 得滯后，因此尋找安全、高效、低毒、廣譜的新型抗真菌物質(zhì)已越來越引起人們的重視。造成深部真菌病的病原菌主要為念珠菌屬和曲霉屬，其中白色念珠菌(Candida albicans)是一類主要的病源真菌，可感染人體許多部位，包括內(nèi)臟及中樞神經(jīng)。它是造成 醫(yī)院血液感染的主要原因，在傷口和體液中感染時具有很強(qiáng)的致死性，而且臨床研究發(fā)現(xiàn) 其致死率并不隨常規(guī)抗真菌藥物的使用而下降。侵入性真菌感染現(xiàn)象盡管相對較為少見，但其總發(fā)病率在過去的20年內(nèi)節(jié)節(jié)攀 升。據(jù)Datamonitor預(yù)測，到2010年，在900萬高危疾病患者中，有120萬患者將面臨真菌 感染的威脅。過去，真菌感染一般只發(fā)生在特定的亞群患者中，然而隨著化療、移植、HIV/ ADIS感染或糖尿病等免疫受損患者數(shù)量的增多，尤其對接受長期治療的患者來說，真菌感 染的高發(fā)危險使抗真菌治療受到了越來越廣泛的關(guān)注。由于侵入性真菌感染(IFIs)的預(yù) 防和治療領(lǐng)域正逐漸向接受化療、移植以及HIV/ADIS或糖尿病患者等人群擴(kuò)展，這也預(yù)示 了抗真菌藥物市場潛力的巨大?？拐婢幬锸袌鍪且粋€成熟的市場，然而從產(chǎn)品的類別和數(shù)量來看，抗真菌藥 卻遠(yuǎn)不如其他抗菌藥物那樣多而全面。世界上第一種抗真菌藥是于20世紀(jì)50年代 問世的，然而一直到1978年，市場上可用于治療全身性真菌感染的藥品僅為兩性霉素 B (amphotericins B, Am B)、制霉菌素(nystatin)和氟胞嘧啶(flucytosine)等 3 種。在 其后的幾十年里，雖然也有數(shù)十種抗真菌藥上市，但是真正占市場主導(dǎo)地位的廣譜抗真菌 藥卻只有為數(shù)不多的幾種。近10年來(1996 2005)，各國報道的新抗真菌抗生素約有174 種，化學(xué)結(jié)構(gòu)多達(dá)30余個類型，其中有一部分抗生素專抗植物真菌，而大多數(shù)抗動物真菌 的抗生素或因抗真菌譜過窄，體內(nèi)活性微弱，或因細(xì)胞毒性較強(qiáng)等，天然物本身與經(jīng)過結(jié)構(gòu) 修飾的產(chǎn)物，具有發(fā)展前景者不多。目前臨床上常用的抗真菌藥物按其作用機(jī)理可分為三大類1)干擾真菌核酸合 成藥物，如灰黃霉素和氟胞嘧啶等，這類藥物由于毒性大，抗菌譜窄、復(fù)發(fā)率高等問題，目 前已很少使用。2)干擾真菌細(xì)胞膜麥角固醇合成的藥物，如多烯類抗生素(兩性霉素B、 制霉菌素等)、唑類化學(xué)合成藥(如伊曲康唑、氟康唑等)和丙稀胺類抗生素(特比萘芬
3(Terbinafine)和萘替芬(Naftifine)等)。然而，兩性霉素B抗菌效果好，抗菌譜廣，是最 常用的抗真菌藥物，但由于具有腎毒性而大大限制其應(yīng)用；唑類藥物也是有效的抗真菌藥 物，該類藥物的開發(fā)從第一代的克霉唑已經(jīng)到了第三代的氟康唑和伊曲康唑等，毒性較小， 有較寬的抗菌譜，但其抗菌活性明顯低于兩性霉素且易產(chǎn)生耐藥性；特比萘芬對深部真菌 感染無效。3)抑制i3-(l，3)-D葡聚糖合成酶的藥物，如Meck公司2001年上市的新藥卡泊 芬凈(Caspofimgin)以及藤澤藥品2002年上市的米卡芬凈(Micafungin)等，這類藥物能 抑制真菌細(xì)胞壁合成必需的β-(1，3)- 葡聚糖合成酶，有很好的應(yīng)用前景。此外，外用療 法已能治愈大多數(shù)淺部真菌病患者，但是能治療深部真菌病的藥物還很少，有些病仍然沒 有有效的治療方法。芽孢桿菌(Bacillus sp.)是自然界中廣泛存在的一種非致病性細(xì)菌，能產(chǎn)生多種 抗真菌和細(xì)菌的代謝物，其中脂肽類、肽類、磷脂類為主要類型，它們對致病菌和內(nèi)源性感 染的條件致病菌都具有明顯的抑制作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種枯草芽孢桿菌菌株，從該菌株發(fā)酵液可以分離得到一種抗菌物 質(zhì)，該物質(zhì)經(jīng)ESI/MS^H-NMR及13C-NMR等分析，發(fā)現(xiàn)其為分子量402. 5Da的大環(huán)內(nèi)酯類物質(zhì)。一種枯草芽孢桿菌菌株，命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ZJU007，保藏 于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中科院微生物研究所的中國普通微生物菌種保藏 管理中心(CGMCC)，保藏號為CGMCCNo. 4140，保藏時間2010年9月03日。上述菌株主要生物學(xué)特征為菌落顏色是灰色，邊緣為白色，菌落形態(tài)較圓整，表 面有褶皺突起，直徑大小為中型(約2mm左右)，菌株產(chǎn)芽孢的時間在培養(yǎng)3天達(dá)到高峰，4 天完全成熟。本發(fā)明還提供了上述枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)如式(1)所示化合物中的應(yīng)用。
(1) 本發(fā)明菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對白色念珠菌的抑制作用十分強(qiáng)烈，比目前常用的制 霉菌素有更好的抑菌效果。該抗菌物質(zhì)不僅對白色念珠菌等酵母類真菌有強(qiáng)烈的抑菌效 果，而且對黑曲霉等絲狀真菌也有很好的效果，同時對大腸桿菌等細(xì)菌也有較好的抑菌效^ ο


圖Ia為本發(fā)明菌株的光鏡圖；圖Ib為本發(fā)明菌株的電鏡圖；圖2a為溫度對發(fā)酵液代謝產(chǎn)物抗白色念珠菌效價的影響曲線圖；圖2b為pH值對發(fā)酵液代謝產(chǎn)物抗白色念珠菌效價的影響曲線圖；圖2c為裝液量對發(fā)酵液代謝產(chǎn)物抗白色念珠菌效價的影響曲線圖；圖2d為接種量對發(fā)酵液代謝產(chǎn)物抗白色念珠菌效價的影響曲線圖；圖2e為搖床轉(zhuǎn)速對發(fā)酵液代謝產(chǎn)物抗白色念珠菌效價的影響曲線圖；圖2f為發(fā)酵時間對發(fā)酵液代謝產(chǎn)物抗白色念珠菌效價的影響曲線圖；圖3為本發(fā)明抗真菌物質(zhì)HPLC圖譜；圖4為本發(fā)明抗真菌物質(zhì)ΕΙ/MS分析圖譜；圖5為本發(fā)明抗真菌物質(zhì)13C-NMR圖譜；圖6為本發(fā)明抗真菌物質(zhì)1H-NMR圖譜。
具體實(shí)施例方式培養(yǎng)基(I)LB斜面培養(yǎng)基(％)酵母粉0.5，蛋白胨1.0，NaCl 0. 5，瓊脂2. 0，調(diào)ρΗ7· 4 7. 6。(2)種子培養(yǎng)基(% )葡萄糖 1. 5，酵母粉 1. OjK2HPO4O. LMgSO4O. 05,FeSO4O. 001， 調(diào) pH7. 0 后加 CaCO3O. 04。(3)發(fā)酵培養(yǎng)基(% )黃豆粉0. 6，可溶性淀粉3. 0，酵母粉1.0, K2HPO4O. 1，NaCl 0. 2，MgSO4O. 005，F(xiàn)eSO4O. 002，pH 6. 5。(4)白色念珠菌培養(yǎng)基(％)葡萄糖2.0，蛋白胨1.0，瓊脂2.0。菌株分離純化土壤樣品在浙江東海劃定的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行五點(diǎn)交叉采樣，每點(diǎn)采取土樣10g，放入錐 形瓶內(nèi)，混勻后取土壤樣品10g，加到一個裝有90mL無菌水的錐形瓶中，置于搖床上振蕩 30min，使土樣中的菌體充分分散于水中，即為ICT1菌液。接種環(huán)火焰滅菌冷卻后蘸取一環(huán) 稀釋度為KT1菌液，在LB培養(yǎng)基平板上作四區(qū)劃線接種，30°C培養(yǎng)48h，然后挑取單菌落 劃線，進(jìn)一步純化。將培養(yǎng)后的單菌落連同周圍的小塊瓊脂用穿孔器取出，移入無培養(yǎng)基 平皿，30°C培養(yǎng)4d后移入涂布白色念珠菌的平板，瓊脂塊中心間隔距離為4cm，培養(yǎng)過夜， 根據(jù)抑制圈大小選擇單菌落進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩采用搖瓶培養(yǎng)法進(jìn)行，取初篩得到50株菌種， 接入到種子瓶中，250mL錐形瓶中裝25mL培養(yǎng)基，初始pH 7. 0，30°C下200r/min培養(yǎng)24h。 再將種子液以8% (ν/ν)的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，250mL三角瓶中裝40mL培養(yǎng)基， 28°C、pH6. 5下200r/min培養(yǎng)36h，比較50株菌種所產(chǎn)抗真菌物質(zhì)抑制白色念珠菌的程度， 最終獲得1株最高效抑制白色念珠菌的菌株，編號為ZJU007。LB斜面培養(yǎng)基保藏菌株于 4°C冰箱中，長期保藏采用甘油管保藏法于-20°C凍存。菌株鑒定該菌株主要生物學(xué)特征為菌落顏色是灰色，邊緣為白色，菌落形態(tài)較圓整，表面 有褶皺突起，直徑大小為中型(約2mm左右)，菌株產(chǎn)芽孢的時間在培養(yǎng)3天達(dá)到高峰，4天完全成熟。在LB平板上培養(yǎng)三天后，挑取單菌落，在光學(xué)顯微鏡以及掃描電鏡下觀察，具體 如圖Ia和圖Ib所示。根據(jù)孢桿菌16S rRNA保守序列設(shè)計下列引物，并由上海生工生物工程公司合成上游引物5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，下游引物5，-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3，，利用上述引物對該菌株的16S rDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系為PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 20 μ Lddw14. 25 μ L10XPCR Buffer 2. 0 μ LdNTP mixture 0. 5 μ LTaq 聚合酶0· 25 μ L引物 l(16f)l.OyL引物 2(16R2)l.OyLDNA模板1· 0 μ L (根據(jù)濃度定量)PCR反應(yīng)條件為PCR循環(huán)條件95°C預(yù)變性5min，循環(huán)參數(shù)95°C變性lmin，52°C 復(fù)性45s，72°C延伸1.5min，重復(fù)35個循環(huán)后，72°C再延伸lOmin，最后4°C保溫。用0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。選用條帶清晰的產(chǎn)物進(jìn)行純化。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳回收，并連接到T載體后進(jìn)行測序，獲得了該菌株16s rDNA 一級結(jié)構(gòu)的1513bp特征序列(如SEQ ID NO. 1所示)。通過在Genebank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相 似性搜索(blast)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與枯草枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis isolate C8-4的 16s rDNA序列同源性為97% (Genebank的登記號為EU257436. 1)。根據(jù)上述特征命名該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) ZJU007，保藏于 位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號3號院中科院微生物研究所的中國普通微生物菌種保藏管 理中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 4140，保藏時間2010年9月03日。發(fā)酵條件優(yōu)化取1環(huán)經(jīng)活化的上述菌種，接入到種子瓶中，250mL錐形瓶中裝25mL培養(yǎng)基，初始 pH值7. 0，300CT 200r/min培養(yǎng)24h，制得種子液。將種子液接種到含發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，搖床振蕩培養(yǎng)，測量在不同發(fā) 酵培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基PH值、裝液量、接種量、搖床轉(zhuǎn)速和發(fā)酵時間下發(fā)酵液中抗白色念珠菌 的代謝產(chǎn)物的含量(以制霉菌素的效價表示)，其影響曲線分別圖2a、圖2b、圖2c、圖2d、圖 2e和圖2f所示。具體方法如下以白色念珠菌(Candida albicans ATCC 64548)為指示菌，管碟法測量不同效價 的制霉菌素溶液下抑菌圈大小，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程r2 = 1. 2331g(u)-l. 5926，R2 = 0. 9927。 其中U 制霉菌素效價(U/mL)，r 抑菌圈半徑(cm)。然后管碟法測量不同條件下獲得的發(fā)酵液的抑菌圈大小，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成制 霉菌素的效價。通過分析各影響曲線，最佳發(fā)酵條件為溫度28°C，pH 6.5，搖床轉(zhuǎn)速2001·/ min，接種量8%，裝液量40mL/250mL，發(fā)酵時間36h。管碟法具體如下將37°C恒溫培養(yǎng)2d的白色念珠菌斜面，用30mL無菌生理鹽水洗下制成菌懸液，取2mL至IOOmL于50°C的沙氏固體培養(yǎng)基中，混合均勻后吸取20mL至直 徑9cm的培養(yǎng)皿中，冷卻后放置牛津杯于培養(yǎng)基表面，取150 μ L待測液加入牛津杯中，37°C 培養(yǎng)18h，測量透明抑菌圈直徑。設(shè)置發(fā)酵培養(yǎng)參數(shù)如下溫度28°C，pH 6. 5，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，接種量8%，裝液 量4(^17250!^，發(fā)酵時間36h，發(fā)酵3個批次，得到發(fā)酵液抗白色念珠菌的效價分別為第一批發(fā)酵效價為7060U/mL ；第二批發(fā)酵效價為7250U/mL ；第三批發(fā)酵效價為 7120U/mL，抗白色念珠菌的效價平均值為7143U/mL?？咕镔|(zhì)的分離純化及分析將第一批發(fā)酵液5000r/min離心15min ；清液用IN的HCl調(diào)pH3. 0，然后用等體 積乙酸乙酯萃取3次；乙酸乙酯部分采用硅膠(Merck，USA)柱色譜(Φ2. 5X20cm)進(jìn)行分 離，乙酸乙酯/甲醇為流動相，采用階躍增加乙酸乙酯/甲醇(100 0,80 20,60 40， 40 60,20 80,0 100)體積比的方法洗脫；收集100 % (ν/ν)乙酸乙酯洗脫液，上 Sephadex LH20 (GE Healthcare Life Sciences)柱(Φ 2 X 97cm，流動相甲醇 / 氯仿(ν/ν =4 1))，流速為lcm/min，收集體積比(洗脫體積/總流動相)在0. 65 0. 8之間的部 位；洗脫液減壓蒸干，采用C18制備高效液相色譜(OSD，08X250cm,5um)進(jìn)行純化(流動 相甲醇/水(70 30，ν/ν)；流速1. 5mL/min, 254nm檢測)，得到抗真菌物質(zhì)。(2)抗真菌代謝物HPLC分析采用Agilent-IlOO (Agilent Technologies，USA)高效液相色譜分析。分析柱 Agilent ZORBAX SB-C18 柱(5 μ m，Φ4. 6讓X25(kim)；流動相A 甲醇；B 水；梯度洗脫(ν/ ν) :5 35% Α(0 30min)，35 45% A(30 60min)；流量lmL/min ；檢測波長254nm ； 柱溫25 °C，結(jié)果如圖3所示。(3) EI-MS 分析采用APEX III傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀(Bruker Daltonics,USA)進(jìn)行樣 品的電噴霧質(zhì)譜(ESI/MS)分析，條件為電離電壓32V ；噴霧電壓5kV ；樣品溫度320°C ；掃 描荷質(zhì)比(m/z)范圍150 600Da ；檢測方式正離子，分析結(jié)果如圖4所示。由圖譜分析可知，[M+NH4+] = 420，[M+Na+] = 425，說明化合物的分子量Mr = 402. 5。質(zhì)核比(m/z)為385的離子峰為其脫水產(chǎn)物。(4) NMR (1H 和 13C)分析采用unitINOVA 500型核磁共振儀(Varian，USA)進(jìn)行樣品氫譜(1H-NMR)和碳譜 (13C-NMR)的測定，條件振動頻率500MHz ；溶劑氘代氯仿；化學(xué)位移(δ )定標(biāo)試劑四甲 基硅烷，分析結(jié)果如圖5和圖6所示?；瘜W(xué)位移在166. 289處的峰表示該物質(zhì)含有內(nèi)環(huán)酯基(R1-COO-R2)，19. 901處表示 含有一個CH3, 20-40處表示含有6個CH2,120-140處含有雙鍵?？傆?4個碳原子，其中2 個季碳，16個CH，6個CH2,1個CH3。氫原子34個，含有3個0H。由此可知該物質(zhì)為一大環(huán) 內(nèi)酯類物質(zhì)，分子式為C24H34O5,結(jié)構(gòu)如下所示
權(quán)利要求
一種枯草芽孢桿菌，其特征在于命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ZJU007，保藏號為CGMCC No.4140。
2.權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)如式(1)所示化合物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種枯草芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用，該菌株命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)ZJU007，保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所的中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC No.4140，保藏時間2010年9月03日。本發(fā)明菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對白色念珠菌的抑制作用十分強(qiáng)烈，比目前常用的制霉菌素有更好的抑菌效果。該抗菌物質(zhì)不僅對白色念珠菌等酵母類真菌有強(qiáng)烈的抑菌效果，而且對黑曲霉等絲狀真菌也有很好的效果，同時對大腸桿菌等細(xì)菌也有較好的抑菌效果。
文檔編號C12N1/20GK101974465SQ201010521030
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月27日
發(fā)明者吳綿斌, 張書衍, 賀娟, 陳華 申請人:浙江大學(xué)